Khảo sát khả năng phân hủy phốt pho khó tiêu và điều kiện lên men vi khuẩn bacillus mucilanous của nga

i LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin cảm ơn tới TS. Trần Thị Thanh vân đã tận tình dìu dắt, chỉ bảo, hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong thời gian tôi thực tập tại phòng Hóa phân tích và triển khai công nghệ của Viện công nghệ và ứng dụng Nha Trang, đồng thời tôi cũng xin cảm ơn các anh, chị đang công tác tại Viện công nghệ và ứng dụng Nha Trang đã giúp tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ths. Phạm Ngọc Minh Quỳnh đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn cho tôi và tôi cũng chân thành cảm ơn Ban giám đốc Viện công nghệ sinh học và môi trường, Ban lãnh đạo trường Đại Học Nha Trang, cùng thầy cô trong viện đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt niên học, giúp tôi có nền tảng vững chắc để bước vào đời. Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, gia đình, bạn bè và những người yêu thương tôi, luôn bên cạnh an ủi, động viên giúp tôi có sức mạnh để vượt qua những khó khăn và có niềm tin vào cuộc sống, để hoàn thành tốt mọi công việc. Nha Trang, tháng 07 năm 2012 Sinh viên Lê Thị Thu Trang ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI 3 1.Tổng Quan Về Tình Hình Nghiên Cứu 3 1.1 Tổng quan về phân bón vi sinh 3 1.1.1 Các dạng tồn tại của lân 3 1.1.2 Lân hữu cơ: 6 1.1.3 Lân vô cơ 7 1.2 Sự chuyển hóa lân trong đất 8 1.2.1 Sự chuyển hóa của lân hữu cơ 8 1.2.2 Sự chuyển hóa của lân vô cơ 9 1.3 Đặc điểm của vi sinh vật phân giải lân 10 1.3.1 Vi sinh vật phân giải lân vô cơ 10 1.3.2 Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ 11 1.4 Đặc điểm của Bacillus Muciloginosus 12 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng phân giải lân vi sinh vật 13 1.6 Vòng tuần hoàn của phốt pho trong đất 13 1.7 Vai trò sinh lý của phốt pho đối với cây trồng 14 1.8 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 16 1.9 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 17 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật Liệu Nghiên Cứu 21 2.1.1 Thiết bị thí nghiệm 21 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.3 Hóa chất 21 2.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus mucilaginosus 22 2.2.1 Môi trường Pikovskya rắn 22 2.2.2 Môi trường Pikovskya lỏng: 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Phương pháp làm sạch giống 26 iii 2.3.2 Phương pháp giữ giống 27 2.3.3 Phương pháp đo độ đục của môi trường 27 2.3.3.1 Phương pháp xác định khả năng phân giải phốt pho của Bacillus mucilaginosus 28 2.3.3.2 Xác định khả năng phân giải Phốt pho trên môi trường rắn 28 2.3.3.3 Xác định khả năng phân giải phốt pho của Bacillus mucilaginosus ở môi trường lỏng 29 2.3.4 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện nuôi cấy của Bacillus mucilaginosus 30 2.3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu (xác định pH tối ưu) đến khả năng phát triển của Bacillus mucilaginosus. 31 2.3.4.3 Xác định sự ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự phát triển của Bacillus mucilaginosus 32 2.3.4.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau đến quá trình sinh trưởng và phát triển của Bacillus mucilaginosus. 33 2.3.4.5 Ảnh hưởng của các nhiệt độ khác nhau đến khả năng phân giải phốt pho khó tiêu của Bacillus mucilaginosus 34 2.4 Phương pháp đếm số lượng tế bào 35 2.