KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LIGNIN VÀ CELLULOSE TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ TỰ NHIÊN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LIGNIN VÀ CELLULOSE TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ TỰ NHIÊN Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN NGÔ YẾN NGỌC Niên khóa : 2009 - 2013 Tháng 6/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LIGNIN VÀ CELLULOSE TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ TỰ NHIÊN Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS LƯƠNG BẢO UYÊN NGUYỄN NGƠ YẾN NGỌC TS BÙI MINH TRÍ Tháng 6/2013 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập trao dồi kiến thức trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, với giúp đỡ, dạy tận tình Thầy Cơ; hỗ trợ nhiệt tình từ bạn bè, động viên, chia sẻ nguồn động lực từ gia đình, tơi có hội thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Với lòng biết ơn sâu sắc: Tơi xin cảm ơn quý Thầy Cô, Anh Chị Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trường trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh; Thầy Cơ, Anh Chị bạn Bộ Mơn Sinh Hóa trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên tận tình bảo, giúp đỡ truyền đạt nhiều kiến thức quý báu suốt thời gian thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới Thầy Bùi Minh Trí, Cơ Lương Bảo Un Anh Trần Văn Khuê hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện giúp đỡ củng cố kiến thức cho tơi để hồn thành khóa luận Xin cảm ơn nhóm Kute8girl, Anh Hiếu, bạn Đạt, Khanh, Linh Kha bên cạnh động viên, chia giúp đỡ tơi lúc khó khăn học tập sống Cảm ơn anh chị khóa DH08SH, anh chị em phòng thí nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học Thực Vật toàn thể bạn lớp DH09SH ln gắn bó với tơi suốt chặng đường đại học Và xin gửi lời cảm ơn thân thương sâu sắc đến Cha Mẹ Chị tôi, người yêu thương quan tâm nhất, người mang lại sống cho tôi, làm hướng sống tốt đẹp khơng ngừng nỗ lực để tìm sống tươi đẹp cho thân Cuối xin chúc trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên ngày lớn mạnh Chúc quý Thầy Cô gặt hái nhiều thành công tràn đầy sức khỏe Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng năm 2013 Nguyễn Ngơ Yến Ngọc i TÓM TẮT Nhu cầu nhiên liệu ngày gia tăng, nguồn nhiên liệu ngày cạn kiệt, đó, lượng lớn lignocelluloses chứa phụ, phế phẩm nông nghiệp chưa tận dụng triệt để Nhiều phương pháp xử lý tiến hành hiệu chưa cao khơng có tính bền vững mơi trường Do đó, khóa luận “Khảo sảt khả phân hủy lignin cellulose từ số chủng nấm phân lập từ tự nhiên” tiến hành nhằm tìm chủng nấm có hoạt tính phân hủy lignin tốt cho phép loại bỏ lignin từ nguồn phế thải nông nghiệp để sử dụng tối đa nguồn cellulose tiến tới sản xuất nhiên liệu sinh học hoàn toàn đường sinh học Các chủng nấm phân lập khảo sát khả phân hủy lignin cellulose dựa tốc độ lan tơ đường kính vòng phân giải môi trường chất lignin CMC, nhằm mục đích loại bỏ chủng có hoạt tính yếu tuyển chọn chủng có hoạt tính vượt trội Sau chủng nấm tiếp tục tuyển chọn dựa sở xác định hoạt tính enzyme bao gồm Lignin peroxidase (LiP), Mangan peroxidase (MnP) Cellulase Nghiên cứu tiến hành khảo sát nhằm xác định loại môi trường thời gian nuôi cấy cho phép tối ưu hóa khả sinh