KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY YẾM KHÍ CHLORPYRIFOS ETHYL CỦA CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN TRÊN ĐẤT CANH TÁC CHUYÊN CANH LÚA TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY YẾM KHÍ CHLORPYRIFOS ETHYL CỦA CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN TRÊN ĐẤT CANH TÁC CHUYÊN CANH LÚA TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Mã số: TNCS2014-14 Chủ nhiệm đề tài: NCS Trương Quốc Tất Cần Thơ , Tháng 12 năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY YẾM KHÍ CHLORPYRIFOS ETHYL CỦA CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN TRÊN ĐẤT CANH TÁC CHUYÊN CANH LÚA TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Mã số: TNCS2014-14 Xác nhận trường Đại học Cần Thơ (ký, họ tên, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài TRƯƠNG QUỐC TẤT Cần Thơ, Tháng 12 Năm 2014 MỤC LỤC Trang DANH SÁCH HÌNH Error: Reference source not found BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO .i DANH SÁCH BẢNG vi Phần I MỞ ĐẦU Chương LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .2 2.1 Tổng quan thuốc bảo vệ thực vật .2 Bảng 2.1 Phân loại độ độc thuốc BVTV Bảng 2.2 Phân chia nhóm độc theo WHO 2.1.2 Mối nguy hại sử dụng thuốc BVTV Hình 2.1 Vỏ chai thuốc BVTV bị vứt bừa bãi đồng ruộng 2.1.3 Một số đường chuyển hóa thuốc BVTV môi trường .6 Hình 2.2 Tác động thuốc BVTV đến mơi trường đường thuốc (Theo Richardson, 1979; dẫn theo Nguyễn Trần Oánh, 2007) 2.2 Tổng quan Chlorpyrifos ethyl 2.2.1 Tình hình sử dụng thuốc trừ sâu Chlorpyrifos ethyl giới .8 2.2.2 Tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl mơ hình canh tác 2.2.3 Tính chất Chlorpyrifos ethyl 10 Hình 2.3 Cơng thức cấu tạo Chlorpyrifos ethyl 10 Hình 2.4 Một số chế phẩm có chứa Chlorpyrifos ethyl sử dụng phổ biến Việt Nam .12 2.2.4 Sự phân hủy chuyển hóa Chlorpyrifos ethyl đất .13 Trong mơi trường đất, Chlorpyrifos ethyl phân hủy chuyển hóa theo nhiều đường khác hấp phụ vào đất, thẩm thấu xuống mạch nước ngầm, bốc vào khơng khí bị trồng hấp thu phân hủy VSV đất Dưới số đặc điểm thuốc chúng luân chuyển vào môi trường đất 13 Hình 2.5 Con đường chuyển hóa tổng quát Chlorpyrifos ethyl (Racke, 1993) .17 2.3 Sự phân hủy yếm khí độc chất hữu bởi vi khuẩn .18 Hình 2.6 Quá trình cho nhận điện tử khử chlor Dioxins (Châu Thị Anh Thy, 2012) 18 2.4 Tổng quan một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng thí nghiệm 21 2.4.1 Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR-Polymerase Chain Reaction) 21 Hình 2.7 Thiết bị PCR 21 2.4.2 Phương pháp điện di biến tính tăng cấp DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 22 Chương 25 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 3.1 Phương tiện 25 3.1.1 Thời gian địa điểm thí nghiệm 25 i Mợt số đặc tính lý hóa đất khu vực thu mẫu 25 Bảng 3.1 Mợt số đặc tính lý hóa loại đất sử dụng thí nghiệm 26 3.1.2 Thiết bị thí nghiệm 26 3.1.3 Hóa chất dùng thí nghiệm 26 3.2 Phương pháp 27 3.2.