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus mucilaginosus đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây cải bẹ xanh mỡ 35 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Khả năng phân giải phốt pho khó tiêu của chủng Bacillus mucilaginosus 38 3.2 Nghiên cứu về đặc điểm hình thái của Bacillus mucilaginosus 40 3.3 Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng phân giải của Bacillus mucilaginosus 41 3.3.1 Ảnh hưởng của pH ban đầu lên sự phát triển của Bacillus mucilaginosus 41 3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự phát triển của vi khuẩn Bacillus mucilaginosus 42 3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân giải phốt pho khó tan của Bacillus mucilaginosus 43 iv 3.3.4 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau đến quá trình lên men Bacillus mucilaginosus 45 3.3.5 Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus mucilaginosus 46 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của Bacillus mucilaginosus đối với cây cải bẹ xanh mỡ 48 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 4.1 Kết luận 52 4.2 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CFU : Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Formig Unit) DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid P : Photpho K : Ka li OD : Mật độ quang (Optical Density) ATP : Adenosine Triphosphate ADP : Adenosine diphosphate UTP : Uridine Triphosphate GTP : Guanosine Triphotphate VSV : Vi sinh vật vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus mucilaginosus 55 Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự phát triển của Bacillus mucilaginosus 56 Bảng 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng phát triển của Bacillus mucilaginosus 56 Bảng 4: Ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau lên sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus mucilaginosus 57 Bảng 5: Kết quả nuôi cấy Bacillus mucilaginosus theo thời gian. 57 Bảng 6: Tỉ lệ hạt nảy mầm (tổng hạt gieo là 30 hạt/ đĩa peptri) 58 Bảng 7: Tỉ lệ % hạt nảy mầm của cây cải ngọt dưới sự ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus mucilaginosus 49 Bảng 8: Ảnh hưởng của Bacillus mucilaginosus tới chiều ca cây cải bẹ xanh mỡ (cm) 49 vii DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ Hình 1: Khảo sát sự phân giải phốt pho của vi khuẩn Bacillus mucilaginosus trong môi trường lỏng có bổ sung quặng apatit. 39 Hình 2: Khả năng phân giải phốt pho của Bacillusmucilaginosus trong môi trường rắn có bổ sung quặng apatit. 39 Hình 3: Hình thái khuẩn lạc của Bacillus mucilaginosus sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường pikovskya ở PH = 7 40 Hình 4: Đặc điểm hình thái của Bacillus mucilaginosus soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại x 1000 lần. 40 Hình 5: Môi trường xác định đường cong sinh trưởng. 48 Hình 6: Cải bẹ xanh mỡ sau 5 ngày gieo hạt 50 Hình 7: Cây cải bẹ xanh mơ sau 5 ngày gieo hạt 50 Hình 8: Cây cải bẹ xanh mỡ sau 5 ngày gieo hạt 51 Sơ đồ 1: Chu trình chuyển hóa của phốt pho trong tự nhiên 14 Sơ đồ 3. Quy trình khảo sát khả năng phân giải Phốt pho trên môi trường rắn 28 Sơ đồ 4. Quy trình khảo sát khả năng phân giải Phốt pho trên môi trường lỏng. 29 Sơ đồ 5: Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu 30 Sơ đồ 6. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu 31 Sơ đồ 7: Quy trình khảo sát ảnh hưởng của nông độ đường khác nhau. 32 Sơ đồ 8. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau 33 Sơ đồ 9. Quy trình khảo sát nhiệt độ tối thích của Bacillus mucilaginosus 34 Sơ đồ 10. Quy trình xác định ảnh hưởng của vi khuẩn lên cây ải bẹ xanh mỡ 36 Biểu đồ 1. Thể hiện sự ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Baciluss mucilaginosus. 