tổng hợp enzyme phân giải lignin cellulose Trong 25 chủng nấm phân lập thu nhận được, có chủng: 5; 10; 14 P201 đánh giá có hoạt tính cao so với chủng lại Sau thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme, chủng 10 (với giá trị: 163,391 UI/L enzyme LiP; 0,838 UI/L enzyme MnP 1098,914 UI/L enzyme cellulase) nhận xét chủng có hoạt tính cao hai hệ ligninase cellulase Chủng tiếp tục vào thí nghiệm khảo sát thời gian loại môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme phân giải lignin cellulose Kết cho thấy, mơi trường Avicel thích hợp cho biểu hệ enzyme cellulase, mơi trường PGB lại thích hợp cho biểu hệ enzyme ligninase Thời gian tối ưu cho biểu enzyme từ ngày thứ đến ngày thứ kể từ bắt đầu nuôi cấy Hoạt tính LiP cao vào ngày thứ (223,587 UI/L) mơi trường PGB; hoạt tính MnP cao vào ngày thứ (0,935 UI/L) môi trường PGB Đối với hệ cellulase, hoạt tính đạt giá trị cao (2340,148 UI/L) vào ngày môi trường Avicel ii SUMMARY Thesis entitled "Investigation of lignin and cellulose biodegradation of some fungal strains isolated from nature" was conducted in order to to find out active strains those can well decompose and remove lignin from agricultural waste sources for the production of biofuels by biological pathways Thesis research included four main contents The first, fungal strains were isolated from nature The next step, the thesis assessed the degree of lignin and cellulose degradation based on speed and diameter of round-resolution on the lignin medium and CMC medium The the experiment was expected to select outstanding strains in biomass degradation ability Then, the selected strains were determined enzyme activities including Lignin peroxidase, Mangan peroxidase and Cellulase Finally, we also tested factors those could affect the biosynthesis of lignin and cellulose enzymes From 25 samples were taken and isolated, it was indicated that the strains: strains 5, 10, 14 and P201 were superior as compared with other strains Based on enzyme assay, the strain 10 shown up to 163.391 UI/L; 0.838 UI/L and 1098.914 UI/L for LiP, MnP and cellulase activities, respectively This strain was considered to be the most highly active on both ligninase and cellulase systems In experiment - time and medium survey for the biosynthesis of lignin and cellulose enzymes, the results showed that Avicel medium was suitable for the biosynthesis of cellulase enzyme; PGB medium was suitable for biosynthesis enzyme ligninase system The optimal time for the enzyme activity was from the third to the fifth day of incubation LiP activity was the highest on the fifth day in PGB medium; with a value of 223.587 UI/L MnP activity reached maximal value on the third day in PGB medium with a value of 0.935 UI/L For cellulase enzyme systems, enzyme activity on Avicel medium was higher than on PGB medium and achieved the highest value on the third day with a value of 2340.148 UI/L Keywords: Lignin peroxidase, Mangan peroxidase, Cellulase, Phanerochate chrysosporium, ligninase, lignocelluloses iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn .i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix  Chương MỞ ĐẦU 1  1.1 Đặt vấn đề 1  1.2 Yêu cầu đề tài 2  1.3 Nội dung thực 2  Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3  