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl .27 Bổ sung thêm thuốc sau 330 ngày ủ: Sau 330 ngày, lọ ủ bổ sung thêm thuốc để làm giàu mật số vi khuẩn Nồng độ thuốc bổ sung vào tương đương với nồng độ thuốc ban đầu 34 ppm Trước thêm thuốc cần thêm lượng dung dịch yếm khí để đưa lọ ủ thể tích ban đầu (40mL) Để thêm thuốc, dùng bơm tiêm y tế mL tiêm mL Chlorpyrifos ethyl nồng độ 1.400 ppm vào cho NT1, NT4 NT5, không bổ sung thuốc cho nghiệm thức đối chứng sống (NT2, NT3) 29 Hình 3.2 Trích làm dịch trích cột Alumina 30 Hình 3.3 Trích DNA Kit PowerSoil(R) DNA Isolation .31 3.2.3 Phương pháp thống kê xử lí số liệu 33 Phần 34 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .34 4.1 Khảo sát khả phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn đất 34 4.1.1 Kết đánh giá so sánh khả phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn dung dịch khoáng tối thiểu 34 Hình 4.1 Khả phân hủy Chlopyrifos ethyl hệ vi khuẩn CL01 (a) CL02 (b) 34 Hình 4.2 So sánh tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl ngày nghiệm thức hệ vi khuẩn CL01 (a) CL02 (b) thời điểm 330-350 ngày 36 Hình 4.3 Khả phân hủy Chlopyrifos ethyl hệ vi khuẩn PH01 (a) PH02 (b) 37 Hình 4.4 So sánh tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl ngày nghiệm thức hệ vi khuẩn PH01 (a) PH02 (b) thời điểm 330-350 ngày 38 Hình 4.5 Tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl ngày nghiệm thức bổ sung acid hữu (a) không bổ sung acid hữu (b) giai đoạn 330-350 ngày 38 4.1.2 Khảo sát hình thành sản phẩm trung gian Chlorpyrifos ethyl 39 Hình 4.7 Sơ đồ chuyển hóa Chlorpyrifos ethyl nghiệm thức không bổ sung acid hữu 40 4.2 Đa dạng vi khuẩn yếm khí phân hủy Chlorpyrifos ethyl đất 41 Hình 4.8 Điện di đồ sản phẩm PCR nhóm vi khuẩn khử chlor Chloroflexi nghiệm thức mẫu đất PH01 với cặp mồi 338F/1101R Ghi chú: (M: thang chuẩn; Đối chứng- Bổ sung acid hữu cơ; 2:Bổ sung acid hữu cơ; 3:Đối chứng-Không bổ sung acid hữu cơ; 4: Không bổ sung acid hữu cơ; 5: Đối chứng sống- Bổ sung acid hữu cơ; 6: Bổ sung acid hữu cơ; 7: Đối chứng sống-Không bổ sung acid hữu cơ;8: Không bổ sung acid hữu cơ; 9: Bổ sung acid hữu cơ; 10: Negative) 42 Hình 4.9 Điện di đồ sản phẩm PCR nhóm vi khuẩn khử chlor Chloroflexi nghiệm thức mẫu đất PH01 với cặp mồi 341F-GC/534R Ghi chú: (M: thang chuẩn; đối chứng- Bổ sung acid hữu cơ; 2: Bổ sung acid hữu cơ; 3:đối chứng-Không bổ sung acid hữu cơ; 4: Không bổ sung acid hữu cơ; 5: đối chứng-Bổ sung acid hữu cơ; 6: Bổ sung acid hữu cơ; 7: đối chứng-Không bổ sung acid hữu cơ; 8: Bổ sung acid hữu cơ; 9: Bổ sung acid hữu cơ; 10: Possitive; 11: Negative 338F/1101R; 12: Negative 341F-GC/534R) 42 Hình 4.10 Điện di đồ sản phẩm PCR (DGGE) nghiệm thức mẫu đất PH01 43 Hình 4.11 Độ tương đồng vi khuẩn nhóm Chloroflexi mẫu đất PH01 44 5.1 Kết luận 45 ii 5.2 Kiến nghị 45 PHỤ LỤC THUYẾT MINH ĐỀ TÀI iii DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1 Vỏ chai thuốc BVTV bị vứt bừa bãi đồng ruộng Hình 2.2 Tác động thuốc BVTV đến môi trường đường thuốc Hình 2.3 Cơng thức cấu tạo Chlorpyrifos ethyl Error: Reference source not found0 Hình 2.4.Một số chế phẩm có chứa Chlorpyrifos ethyl sử dụng phổ biến Việt Nam Error: Reference source not