42 Biểu đồ 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự phát triển của vi khuẩn Bacillus mucilaginosus 43 Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus mucilaginosus 44 Biểu đồ 4: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau lên vi khuẩn Bacillus mucilaginosus 45 Biểu đồ 5: Đường cong sinh trưởng của Bacillus mucilaginosus. 46 1 LỜI MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây cùng với sự phát triển kinh tế không ngừng là tình hình sa mạc hóa ngày càng tăng, làm giảm độ phì nhiêu của đất và nhân loại phải đối mặt với sự khủng hoảng lương thực. Cùng với đó là quá trình đô thị hóa ngày càng tăng làm cho diện tích đất nông nghiệp ngày càng bị thu hẹp. Để khắc phục tình trạng này phải có biện pháp cụ thể và hiệu quả. Hướng tới cải thiện đất trồng làm tăng sản lượng lương thực và phát triển nền nông nghiệp bền vững. Cũng giống như là nitơ và kali, phốt pho là chất dinh dưỡng được cây sử dụng trực tiếp từ đất, quyết định đến sự màu mỡ của đất cũng như sự phát triển của cây trồng. Theo ước tính khoảng đến đầu năm 2035 thì nhu cầu về phốt pho sẽ gấp nhiều lần sự cung cấp, theo lời bà Dana Cordell người đã trình bày luận văn tại ban nghiên cứu chuyên đề Nghiên cứu Nước và Môi trường tại đại học Linkoping, Thuỵ Điển về những tác động của sự khan hiếm phốt pho với an ninh lương thực toàn cầu [22]. Không những thế tình hình sử dụng phân bón hóa học rất bừa bãi làm cho môi trường đất trồng ngày càng xấu đi gây mất cân bằng sinh thái. Nếu tình hình này kéo dài thì sẽ gây hậu quả nghiêm trọng. Biện pháp khắc phục là thay thế một loại phân bón có lợi cho đất cho cây trồng và không ảnh hưởng xấu tới môi trường. Đó là phân bón vi sinh với những ưu điểm sau. Sử dụng phân bón vi sinh sẽ thay thế dần việc bón phân hoá học trên đồng ruộng, đất trồng trọt mà vẫn đảm bảo được nâng cao năng suất thu hoạch. Về lâu dài sẽ dần dần trở lại độ phì nhiêu cho đất như làm tăng lượng phốt pho và kali dễ tan trong đất canh tác, cải tạo, giữ độ bền của đất đối với cây trồng nhờ khả năng cung cấp hàng loạt quá trình chuyển hoá chất khác nhau liên tục do nhiều quần thể vi sinh vật khác nhau tạo ra. Đồng thời có ý nghĩa rất lớn là tăng cường bảo vệ môi trường sống, giảm tính độc hại do hoá chất trong các loại nông sản thực phẩm do lạm dụng phân bón hóa học. Ngoài ra cũng giảm được một phần chi phí ngoại tệ nhập khẩu phân hoá học [9]. Trong cơ thể thực vật, lân đóng vai trò quyết định đến sự biến đổi vật chất và năng lượng. Nó tham gia cấu tạo nên các acid nucleic, coenzyme, adenosin 2 triphosphate (ATP)… là những chất cần thiết cho sự sống. Ngoài ra lân còn đóng những vai trò khác như tạo môi trường đệm, ảnh hưởng đến quá trình hút các chất khoáng khác của cây. Đất chứa khối lượng lớn các chất chứa lân. Nhưng không phải hợp chất phốt pho nào trong đất cây cũng sử dụng được mà đa số chúng tồn tại dưới những hợp chất phốt pho khó tan mà cây không hấp thụ được. Ngoài ra phốt pho là thành phần không thể thiếu của ATP, ADP, GTP, FAD, NADP, coA, đây là những phần tử trao đổi năng lượng, có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình quang hợp và hô hấp của thực vật [2]. Quá trình chuyển hóa lân xảy ra chủ yếu dưới tác dụng của các quá trình hóa học , sinh học và có phần đóng góp quan trọng của vi sinh vật. Do đó khi sử dụng phân bón vi sinh có khả năng phân giải phốt pho cho đất trồng, tạo ra chất dinh dưỡng cho cây, sinh tổng hợp chất kích thích tăng trưởng thực vật, ức chế một số vi sinh vật gây bệnh cho vùng rễ cây trồng, phốt pho là chất dinh dưỡng đứng thứ 2 chỉ sau nitơ, lượng phốt pho dễ tiêu trong đất không cung cấp đủ nhu cầu cho cây trồng nhất là cây có năng suất cao [13]. Do đó chúng tôi chọn đề tài khảo sát khả năng phân huỷ phốt pho của vi khuẩn Bacillus mucilaginosus để phân hủy phốt pho khó tiêu có trong đất thành phốt pho dễ tiêu và điều kiện nuôi cấy của chủng này. Với nội dung sau - Đánh giá khả năng phân giải phốt pho của Bacillus muciloginosus. - Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng vi khuẩn Bacillus muciloginosus (nhiệt độ, pH, thời gian lên men…). - Nghiên cữu ảnh hưởng vi khuẩn Bacillus muciloginosus trên đất trồng cây. 3 CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI 1. Tổng Quan Về Tình Hình Nghiên Cứu 1.1 Tổng quan về phân bón vi sinh Phân bón vi sinh vật (gọi tắt là phân vi sinh) là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn có mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành. Thông qua các hoạt động của chúng sau quá trình bón vào đất tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng sử dụng được (N, P ,K,…) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng xuất hoặc chất lượng nông sản. Phân vi sinh bảo đảm không gấy ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản [6]. Khái niệm phân lân vi sinh: Phân vi sinh phân giải phốt pho khó tiêu: là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn với mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành có khả năng chuyển hoá hợp chất phốt pho khó tan thành dạng dễ tan cung cấp cho đất và cây trồng, tạo điều kiện nâng cao năng suất và hoặc chất lượng nông sản. Phân lân vi sinh và các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản [1]. 1.1.1 Các dạng tồn tại của lân Lân là nguyên tố dinh dưỡng đa lượng quan trọng với cây trồng nhưng khả năng sử dụng lân trong đất của cây lại đang còn thấp do lân tồn tại trong đất là dạng lân chưa hòa tan cây không sử dụng được [1]. Hàm lượng lân tổng số trên đất Việt Nam khoảng 0,03 – 0,2 %, đât giàu phốt pho nhất là đất đỏ bazan và nghèo nhất là đất bạc màu và đất cát [3]. Cơ thể thực vật sử dụng phốt pho dưới dạng muối của acid phosphoric. Bản chất của sự biến đổi các hợp chất phốt pho trong cơ thể là các gốc acid tham gia vào thành phần một chất hữu cơ nhất định bằng quá trình phosphoryl hóa và sau đó truyền cho các hợp chất khác (bằng cách phosphoryl hóa). Bằng con [...]... 200 triệu tế bào vi sinh vật Vi sinh vật có các nhóm chính sau: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc, vi tảo, virus Các nhóm có khả năng phân giải phốt pho là vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc Nghiên cứu của Puneet và cộng sự cho thấy Vi c nhiễm một số chủng nấm sợi có khả năng hòa tan phốt pho như Aspergillus flavus và Asp niger với vi khuẩn cố định nitơ Azotobacter sp đã tăng năng suất hạt 17,7%,... vi khuẩn vào lỗ 29  Nếu vi khuẩn có khả năng phân giải phốt pho khó tiêu thành dễ tiêu thì gây ra sự đổi màu môi trường, hình thành vòng phân giải quanh khuẩn lạc  Theo dõi khả năng hình thành vòng phân giải của vi khuẩn Bacillus mucilaginosus trong thời gian 3 – 7 ngày  Hoạt tính của vòng phân giải được đánh giá bằng hiệu số D – d (mm) trong đó D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính của. .. một phân bón sinh học (Lian và cộng sự, 2000) Vi khuẩn B mucilaginosus được chứng minh vừa có khả năng cố định ni tơ vừa có khả năng phân giải phốt pho và silicat Tuy nhiên khả năng phân giải của nó chưa được nghiên cứu rõ ràng tuy là nó được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp [14] Vi khuẩn Bacillus là vi sinh vật đất phổ biến và thông dụng đóng một vai trò quan trọng