2.1 Tổng quan giới nấm 3  2.1.1 Đặc điểm chung giới Nấm 4  2.1.1.1 Đặc điểm chung cấu tạo 4  2.1.1.2 Phương thức dinh dưỡng 4  2.1.1.3 Phương thức sinh sản 4  2.1.2 Vai trò nấm 4  2.2 Tổng quan lignocellulose 5  2.3 Tổng quan hemicellulose 7  2.4 Cellulose trình phân hủy cellulose 7  2.4.1 Tổng quan cellulose 7  2.4.2 Hệ enzyme phân hủy cellulose – cellulase 8  2.4.2.1 Enzyme exoglucanase 9  2.4.2.2 Enzyme endoglucanase 9  2.4.2.3 Enzyme β-glucosidase 10  2.4.3 Ứng dụng hệ enzyme cellulase 10  2.5 Lignin trình phân hủy lignin 10  2.5.1 Sơ lược lignin 10  2.5.2 Thành phần cấu trúc lignin 12  iv 2.5.3 Các phương pháp xử lý loại bỏ lignin sản xuất cồn sinh học 13  2.5.4 Hệ enzyme tham gia phân hủy lignin (Ligninase) 14  2.5.4.1 Lignin peroxidase (LiP) 14  2.5.4.2 Mangan peroxidase (MnP) 15  2.5.4.3 Laccase 16  2.5.4.4 Các enzyme khác 16  2.5.5 Ứng dụng enzyme phân hủy lignin 17  2.5.6 Nấm phân hủy lignin 17  Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21  3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21  3.2 Vật liệu nghiên cứu 21  3.2.1 Thu nhận mẫu 21  3.2.2 Thiết bị hóa chất sử dụng 21  3.2.2.1 Dụng cụ thiết bị 21  3.2.2.2 Hóa chất sử dụng 21  3.3 Nội dung nghiên cứu 22  3.3.1 Phân lập bảo quản chủng thu nhận 23  3.3.1.1 Phân lập mẫu 23  3.3.1.2 Làm giữ giống 24  3.3.2 Định tính khả phân hủy Lignin/CMC 24  3.3.2.1 Khảo sát khả phân hủy lignin/CMC dựa vào lan tơ môi trường chất lignin/CMC 24  3.3.2.2 Khảo sát khả phân hủy lignin/CMC dựa vòng phân giải 24  3.3.3 Xác định hoạt tính enzyme 25  3.3.3.1 Hoạt tính LiP 25  3.3.3.2 Hoạt tính MnP 26  3.3.3.3 Hoạt tính cellulase 27  3.3.4 Khảo sát số điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme phân giải lignin cellulose 28  Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30  4.1 Quá trình phân lập mẫu nấm 30  4.2 Nhận dạng tương đồng định tính khả phân giải lignin cellulose 34  4.2.1 Mơ tả đặc điểm hình thái chủng phân lập 34  4.2.2 Kết định tính khả phân hủy lignin cellulose 38  v 4.2.2.1 Sự lan tơ chủng nấm hai loại môi trường lignin CMC 38  4.2.2.2 Vòng phân giải chủng nấm mơi trường chất lignin CMC 41  4.2.3 Quan sát tơ nấm chủng có hoạt tính cao kính hiển vi 45  4.3 Hoạt tính enzyme chủng 5, 10; 14 P201 sau ngày nuôi lắc 46  4.4 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme phân giải lignin cellulose 48  4.4.1 Hoạt tính LiP 48  4.4.2 Hoạt tính MnP 50  4.4.3 Hoạt tính cellulase 51  Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53  5.1 Kết luận 53  5.2 Đề nghị 53  TÀI LIỆU THAM KHẢO 54  vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABTS 2,2’-Azinibis (3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonate) CMC Carboxyl Methyl Cellulose C-1 Exocellulase Cx Endocellulase Ctv Cộng tác viên DNS Dinitrosalisilic Acid Lac Laccase LiP Lignin peroxidase LLL Lần lặp lại MnP Mangan peroxidase MT Môi trường NT Nghiệm thức OD Optical Density PGA Potato glucose agar TB Trung bình SE Standard Error vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần lignocelluloses rác thải phế phụ nông nghiệp Bảng 3.1 Quy trình xây dựng đường chuẩn glucose 27 Bảng 3.2 Quy trình đo mẫu thí nghiệm 27 Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian mơi trường ni lắc tối ưu 29 Bảng 4.1 Quá trình phân lập mẫu 31 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái chủng nấm phân lập môi trường PGA 32 Bảng 4.3 Tốc độ lan tơ trung bình chủng môi trường lignin CMC 38 Bảng 4.4 Tốc độ lan tơ trung bình chủng 5; 10; 11;14; 29; 35; P201 39 Bảng 4.5 Tốc độ phát triển sợi tơ trung bình 39 Bảng 4.6 Sư lan tơ chủng: 5; 10; 11;14; 29; 35; P201 môi trường lignin 40 Bảng 4.7 Sư lan tơ chủng: 5; 10; 11;14; 29; 35; P201 môi trường CMC 40 Bảng 4.8 Vòng lan tơ trung bình chủng PC.36201 Trichoderma reesis 41 Bảng 4.9 Vòng phân giải 25 chủng nấm môi trường lignin CMC… 43 Bảng 4.10 Hoạt tính enzyme bốn chủng: 5; 10; 14 P201 sau ngày nuôi lắc 47 Bảng 4.11 Hoạt tính LiP thí nghiệm khảo sát thời gian môi trường tối ưu 48 Bảng 4.12 Hoạt tính MnP thí nghiệm khảo sát thời gian môi trường tối ưu 50 Bảng 4.13 Hoạt tính cellulase thí nghiệm khảo sát thời gian môi trường tối ưu51 Bảng 4.14 Hoạt tính CMCase lồi nấm mốc theo thời gian 51 viii Bảng Bảng số liệu cho xử lý thống kê thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme cellulase Mẫu 10 14 P201 Thử thật Thử khơng Hoạt tính enzyme (UI/L) 0,193 0,222 0,229 0,220 0,226 0,226 0,206 0,232 0,258 0,198 0,195 0,204 0,119 0,134 0,147 0,073 0,084 0,081 0,124 0,152 0,185 0,106 0,095 0,103 523,111 637,185 588,296 1117,926 1077,185 1101,630 588,296 572,000 514,963 669,778 734,963 743,111 Hoạt tính trung bình (UI/L) 582,864 1098,914 558,420 715,951 Bảng Bảng ANOVA cho thí nghiệm thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme cellulase dựa số liệu Bảng One way ANOVA grouped over variable (Chung nam)with values from to Variable (Hoat tinh cellulase) A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 561170.500 187056.833 110.129 0.0000 Within 13588.247 1698.531 Total 11 574758.747 Coefficient of Variation = 5.58% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 1748.592 582.864 57.23 23.79 3.00 3296.741 1098.914 20.51 23.79 3.00 1675.259 558.420 38.51 23.79 3.00 2147.852 715.951 40.19 23.79 -Total 12.00 8868.444 739.037 228.58 65.99 Within 41.21 Bảng 10 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme cellulase dựa số liệu Bảng Error Mean Square = 1699 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 112.9 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean = = = = 582.9 1099 558.4 716.0 C A C B Mean Mean Mean Mean = = = = 1099 716.0 582.9 558.4 A B C C Phụ lục Khảo sát số điều kiện ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzyme phân giải lignin cellulose Bảng Hoạt tính enzyme LiP thí nghiệm khảo sát điều kiện tối ưu ngày Môi trường phút phút ∆OD phút ngày phút ∆OD phút ngày phút ∆OD 0,007 0,007 0,008 1,396 1,418 1,413 1,373 1,396 1,389 0,023 0,022 0,024 1,401 1,413 1,411 1,371 1,386 1,380 1,521 0,006 Avicel 1,540 0,004 1,529 0,005 ngày Môi trường phút phút ∆OD 1,356 1,357 1,353 1,383 1,394 1,392 phút 1,341 0,015 1,346 0,011 1,342 0,011 ngày phút ∆OD phút 1,361 0,022 1,367 0,027 1,365 0,027 ngày phút ∆OD PGB 1,573 1,566 1,569 1,566 1,559 1,561 1,527 1,544 1,534 0,030 0,027 0,031 PGB 1,421 1,427 1,421 1,375 1,387 1,374 0,046 0,040 0,047 1,316 1,311 1,414 1,258 1,248 1,353 0,058 0,063 0,061 1,337 1,344 1,338 1,285 1,291 1,290 0,052 0,053 0,048 Avicel 1,229 1,228 1,226 1,190 1,192 1,194 0,039 0,036 0,032 1,322 1,315 1,343 1,281 1,269 1,301 0,041 0,046 0,042 1,283 1,284 1,288 1,248 1,251 1,256 0,035 0,033 0,032 Bảng Bảng số liệu cho xử lý thống kê thí nghiệm xác định hoạt tính LiP chủng 10 Mơi trường PGB Ngày Môi trường Avicel Hoạt tính Hoạt tính LiP trung Hoạt tính Hoạt tính LiP trung LiP (UI/L) bình (UI/L) LiP (UI/L) bình (UI/L) 25,799 25,799 29,484 84,767 81,081 88,452 110,565 99,509 114,251 169,533 147,420 173,219 213,759 232,187 224,816 191,646 195,332 176,904 27,027 84,767 108,108 163,391 223,587 187,961 22,113 14,742 18,428 55,283 40,541 40,541 81,081 99,509 99,509 143,735 132,678 117,936 151,106 169,533 154,791 128,993 121,622 117,936 18,428 45,455 93,366 131,450 158,477 122,850 Bảng Bảng ANOVA cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme LiP chủng 10 môi trường PGB dựa số liệu Bảng One way ANOVA grouped over variable (Ngay)with values from to Variable (Hoat tinh LiP tren PGB) A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 78974.773 15794.955 209.309 0.0000 Within 12 905.549 75.462 Total 17 79880.322 Coefficient of Variation = 6.56% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 81.082 27.027 2.13 5.02 3.00 254.300 84.767 3.69 5.02 3.00 324.325 108.108 7.67 5.02 3.00 490.172 163.391 13.95 5.02 3.00 670.762 223.587 9.28 5.02 3.00 563.882 187.961 9.75 5.02 -Total 18.00 2384.523 132.474 68.55 16.16 Within 8.69 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạn cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme LiP chủng 10 môi trường PGB dựa số liệu Bảng Error Mean Square = 75.16 Error Degrees of Freedom = 12 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 21.62 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 27.03 F Mean = 223.6 Mean = 84.77 E Mean = 188.0 Mean = 108.1 D Mean = 163.4 Mean = 163.4 C Mean = 108.1 Mean = 223.6 A Mean = 84.77 Mean = 188.0 B Mean = 27.03 A B C D E F Bảng Bảng ANOVA cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme LiP chủng 10 môi trường Avicel dựa số liệu Bảng One way ANOVA grouped over variable (Ngay)with values from to Variable (Hoat tinh LiP tren Avicel) A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 43359.551 8671.910 105.413 0.0000 Within 12 987.195 82.266 Total 17 44346.745 Coefficient of Variation = 9.55% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 55.303 18.434 3.70 5.24 3.00 136.365 45.455 8.51 5.24 3.00 280.099 93.366 10.64 5.24 3.00 394.349 131.450 12.94 5.24 3.00 475.430 158.477 9.75 5.24 3.00 368.551 122.850 5.63 5.24 -Total 18.00 1710.097 95.005 51.07 12.04 Within 9.07 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạn cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme LiP chủng 10 môi trường Avicel Error Mean Square = 82.27 Error Degrees of Freedom = 12 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 22.62 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 18.43 E Mean = 158.5 Mean = 45.46 D Mean = 131.5 Mean = 93.37 C Mean = 122.9 Mean = 131.5 B Mean = 93.37 Mean = 158.5 A Mean = 45.46 Mean = 122.9 B Mean = 18.43 A B B C D E Bảng Hoạt tính enzyme MnP thí nghiệm khảo sát thời gian mơi trường tối ưu ngày Môi trường phút phút ∆OD 0,012 0,040 0,028 PGB 0,010 0,039 0,029 0,013 0,044 0,031 0,011 0,032 0,021 Avicel 0,019 0,039 0,020 0,025 0,044 0,019 ngày Môi trường