found Hình 2.5 Con đường chuyển hóa tổng qt Chlorpyrifos ethyl Error: Reference source not found Hình 2.6 Quá trình cho nhận điện tử khử chlor Dioxins Error: Reference source not found Hình 2.7 Thiết bị PCR 20 Hình 3.1 Bố trí thí nghiệm yếm khí Error: Reference source not found Hình 3.2 Trích làm dịch trích cột Alumina 29 Hình 3.3 Trích DNA Kit PowerSoil(R) DNA Isolation 30 Hình 4.1 Khả phân hủy Chlopyrifos ethyl hệ vi khuẩn CL01 CL02 Error: Reference source not found Hình 4.2 So sánh tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl ngày nghiệm thức hệ vi khuẩn CL01 CL02 thời điểm 330-350 ngàyError: Reference source not found Hình 4.3 Khả phân hủy Chlopyrifos ethyl hệ vi khuẩn PH01 PH02 Error: Reference source not found Hình 4.4 So sánh tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl ngày nghiệm thức hệ vi khuẩn PH01 PH02 thời điểm 330-350 ngày37 Hình 4.5 Tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl ngày nghiệm thức bổ sung acid hữu không bổ sung acid hữu giai đoạn 330-350 ngày 37 Hình 4.6 Sơ đồ chuyển hóa Chlorpyrifos ethyl nghiệm thức bổ sung acid hữu 38 iv Hình 4.7 Sơ đồ chuyển hóa Chlorpyrifos ethyl nghiệm thức khơng bổ sung acid hữu 39 Hình 4.8 Điện di đồ sản phẩm PCR nhóm vi khuẩn khử chlor Chloroflexi nghiệm thức mẫu đất PH01 với cặp mồi 338F/1101R 41 Hình 4.9 Điện di đồ sản phẩm PCR nhóm vi khuẩn khử chlor Chloroflexi nghiệm thức mẫu đất PH01 với cặp mồi 341F-GC/534R 41 Hình 4.10 Điện di đồ sản phẩm PCR (DGGE) nghiệm thức mẫu đất PH01 42 Hình 4.11 Độ tương đồng vi khuẩn nhóm Chloroflexi mẫu đất PH01 43 v DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1 Phân loại độ độc thuốc BVTV Bảng 2.2 Phân chia nhóm độc theo WHO Bảng 3.1 Một số đặc tính lý hóa loại đất sử dụng thí nghiệm ………25 vi TỪ VIẾT TẮT Chữ tắt 2,4-D Từ gốc 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid AchE Bp BVTV Acetylcholinesterase Base pair Bảo vệ thực vật California Department of Pesticide CDPR CL ĐBSCL DCM DDT DGGE DNA GC/MS HP/LC LC50 Regulation’s Cai Lậy Đồng sông Cửu Long Dichloromethane Dichlodiphenyl trichloetan Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Deoxyribonucleic acid Gas Chromatography Mass Spectometry High Performance Liquid Chromatography Lethal concentrate LD50 Lethal Dose 50 LT50 PCR PH TCP TMP Lethal time Polymerase Chain Reaction Phụng Hiệp 3,5,6 - trichloro – 2-pyridinol 3,5,6- trichloro-2-methoxypiridyne VSV Vi sinh vật rRNA WHO Ribosomal ribonucleic acid World Health Organization vii THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thơng tin chung: - Tên đề tài: Khảo sát khả phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl cộng đồng vi khuẩn đất canh tác chuyên canh lúa Đồng sông Cửu Long - Mã số: TNCS2014-14 - Chủ nhiệm: NCS Trương Quốc Tất - Cơ quan: Nghiên cứu sinh ngành Khoa học đất- Bộ môn Khoa học đất- Khoa Nông nghiệp sinh học ứng dụng- Trường Đại học Cần Thơ - Thời gian thực hiện: 12 tháng (từ tháng 01 đến tháng 12 năm 2014) Mục tiêu:  Đánh giá khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl (lên men khử) cộng đồng vi khuẩn yếm khí đất chuyên canh lúa ĐBSCL  Xác định độ đa dạng cấu trúc cộng đồng vi khuẩn yếm khí phân hủy Chlorpyrifos ethyl đất chuyên canh lúa Tính sáng tạo: Đi đầu nghiên cứu phân hủy yếm khí Chlorpyrifos ethyl cộng đồng vi khuẩn đất chuyên canh lúa ĐBSCL Kết nghiên cứu: Thí nghiệm bố trí microcosms chứa 30 mL dung dịch khống tối thiểu, 10 g mẫu đất Chlopyrifos ethyl (35ppm) 450 ngày điều kiện yếm khí Kết cho thấy tất nghiệm thức bốn cộng đồng vi khuẩn ký hiệu CL01, CL02, PH01 PH02 có khả phân hủy tốt Chlorpyrifos ethyl Sau 60 ngày ủ, hàm lượng Chlorpyrifos ethyl lại nghiệm thức dao động từ 3-82% so với hàm lượng thuốc ban đầu Sau bổ sung Chlorpyrifos ethyl thời điểm 330 ngày, tốc độ phân hủy thuốc gia tăng Hàm lượng thuốc lại sau 350 ngày nghiệm thức biến động từ 4-68% so với hàm lượng thuốc ban đầu Khi so sánh tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 20 ngày sau bổ sung thuốc cho thấy tốc độ phân hủy thuốc nghiệm thức bổ sung không bổ sung acid hữu khác biệt ý nghĩa thống kê Mặt khác, cộng đồng vi khuẩn ký hiệu PH02 có tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl cao cộng đồng viii 28 Havens, P.L., S Kieatiwong and K.Shepler, 1992 The Photochemical Degradation of Chlorpyrifos on Soil by Natural Sunlight PTRL Project No 254W 29 Hill, R.H.J., S.L Head, S.Baker, M.Gregg, D.B Shealy, S.L Bailey, C.C Williams, E.J Sampson, L.L Needham, 1995 Pesticide residues in urine of adults living in the United States: reference range concentrations Environ Res, 71(2):99–108 30 Ghanem, M Orfi and M Shamma, 2007 Biodegration of Chlorpyrifos by Kepsiella sp Isolated an active sluge sample of waste water Treatment plant in Damascus Folia Microbiol, 52(4), 423-427 31 Irani Mukherjee and madhuban Gopal, 1996 Degradation of chlorpyrifos by two soil fungi Aspergillus niger and trichoderma viride Toxicological & Environmental Chemistry, 57(1), p145 32 Jagnow, G., K Haider, P.C.Ellwardt, 1977 Anaerobic dechlorination and degradation of hexachlorocyclohexane isomers by anaerobic and facultative anaerobic bacteria Archives of microbiology, 115 (3), pp 285-292 33 Kanazawa, J., 1989 Relationship between the soil sorption constants for pesticides and their physi- cochemical properties Environ Toxicol Chem, 8(6):477–484 34 Kulshrestha, G and A.Kumari, 2011 Fungal degradation of chlorpyrifos by Acremonium sp strain (GFRC-1) isolated from a laboratory-enriched red agricultural soil Biology and Fertility of Soils, 47(2), pp 219-225 35 Laabs,V., W.Amelung, 2005 Sorption and aging of corn and soybean pesticides in tropical soils of Brazil J Agric Food Chem, 53(18):7184–7192 36 Muyzer, G., E.C Dewaal and A.G Uiterlinden, 1993 Profiling of complex microbial-populations by Denaturing Gradient Gel-Electrophoresis of Polymerase Chain reaction-Ampli fied genes-coding for 16S ribosomalRNA Application Environment Microbiology59, 695-700 49 37 Myers, R.M., S.G Fisher S.G, L.S lemon and T.Maniatis, 1985 Nearly all single base substitutions in DNA fragments joned to GC-clamp can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis Nucl Acids Res, 13: 3131-3145 38 NRA, 2000 The NRA review of Chlorpyrifos NRA, Australia 80 pp 39 Osman, T and C.Temur, 2010 The Fate of Pesticide in the Environment J Biol Environ, 4(10) 29-38 40 Racke, KD., 1993 Enviromental fate of Chlorpyrifos Rev Envition contain toxicol, 131: 1-151 41 Ranjan, K B and A.Malik, 2008 Utilization of Chlorpyrifos as a sole source of cacbon by bacteria isolated from wastewater Irrigated Agriculture Soil in an Industrial Area of Western Uttar Pradesh, India Reseach Journal of Microbiology3, 293-307 42 Savadogo, P.W., A.S.Ouattara, M.P.Sedogo, S traoré, 2007 Anaerobic biodegradation of Sumithion an organophosphorus insecticide used in Burkina Faso Agriculture by Acclimatized Indigenous Bacteria.Pakistan Journal of Biological Sciences, 10(11): 1896-905 43 Singh, B.K., A.Walker, J.A.W.Morgan and D.J Wright, 2004 Biodegradation of chlorpyrifos by Enterobacter strain B-14 and its use in bioremediation of contaminated Soils Applied and Environmental Microbiology, 70: 48554863 44 Spieszalski WW, Niemczyk HD, Shetlar DJ (1994) Sorption of chlorpyrifos and fonofos on four soils and turfgrass thatch using membrane filters J Environ Sci Health, 29(6):1117–1136 45 Tagatz, M.E., N.R Gregory and G.R Plaia 1982 Effects of chlorpyrifos on field- and laboratory-devel- oped estuarine benthic communities J Toxicol Environ Health, 10:411–421 50 46 Tuli, A., 2013 Use information and air monitoring recommendation for chlorpyrifos in California Enviromental hazard assessment program California 23 pp 47 Xiao, Y., 1997 Dissipation and Leachability of Formulated Chlorpyrifos and Atrazine in Organically- amended Soils Doctor thesis of Philosophy in Entomology The Virginia Polytechnic 106 pp 48 Yang, L.,Y.Zhao,B Zhan, C.H Yang and X Zhang, 2005 Isolation and characterization of a chlorpyrifos and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol degrading bacterium Journal Microbiology, 251 (1): 67-73 49 Zhang, W., F Jiang and J.F Ou, 2011 Global pesticide consumption and population: with China as focus Article of International Academy of Ecology and Enviromental Sciences, 1(2): 125-144 51 PHỤ LỤC I CÁC PHƯƠNG TIỆN VÀ QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM Phụ lục 1: Danh sách địa điểm thu mẫu STT Tên nông dân Địa điểm Ký hiệu Trần Văn Dẫn Mỹ Thành Nam – Cai Lậy CL01 Lê Văn Đồ Long Khánh- Cai Lậy CL02 Huỳnh Văn Tây Hòa An – Phụng Hiệp PH01 Trần Phước Huệ Hòa An – Phụng Hiệp PH02 Phụ lục 2: Mơi trường khống đa lượng Hóa chất g/L KH2PO4 1,77 NaCl 0.3 NH4Cl 0.3 CaCl2.2H2O 0,11 MgCl2.2H2O 0,1 Ghi Làm dung dịch cách sục khí N2 40 phút NaHCO3 0,8 Sau dùng hỗn hợp (70% N2, 30% CO2) sục lại phút, sục cho NaHCO3 vào Sau sục đậy lọ nút cao su mang tiệt trùng ướt Tiếp theo pha dung dịch vi lượng Phụ lục 3: Mơi trường khống vi lượng Muối vi lượng 1/L g/L MnCl2.2H2O 0,05 H3PO4 0,05 ZnCl2 0,05 CoCl2.6H2O 0,05 NiCl2.6H2O 0,05 CuCl.2H2O 0,03 FeCl2.4H2O i (NH4)6Mo7O24.4H2O 0,05 ALCl3 0,05 EDTA 0,5 HCl đậm đặc 1mL Dung dịch phải tiệt trùng ướt sục khí Argon Kế đến pha dung dịch vitamin Phụ lục 4: Dung dịch vitamin Vitamin/L D-biotin g/L 0,02 Folic acid 0,02 Pyrodoxin hydrochloride 0,1 Thiamin hydrochloride 0,05 Riboflavin 0,05 Nicotinic acid 0,05 DL- calcium pantothenate 0,05 Vitamin B12 0,01 p- aminobenzoic acid 0,05 Lipoic acid ( thiotic acid) 0,05 1,4- napthaquinone 0,04 Nicotiamide 0,1 Hemin 0,01 Dung dịch vitamin phải khử trùng ước sục khí Argon Hỗn hợp acid hữu gồm hóa chất sau: pyruvic acid (hoặc pyruvate) + acetic (hoặc acetate) + butyric (hoặc butyrate) + lactic ( propiovate) 250µM chất Đem khử trùng màng lọc sục khí Argon Pha môi trương yếm khí với thể tích 1L: 1L mơ trường khống đa lượng + mL mơi trường khoáng vi lượng + 0,1 mL hỗn hợp vitamin + mL hỗn hợp electron donner ii Phụ lục 5: Quy trình điện di biến tính tăng cấp (DGGE) Chất nhuộm 6X (10ml) • 1.5ml bromophenol blue 2% • 1.5ml xylene cyanol 2% • 3ml glycerol 100% • 4ml dH2O Chất nhuộm 2X (10ml) • 0.25ml bromophenol blue 2% • 0.25ml xylene cyanol 2% • 7ml glycerol 100% • 2.5ml dH2O Pha 50X tris base Aceate (TAE) buffer: • 242 g Tris base (hydroxymethyl aminomethane) + 800ml dH2O • thêm 57.1 ml glacial acetic acid • thêm 100ml EDTA pH 8.0 • thêm dH2O để đạt thể tích 1000ml Pha EDTA (pH 8.0) • Dissolve either: 146.1 g EDTA (pH 8.0) 186.1g Na2EDTA.2H2O • thêm 20g NaOH pellet • lên thể tích 1000ml Dung dịch biến tính (100% DS) 42g urea 40ml Formamide 40% PAGE 10% fresh ASP (ammonium persulfate) TEMED DW iii Butanol Chuẩn bị nồng độ gel 8% ống nhựa thí nghiệm theo bảng sau: 40% 60% Stacking 100% DS 4,80 7,20 0,00 0,00 DW 4,56 2,16 3,32 8,30 40% PAGE 2,40 2,40 0,60 1,50 50 x TAE 0,24 0,24 0,08 0,20 Sum 12,00 12,00 4,00 10,00 Thêm 100 μL APS 10% cho hai ống 60% 40% Thêm μL TEMED vào ống 60%, trộn cho vào ống tiêm Thêm μL TEMED vào ống 40%, trộn cho vào ống tiêm Đổ gel vào Cho mL butanol lên bề mặt trơn láng Để yên nhiệt độ phòng 2h Khởi động làm nóng máy chạy DGGE khoảng 1h nhiệt độ 600C Sau tạo dung dịch stacking khoảng 2h từ bắt đầu khởi động máy 10 Thêm 33 μL APS 10% μL TEMED vào mL hỗn hợp stacking 11 Trộn đều, đổ Lên bề mặt gel, để nhiệt độ phòng 30 phút 12 Lấy mẫu thử: 20 μL 2x thuốc nhuộm + 20 μL sản phẩm chạy PCR 13 Mẫu điện di dung dịch đệm TAE 1X 60oC 16h với hiệu điện 45V iv PHỤ LỤC II BẢNG PHÂN TÍCH PHƯƠNG SAI CỦA CÁC SỐ LIỆU THỐNG KÊ Bảng Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 60 ngày ủ hệ vi khuẩn PH01 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Nghiệm thức 1371,2 685,6 Sai số 81,7 13,6 Tổng cộng 1452,9 Giá trị F Giá trị P 50.35 0.000 Bảng Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 60 ngày ủ hệ vi khuẩn PH02 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương 288,2 Nghiệm thức 576,5 Sai số 159,6 Tổng cộng Giá trị F Giá trị P 10,84 0,010 26,6 736,1 Bảng Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 60 ngày ủ hệ vi khuẩn CL01 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương 130,4 Nghiệm thức 260,8 Sai số 214,0 Tổng cộng Giá trị F 3,66 Giá trị P 0,092 35,7 474,8 Bảng Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 60 ngày ủ hệ vi khuẩn CL02 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Nghiệm thức 1064,805 Sai số 4,303 Tổng cộng 1069,108 532,403 0,717 v Giá trị F 742,41 Giá trị P 0,000 Bảng Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 180 ngày ủ hệ vi khuẩn PH01 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Nghiệm thức 2326,329 Sai số 1,250 Tổng cộng 2327,579 1163,164 Giá trị F 4651,33 Giá trị P 0,000 0,250 Bảng Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 180 ngày ủ hệ vi khuẩn PH02 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Nghiệm thức 1541,5 Sai số 108,5 Tổng cộng 1650,0 770,7 Giá trị F 42,60 Giá trị P 0,000 18,1 Bảng Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 180 ngày ủ hệ vi khuẩn CL01 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương 315,19 Nghiệm thức 630.38 Sai số 6,05 Tổng cộng 636,43 1,01 vi Giá trị F 312,75 Giá trị P 0,000 Bảng Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 180 ngày ủ hệ vi khuẩn CL02 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Nghiệm thức 2093,79 Sai số 47,83 Tổng cộng 2141,61 1046,89 Giá trị F 131,34 Giá trị P 0,000 7,79 Bảng Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 300 ngày ủ hệ vi khuẩn PH01 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Nghiệm thức 1176,25 588,12 Sai số 19,18 3,20 Tổng cộng 1195,43 Giá trị F Giá trị P 183,96 0,000 Bảng 10 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 300 ngày ủ hệ vi khuẩn PH02 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Nghiệm thức 884,49 442,24 Sai số 17,11 2,85 Tổng cộng 901,60 Giá trị F Giá trị P 155,12 0,000 Bảng 10 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 300 ngày ủ hệ vi khuẩn CL01 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Nghiệm thức 358,13 179,07 Sai số 2,43 0,41 Tổng cộng 360,566 vii Giá trị F Giá trị P 111,92 0,000 Bảng 11 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 300 ngày ủ hệ vi khuẩn CL02 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Nghiệm thức 700,77 350,38 Sai số 0,195 0,05 Tổng cộng 700,96 Giá trị F Giá trị P 7162,87 0,000 Bảng 12 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 1, hệ vi khuẩn PH01 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Thời gian 47 24 Sai số 1663 277 Tổng cộng 1710 Giá trị F Giá trị P 0,09 0,919 Bảng 13 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 1, hệ vi khuẩn PH02 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Thời gian 476 238 Sai số 611 102 Tổng cộng 1087 Giá trị F Giá trị P 2,34 0,178 Bảng 14 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 1, hệ vi khuẩn CL01 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Thời gian 582,4 291,2 Sai số 519,1 86,5 Tổng cộng 1101,5 viii Giá trị F Giá trị P 3,37 0,105 Bảng 15 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 1, hệ vi khuẩn CL02 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Thời gian 7838 3919 Sai số 938 156 Tổng cộng 8775 Giá trị F Giá trị P 15,08 0,001 Bảng 16 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 4, hệ vi khuẩn PH01 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Thời gian 4693,4 2346,7 Sai số 104,1 20,8 Tổng cộng 4797,5 Giá trị F Giá trị P 112,76 0,000 Bảng 17 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 4, hệ vi khuẩn PH02 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Thời gian 4693,4 2346,7 Sai số 104,1 20,8 Tổng cộng 4797,5 Giá trị F Giá trị P 112,76 0,000 Bảng 18 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 4, hệ vi khuẩn CL01 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Thời gian 4972 2486 Sai số 1305 218 Tổng cộng 6277 Giá trị F Giá trị P 11,43 0,009 Bảng 19 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 4, hệ vi khuẩn CL02 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương ix Giá trị F Giá trị P Thời gian 6389,4 Sai số 424,9 Tổng cộng 3194,7 45,11 0,000 70,8 6814,2 Bảng 20 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 5, hệ vi khuẩn PH01 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương Thời gian 3136,37 Sai số 4,59 Tổng cộng 3140,96 1568,18 Giá trị F Giá trị P 1024,11 0,000 1,53 Bảng 21 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 5, hệ vi khuẩn PH02 Nguồn biến động Độ tự Thời gian Sai số Tổng cộng Tổng bình Trung bình bình phương phương 2780 1390 1499 Giá trị F Giá trị P 5,56 0,043 250 4278 Bảng 22 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 5, hệ vi khuẩn CL01 Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình phương phương 530,95 Thời gian 1061,90 Sai số 0,75 Tổng cộng 1062,64 Giá trị F Giá trị P 3543,12 0,000 0,15 Bảng 23 Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl thời điểm 330 ngày, 350 ngày, 450 ngày sau cấy thuốc nghiệm thức 5, hệ vi khuẩn CL02 Nguồn biến động Độ tự Thời gian Sai số Tổng cộng Tổng bình Trung bình bình phương phương 953,79 476,9 20,07 Giá trị F Giá trị P 71,28 0,003 6,69 973,87 Bảng 24 Bảng phân tích phương saitốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl ngày nghiệm thức bổ sung acid hữu hệ vi khuẩn CL01, CL02, PH01, PH02 giai đoạn 330-350 ngày x Nguồn biến động Độ tự Tổng bình Trung bình bình Giá trị F Giá trị P 11 phương 8,196 4,862 13,854 phương 2,72 0,608 4,47 0,04 Hệ vi khuẩn Sai số Tổng cộng Bảng 25 Tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl ngày nghiệm thức không bổ sung acid hữu giai đoạn 330-350 ngày Nguồn biến động Hệ vi khuẩn Sai số Tổng cộng Độ tự Tổng bình Trung bình bình Giá trị F Giá trị P 11 phương 5,900 7,425 13,825 phương 1,967 0,928 2,12 0,176 Bảng 26 So sánh T-test tốc độ phân hủy hệ vi khuẩn ký hiệu CL01 Nguồn biến động Nghiệm thức Sai số P-value Trung bình Độ lêch chuẩn Sai số chuẩn 0,563 1,967 0,48 1,2 0,928 0,58 0,458 Bảng 27.So sánh T-test tốc độ phân hủy hệ vi khuẩn ký hiệu CL02 Nguồn biến động Trung bình Độ lêch chuẩn Sai số chuẩn Nghiệm thức 2,808 0,652 0,38 Sai số 1,800 0,836 0,40 P-value 0,198 Bảng 28 So sánh T-test tốc độ phân hủy hệ vi khuẩn ký hiệu PH01 Nguồn biến động Trung bình Độ lêch chuẩn Sai số chuẩn Nghiệm thức 2,422 0,366 0,21 Sai số 2,043 0,980 0,57 P-value 0,594 Bảng 29 So sánh T-test tốc độ phân hủy hệ vi khuẩn ký hiệu PH02 Nguồn biến động Trung bình Độ lêch chuẩn Sai số chuẩn Nghiệm thức 1,11 1,48 0,85 Sai số 3,40 0,193 0,11 xi P-value 0,056 xii