trong phân hủy sinh học silicat và. .. quan tới vi c chín của quả, vi c làm chậm chín của quả cây cà chua thiếu phốt pho có thể liên quan tới chức năng của phốt pho + Sự ức chế tổng hợp tinh bột do phốt pho vô cơ được gây ra do 2 cơ chế điều tiết riêng rẽ nằm ở trong lục lạp Enzyme chính của tổng hợp tinh bột nằm ở lục lạp ADP glucosepyrophosphorylase thì ức chế bởi phốt pho vô cơ và được kích thích bởi triosephosphates Tỉ lệ của phốt pho vô... khả năng hòa tan lân khó tan các chủng vi sinh vật này có khả năng sản sinh enzyme photphatase (chủ yếu là nấm sợi và vi khuẩn) enzyme này đóng vai trò xúc tác không thể thiếu cho quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa lân Vũ Thúy Nga, Nguyễn Ngọc Quyên, Trần Thủy Tú, Phạm văn Toản (2003) nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp IAA và phân giải phốt pho vô cơ khó tan của vi khuẩn Bradyrhizobium... Kopoor và cộng sự cũng đạt kết quả tương tự khi nghiên cứu sự phối hợp giữa chủng Azotobacter sp với các vi khuẩn phân giải phốt pho thuộc các chi Asgrobacterium sp, Bacillus sp và Pseudomonas sp…[14] Vi sinh vật phân giải lân được chia thành hai nhóm: Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ và vi sinh vật phân giải lân vô cơ 1.3.1 Vi sinh vật phân giải lân vô cơ Nhiều vi khuẩn như Bacillus megaterium, Bacillus. .. tới 5-9.109 tế bào vi khuẩn, có hai chủng ưu thế có khả năng 17 chuyển hóa phốt pho khó tan, xác định thuộc chi Bacillus Nó đã được thử nghiệm trên 23 loại cây trồng khác nhau và được chứng minh là vừa có khả năng chuyển hóa phốt pho trong các hợp chất khó tan vừa có khả năng cố định nitơ để cung cấp phốt pho và nitơ cho cây trồng [1] Năm 1970 ở Liên Xô đã dùng Bacillus megatheriumvar Phosphatcum để sản... thấy chúng có khả năng tổng hợp 20–100 microgam/ml môi trường nuôi cấy [1] Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ lên khả năng phân giải phốt pho khó tan của hai chủng nấm sợi Aspergillus awamori MN1 và Penicillum cyaneofulvum ĐT1 Tác giả nghiên cứu 7 nguồn cung cấp nitơ khác nhau lên khả năng phân giải phốt pho của Aspergillus awamori MN1 và Penicillum... chung được các vi sinh vật phân giải từ các nguồn lân vô cơ và hữu cơ khác nhau [16] Vòng tuần hoàn của lân được biểu diễn trong sơ đồ sau: 14 ĐỘNG THỰC VẬT SẢN PHẨM BÀI TIẾT THỰC VẬT PHÂN HỦY SINH HỌC VI KHUẨN SỬ DỤNG P CHẤT MÙN P KHOÁNG P- HỮU CƠ P KHÓ TAN HẤP THỤ KHOÁNG HÓA VSV PHÂN GIẢI P CÁC PHỐT PHO TAN Sơ đồ 1: Chu trình chuyển hóa của phốt pho trong tự nhiên Vi sinh vật phân giải phốt pho có vai... tạo khả năng phân giải phốt pho cao, còn đối với chủng ĐT1 là NH4Cl [1] Năm 1999 với đề tài kha học Nghiên cứu vi khuẩn phân giải phốt pho trong đất ở Thừa Thiên - Huế của tiến sĩ Phạm Thị Ngọc Lan với báo cáo tại Tuyển Tập Công Trình Hội Thảo Đa Dạng Sinh Học Bắc Trường Sơn (Lần thứ II) NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội [22] Và trong năm 2002 với đề tài khoa học “ Khả Năng Phân Giải phốt pho Khó Tan Của . tôi chọn đề tài khảo sát khả năng phân huỷ phốt pho của vi khuẩn Bacillus mucilaginosus để phân hủy phốt pho khó tiêu có trong đất thành phốt pho dễ tiêu và điều kiện nuôi cấy của chủng này trình chuyển hóa của phốt pho trong tự nhiên 14 Sơ đồ 3. Quy trình khảo sát khả năng phân giải Phốt pho trên môi trường rắn 28 Sơ đồ 4. Quy trình khảo sát khả năng phân giải Phốt pho trên môi trường. triệu tế bào vi sinh vật. Vi sinh vật có các nhóm chính sau: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc, vi tảo, virus . Các nhóm có khả năng phân giải phốt pho là vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc.