3.2.1. Vật liệu
Giống lúa ML213 tại tỉnh Phú Yên.
Mười dòng vi khuẩn do ThS. Văn Thị Phương Như, Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Đại Học Cần Thơ phân lập, lưu trữ và cung cấp.
Bảng 2. Tên khoa học của 10 dòng vi khuẩn
Ký hiệu Tên khoa học của vi khuẩn (tương đồng 99%)
ML1 Bacillus megaterium strain Y18-04 ML2 Bacillus megaterium strain IARI-K-86 ML3 Enterobacter sp. SoPG127
ML4 Pseudomonas sp. ZR3
ML5 Bacillus megaterium strain ACCC11011 ML6 Enterobacter sp. A5C
ML7 Enterobacter cloacae strain GAQ39 ML8 Burkholderia kururiensis strain LUC24 ML9 Bacillus megaterium strain p19 ML10 Pantoea agglomerans strain BJCP3
24 3.2.2. Thiết bị Tủ cấy vi sinh vật (Pháp) Tủ sấy EHRET (Đức) Tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức) Tủ lạnh trữ mẫu Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức) Cân điện tử Sartorius (Đức)
pH kế Orion 420A (Mỹ) Máy chụp hình Sony
25
Hình 10. Cân điện tử Hình 11. Máy lắc mẫu
26 3.2.3. Dụng cụ Bình tam giác (250 ml, 500 ml) Ống nghiệm, ống đong Micropipette (1 – 100 µl, 100 – 1000 µl, 5000 µl) Kẹp gấp và một số dụng cụ khác… Hình 13. Micropipette
27
3.2.4. Hóa chất
a) Khử trùng mẫu
Cồn 70%, hypochloride 1%, hydrogen peroxide 3%, nước cất vô trùng.
b) Môi trường nhân mật số vi khuẩn
Bảng 3. Công thức môi trường Nfb (Nguồn: Kirchhof và ctv, 1997)
Hóa chất Hàm lượng (g/l) Acid malic 5 K2HPO4 0,5 MgSO4.7H2O 0,2 NaCl 0,1 CaCl2 0,02 KOH 4,5 Dung dịch vi lượng(1) 2ml Dung dịch vitamine(2) 1ml Dung dịch FeEDTA 1.64% 4ml
Bromthymol blue 0.5% trong KOH 0.2N 2ml
Agar 18 g/l cho môi trường đặc
Hoặc 1,8 g/l cho môi trường bán đặc
pH 6,8
(1)
Dung dịch Na2MoO4.2H2O: 1g; MnSO4.H2O: 1,5g; H2BO3: 1,4g; CuSO4: 0,4g; ZnSO4.7H2O: 0,12g; Thêm nước cất cho đủ 1000ml
(2)
Dung dịch vitamine: Biotin: 10mg; Pyridoxyl-HCl: 20mg; thêm nước cất cho đủ 100ml
28
c) Môi trường trồng lúa
Bảng 4. Môi trường dinh dưỡngYoshida (IRRI, 1976)
Hóa chất Lượng cần (g/4l) Lượng stock cần cho 1 lít môi trường (ml/l) NH4NO3 365,6 1,25 NaH2PO4.2H2O 142,4 1,25 K2SO4 285,6 1,25 CaCl2. 2H2O 469,4 1,25 Đa lượng MgSO4.7H2O 1.296,0 1,25 MnCl2.4H2O 6,0 1,25 (NH4)6Mo7O24.2H2O 0,296 1,25 ZnSO4.7H2O 0,140 1,25 H3BO3 3.736 1,25 CuSO4.5H2O 0,124 1,25 FeCl3.6 H2O 30,800 1,25 Vi lượng:
Hòa tan lần lượt từng chất với 2 lít nước cất, thêm 200ml H2SO4 cuối cùng lên thể tích đủ 4 lít
C6H8O7. H2O 47,6 1,25
29
3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Chuẩn bị mẫu 3.3.1. Chuẩn bị mẫu
Xử lý hạt giống
Hạt lúa được xử lý bằng cồn 70% trong 3 phút, hypochloride 1% trong 3 phút, hydrogen peroxide 3% trong 3 phút và rửa lại với nước cất vô trùng 4 lần để tẩy rửa các loại hóa chất còn thừa. Sau đó, hạt lúa được ủ nảy mầm trên môi trường agar bán lỏng (0,8% agar) trong 48 giờ.
Nhân mật số vi khuẩn
Bình tam giác chứa 40 ml môi trường Nfb lỏng được khử trùng nhiệt ướt (121 atm, 20 phút), để nguội. Cấy vi khuẩn vào bình môi trường bằng kim cấy (các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng). Dịch vi khuẩn được nuôi cấy trong điều kiện lắc 120 vòng/phút, nhiệt độ 300C, thời gian 48 giờ. Kiểm tra mật số vi khuẩn đạt 109 tế bào/1ml bằng phương pháp đếm sống.
Chủng vi khuẩn vào lúa
Hạt lúa nảy mầm (rễ mầm khoảng 1 cm) được chủng vi khuẩn (109 tế bào/ml) trong 3 giờ (hạt lúa giống ở các nghiệm thức đối chứng dương và đối chứng âm không chủng vi khuẩn).
30
3.3.2. Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan của 10 dòng vi khuẩn nội sinh với giống lúa ML213 dòng vi khuẩn nội sinh với giống lúa ML213
Thí nghiệm gồm 12 nghiệm thức đạm, 12 nghiệm thức lân (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi chai chứa 200 ml dung dịch khoáng và cấy 5 hạt lúa nảy mầm vào dung dịch khoáng). Sau đó, dùng giấy bọc kín bình môi trường, không cho ánh sáng xuyên qua môi trường trồng lúa.
Bảng 5. Các nghiệm thức đạm Nghiệm thức N ĐC- Không VK + 0%N ĐC+ Không VK + 100%N NT1 VK ML1 + 0%N NT2 VK ML2 + 0%N NT3 VK ML3 + 0%N NT4 VK ML4 + 0%N NT5 VK ML5 + 0%N NT6 VK ML6 + 0%N NT7 VK ML 7 + 0%N NT8 VK ML8 + 0%N NT9 VK ML9 + 0%N NT10 VK ML10 + 0%N
Nhân tố trong thí nghiệm khảo sát khả năng cố định đạm của vi khuẩn lên giống lúa ML213 trong môi trường Yoshida là đạm (NH4+) ở mức 0 % (đối với đối chứng âm và 10 nghiệm thức có chủng vi khuẩn) và 100% (đối chứng dương).
31 Bảng 6. Các nghiệm thức lân Nghiệm thức P ĐC- Không VK + 100% Ca3(PO4)2 ĐC+ Không VK + 100% H2PO4- NT1 VK ML1 + 100% Ca3(PO4)2 NT2 VK ML2 + 100% Ca3(PO4)2 NT3 VK ML3 + 100% Ca3(PO4)2 NT4 VK ML4 + 100% Ca3(PO4)2 NT5 VK ML5 + 100% Ca3(PO4)2 NT6 VK ML6 + 100% Ca3(PO4)2 NT7 VK ML 7 + 100% Ca3(PO4)2 NT8 VK ML8 + 100% Ca3(PO4)2 NT9 VK ML9 + 100% Ca3(PO4)2 NT10 VK ML10 + 100% Ca3(PO4)2
Nhân tố trong thí nghiệm khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn lên giống lúa ML213 trong môi trường Yoshida là lân khó tan (Ca3(PO4)2) ở mức 0% (đối chứng dương (thay bằng 100% H2PO4
-
)) và 100% (đối với đối chứng âm và 10 nghiệm thức có chủng vi khuẩn)
Tiến hành đo chiều cao cây, chiều dài rễ (ngày 7, ngày 14, ngày 21 và ngày 28), trọng lượng khô của rễ và trọng lượng khô toàn cây (ngày 28) để xác định ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn nội sinh lên chỉ tiêu sinh lý của cây lúa.
3.3.3. Chỉ tiêu theo dõi
Khảo sát các chỉ tiêu chiều cao cây, chiều dài rễ (ngày 7, ngày 14, ngày 21 và ngày 28), trọng lượng khô của rễ và trọng lượng khô toàn cây (ngày 28).
32
Chiều cao cây (cm): tính từ gốc thân đến chóp lá cao nhất của cây ở các
nghiệm thức trong các giai đoạn 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày và 28 ngày.
Chiều dài rễ (cm): Đo từ gốc rễ cho đến cuối chóp rễ dài nhất.
Trọng lượng khô của rễ và toàn cây (g): Sấy khô ở nhiệt độ 600C trong 8
giờ rồi đem cân. Sau 1 giờ cân lại cho đến khi cân 2 lần liên tiếp trọng lượng không đổi.
3.3.4. Phương pháp thống kê, xử lý và phân tích số liệu
Số liệu thu được từ kết quả thí nghiệm được thống kê, phân tích bằng phần mềm Microsoft office Excel 2003 và phần mềm thống kê Minitab.
33
Chương 4
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hưởng của 10 dòng vi khuẩn lên chiều cao cây lúa ML213 trồng trong dung dịch khoáng
Bảng 7. Chiều cao cây lúa trồng trong dung dịch khoáng giai đoạn 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày và 28 ngày (cm)
7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày NT
N P N P N P N P
ĐC- 8,23d 8,17g 11,50i 13,20f 13,80h 15,80h 15,50e 16,33h
ĐC+ 12,77a 12,83bc 17,97a 18,47b 20,33a 21,00abc 20,53a 21,33d
NT1 12,87a 13,67a 17,27b 18,80b 17,80c 18,90def 18,57b 23,33a
NT2 12,73a 12,57c 16,73c 17,83c 16,87d 20,27bcd 18,83b 23,23a
NT3 11,53b 11,53de 16,37d 18,57b 16,57d 19,67cde 16,77c 22,63b
NT4 10,77c 11,60d 14,77f 18,47b 16,93d 21,80a 18,40b 23,00ab
NT5 8,53d 13,67a 14,10g 20,47a 15,40ef 21,67ab 16,67c 23,47a
NT6 8,53d 10,27f 13,47h 17,33d 14,40g 17,57fg 16,10d 19,17f
NT7 10,66c 10,27f 16,13d 17,10d 17,97c 18,50ef 18,43b 19,73e
NT8 12,43a 10,43f 18,00a 12,57g 20,23a 16,57gh 20,33a 18,17g
NT9 8,47d 13,10b 14,73f 16,07e 14,93f 20,63abc 16,00d 21,93c
NT10 10,83c 11,10e 15,50e 13,20f 15,67e 16,30gh 16,10d 18,33f
CV (%) 2,58 2,13 1,34 1,29 1,17 4,41 1,55 1,45
34
Kết quả chiều cao cây lúa ở bảng 7 cho thấy giai đoạn 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày, 28 ngày sau chủng, 10 nghiệm thức (NT1, NT2, NT3, NT4, NT5, NT6, NT7, NT8, NT9 và NT10) chủng lần lượt 10 dòng vi khuẩn (ML1, ML2, ML3, ML4, ML5, ML6, ML7, ML8, ML9, ML10) trong môi trường không có đạm hóa học (0%N) hoặc môi trường bổ sung lân khó tan (100% Ca3(PO4)2) hầu như có chiều cao thân lúa cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng âm đạm (không chủng vi khuẩn và 0%N) và đối chứng âm lân (không chủng vi khuẩn và 100% Ca3(PO4)2). Qua đó có thể thấy 10 dòng vi khuẩn (ML1, ML2, ML3, ML4, ML5, ML6, ML7, ML8, ML9 và ML10) có khả năng cố định đạm và hòa tan lân khó tan thành lân dễ tan cung cấp dinh dưỡng cho cây lúa sinh trưởng và phát triển.
Giai đoạn 7 ngày, 3 nghiệm thức NT5, NT6, NT9 (chủng vi khuẩn ML5, ML6, ML9 và 0%N) có chiều cao cây khác biệt không ý nghĩa với đối chứng âm (không chủng vi khuẩn và 0%N). Điều này có thể do 3 dòng ML5, ML6, ML9 chưa thích ứng với môi trường không có đạm hóa học, khả năng cố định đạm chậm. Ngoài ra, 3 dòng vi khuẩn ML1, ML2, ML8 (chủng lần lượt trong NT1, NT2, NT8 ở môi trường vô đạm) có hiệu quả cố định đạm đến chiều cao cây lúa sớm và cao nhất, 4 dòng ML1, ML2, ML5, ML9 có hiệu quả hòa tan lân đến chiều cao cây lúa sớm và nổi bật nhất. Trong môi trường không có đạm hóa học hoặc bổ sung lân khó tan, dòng ML1 đều có chiều cao thân cao hơn và khác biệt có ý nghĩa với đối chứng dương.
Như vậy, trong điều kiện không có đạm hóa học, dòng vi khuẩn ML8 là dòng có khả năng cố định đạm sớm và hữu hiệu nhất lên chiều cao cây lúa suốt từ giai đoạn 7 ngày đến 28 ngày sau chủng (gấp 1,3 lần so với đối chứng âm ở giai đoạn 28 ngày). Trong điều kiện môi trường bổ sung lân khó tan (và cung cấp đủ đạm), dòng vi khuẩn ML8 chưa phát huy được khả năng cố định đạm cũng như khả năng hòa tan lân chậm và chưa thật sự hiệu quả để cung cấp dinh dưỡng cho cây lúa phát triển. Trong khi đó, dòng vi khuẩn ML5 thì hiệu quả cố định đạm thấp nhưng khả năng hòa tan lân sớm và hiệu quả cao trong suốt giai đoạn 7
35
ngày, 14 ngày, 21 ngày và 28 ngày sau chủng. Dòng ML1 có khả năng hòa tan lân và cố định đạm khá sớm (ngày 7) nhưng tốc độ cố định đạm, hòa tan lân chậm dần từ giai đoạn ngày 14 đến ngày 21, và tăng trở lại ở giai đoạn 28 ngày.
Kết quả chiều cao cây lúa ở bảng 7 phù hợp với kết quả nghiên cứu về vai trò của đạm đối với chiều cao cây lúa của tác giả Nguyễn Ngọc Đệ (2008), đồng thời tương tự kết quả thí nghiệm khả năng hòa tan lân của vi khuẩn nội sinh trên lúa mì của Kapulnik et al., (1981,1983).
Hình 15. Hiệu quả hòa tan lân khó tan của vi khuẩn lên chiều cao thân lúa giai đoạn 14 ngày
Chú thích: Từ trái sang: NT1 (chủng vi khuẩn ML1 và bổ sung 100% PO4 3-
, ĐC-: không chủng vi khuẩn và bổ sung 100% Ca3(PO4)2).
36
4.2. Ảnh hưởng của 10 dòng vi khuẩn lên chiều dài rễ cây lúa ML213 trồng trong dung dịch khoáng
Bảng 8. Chiều dài rễ của cây lúa trồng trong dung dịch khoáng giai đoạn 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày và 28 ngày (cm). 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày NT
N P N P N P N P
ĐC- 5,43h 5,30g 6,60e 6,57g 7,37f 7,37g 8,00f 8,23h
ĐC+ 9,53fg 9,03de 12,63cd 12,37cd 13,80cd 13,80c 14,20d 14,13f
NT1 12,07bcd 10,50a 13,03bcd 14,47a 13,77d 16,50a 15,97b 17,47a
NT2 12,47abc 10,13ab 12,43d 14,27ab 13,73d 15,43b 14,07d 15,87b
NT3 11,83cd 10,03ab 13,27bc 12,20de 14,47b 13,00f 15,53c 14,50cde
NT4 10,50e 8,97de 12,40d 11,37f 13,23e 13,10ef 14,06d 14,23ef
NT5 12,70ab 10,20ab 13,57b 13,97b 15,77a 15,37b 16,17ab 16,00b
NT6 9,37g 9,40cd 12,47d 11,90e 13,80cd 13,37de 14,10d 14,53cd
NT7 10,13ef 9,77bc 12,80cd 11,90e 13,90cd 13,27def 14,30d 14,60c
NT8 12,80a 8,60ef 15,40a 12,33cd 15,97a 13,50d 16,50a 13,77g
NT9 11,53d 8,67ef 13,00bcd 12,40cd 13,90cd 14,07c 13,33e 14,27d
NT10 9,53fg 8,27f 12,80cd 12,60c 14,23bc 13,30de 15,23c 14,30def
CV (%) 3,60 3,89 3,00 1,93 1,93 1,31 1,71 1,21
37
Bảng 8 cho thấy giai đoạn 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày và giai đoạn 28 ngày sau chủng, chiều dài rễ lúa ở 10 nghiệm thức (NT1, NT2, NT3, NT4, NT5, NT6, NT7, NT8, NT9 , NT10) có chủng lần lượt 10 dòng vi khuẩn (ML1, ML2, ML3, ML4, ML5, ML6, ML7, ML8, ML9, ML10) trong môi trường không có đạm hóa học (0%N) hoặc môi trường bổ sung lân khó tan (100% Ca3(PO4)2) đều có chiều dài rễ lúa cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng âm đạm (không chủng vi khuẩn và 0%N) và đối chứng âm lân (không chủng vi khuẩn và 100% Ca3(PO4)2). Điều này cho thấy, các dòng này đều có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, đồng thời có thể tiết ra chất kích thích sinh trưởng như auxin thúc đẩy sự tăng dài rễ.
Giai đoạn 7 ngày sau chủng, 7 nghiệm thức (NT1, NT2, NT3, NT4, NT5, NT8 và NT9) chủng lần lượt 7 dòng vi khuẩn (ML1, ML2, ML3, ML4, ML5, ML8, ML9 và 0%N) có kết quả chiều dài rễ lúa cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng dương. Ngoài ra, trong điều kiện bổ sung lân khó tan, 5 nghiệm thức (NT1, NT2, NT3, NT5 và NT7) chủng lần lượt 5 dòng vi khuẩn (ML1, ML2, ML3, ML5, ML7) có chiều dài rễ lúa cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng dương. Qua đó có thể thấy, dòng ML8 phát huy khả năng cố định đạm tốt nhất trong môi trường không có đạm hóa học và thúc đẩy sự tăng dài rễ lúa sớm nhất (gấp 1,34 lần so với đối chứng dương và gấp 2,3 lần so với đối chứng âm (không chủng vi khuẩn và 0%N)) nhưng hoạt động yếu trong môi trường bổ sung lân khó tan. Dòng ML1, ML2, ML5 là 3 dòng có ảnh hưởng tích cực đến sự tăng dài rễ trong môi trường không có đạm hóa học hoặc bổ sung lân khó tan.
Giai đoạn 14 ngày sau chủng, 2 nghiệm thức NT5 và NT8 (chủng 2 dòng vi khuẩn ML5, ML8 và 0%N) có kết quả chiều dài rễ lúa cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng dương (không chủng vi khuẩn và 100%N). Như vậy, khả năng cố định đạm của dòng ML5 và ML8 vẫn duy trì khá cao. Ngoài ra, 3 nghiệm thức (NT1, NT2 và NT5) chủng lần lượt 3 dòng vi khuẩn hòa tan lân (ML1, ML2, ML5 và bổ sung 100% Ca3(PO4)2) có chiều dài rễ lúa cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng dương.
38
Giai đoạn 21 ngày sau chủng, 3 nghiệm thức NT3, NT5 và NT8 chủng lần lượt 3 dòng vi khuẩn (ML3, ML5, ML8 và 0%N) có kết quả chiều dài rễ lúa cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng dương. Trong môi trường bổ sung lân khó tan, 3 nghiệm thức (NT1, NT2 và NT5) chủng lần lượt 3 dòng vi khuẩn (ML1, ML2, ML5) có chiều dài rễ lúa cao hơn ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng dương. Qua đó có thể thấy, giai đoạn 7 ngày đến 21 ngày, dòng ML5 là dòng có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan hữu hiệu nhất, thúc đẩy chiều dài rễ tăng dài trong cả môi trường không có đạm hóa học hoặc môi trường bổ sung lân khó tan.
Giai đoạn 28 ngày sau chủng, 5 nghiệm thức (NT1, NT5, NT8) chủng lần lượt 5 dòng vi khuẩn (ML1, ML5, ML8 và 0%N) có kết quả chiều dài rễ lúa cao nhất và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng dương. Chiều dài rễ lúa ở NT8 (chủng vi khuẩn ML8 và bổ sung 0%N) cao gấp 2,1 lần đối chứng âm (không chủng vi khuẩn và 0%N). Trong môi trường bổ sung lân khó tan, 3 nghiệm thức (NT1, NT2, NT5) chủng lần lượt 3 dòng vi khuẩn (ML1, ML2, ML5) có chiều dài rễ lúa cao nhất và khác biệt có ý nghĩa với nghiệm thức đối chứng dương.
Nhìn chung, từ giai đoạn cây lúa 7 ngày đến 28 ngày, trong môi trường không có đạm hóa học, 3 nghiệm thức NT1, NT5 và NT8 (chủng 3 dòng vi khuẩn ML1, ML5, ML8) có chiều dài rễ lúa cao hơn và khác biệt có ý nghĩa với đối chứng dương, trong đó, dòng vi khuẩn ML8 là dòng có khả năng cố định đạm, tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng (như auxin) sớm và hiệu quả thúc đẩy tăng dài rễ nhanh nhất. Trong môi trường có lân khó tan thì 3 dòng ML1, ML2, ML5 (chủng vào nghiệm thức NT1, NT2, NT5) là 3 dòng có chiều dài rễ nổi bật