phút phút ∆OD 0,035 0,049 0,014 PGB 0,042 0,059 0,017 0,041 0,056 0,015 0,038 0,046 0,008 Avicel 0,019 0,025 0,006 0,031 0,038 0,007 ngày phút phút ∆OD 0,015 0,050 0,035 0,017 0,048 0,031 0,017 0,050 0,033 0,013 0,036 0,023 0,011 0,035 0,024 0,016 0,042 0,026 ngày phút phút ∆OD 0,029 0,043 0,014 0,030 0,041 0,011 0,026 0,040 0,014 0,031 0,037 0,006 0,032 0,037 0,005 0,030 0,036 0,006 ngày phút phút ∆OD 0,028 0,075 0,047 0,031 0,074 0,043 0,033 0,087 0,054 0,004 0,021 0,017 0,012 0,025 0,013 0,008 0,024 0,016 ngày phút phút ∆OD 0,003 0,015 0,012 0,004 0,014 0,010 0,005 0,015 0,010 0,029 0,032 0,003 0,016 0,021 0,005 0,024 0,027 0,003 Bảng Bảng số liệu cho xử lý thống kê thí nghiệm xác định hoạt tính MnP chủng 10 Môi trường PGB Ngày Hoạt tính MnP (UI/L) 0,545 0,565 0,604 0,682 0,604 0,643 0,916 0,838 1,052 0,273 0,331 0,292 0,273 0,214 0,273 0,234 0,195 0,195 hoạt tính MnPtrung bình (UI/L) 0,571 0,643 0,935 0,299 0,253 0,208 Mơi trường Avicel Hoạt tính MnP (UI/L) 0,409 0,390 0,370 0,448 0,468 0,506 0,331 0,253 0,312 0,156 0,117 0,136 0,117 0,097 0,117 0,058 0,097 0,058 hoạt tính MnPtrung bình (UI/L) 0,390 0,474 0,299 0,136 0,110 0,071 Bảng Bảng ANOVA cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme MnP chủng 10 môi trường PGB dựa số liệu Bảng One way ANOVA grouped over variable (Ngay)with values from to Variable (Hoat tinh MnP tren PGB) A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1.201 0.240 86.340 0.0000 Within 12 0.033 0.003 Total 17 1.234 Coefficient of Variation = 10.88% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 1.714 0.571 0.03 0.03 3.00 1.929 0.643 0.04 0.03 3.00 2.806 0.935 0.11 0.03 3.00 0.896 0.299 0.03 0.03 3.00 0.760 0.253 0.03 0.03 3.00 0.624 0.208 0.02 0.03 -Total 18.00 8.729 0.485 0.27 0.06 Within 0.05 Bảng 10 Bảng trắc nghiệm phân hạn cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme MnP chủng 10 môi trường PGB dựa số liệu Bảng Error Mean Square = 0.03000 Error Degrees of Freedom = 12 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.4320 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 0.5700 AB Mean = 0.9400 Mean = 0.6400 AB Mean = 0.6400 Mean = 0.9400 A Mean = 0.5700 Mean = 0.3000 B Mean = 0.3000 Mean = 0.2500 B Mean = 0.2800 Mean = 0.2800 B Mean = 0.2500 A AB AB B B B Bảng 11 Bảng ANOVA cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme MnP chủng 10 mơi trường Avicel dựa số liệu Bảng One way ANOVA grouped over variable (Ngay)with values from to Variable (Hoat tinh MnP tren Avicel) A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.409 0.082 125.207 0.0000 Within 12 0.008 0.001 Total 17 0.417 Coefficient of Variation = 10.37% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 1.169 0.390 0.02 0.01 3.00 1.422 0.474 0.03 0.01 3.00 0.896 0.299 0.04 0.01 3.00 0.409 0.136 0.02 0.01 3.00 0.331 0.110 0.01 0.01 3.00 0.213 0.071 0.02 0.01 -Total 18.00 4.440 0.247 0.16 0.04 Within 0.03 Bảng 12 Bảng trắc nghiệm phân hạn cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme MnP chủng 10 môi trường Avicel dựa số liệu Bảng Error Mean Square = 0.01000 Error Degrees of Freedom = 12 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.2494 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = 0.3900 0.4700 0.3000 0.1400 0.1100 0.07000 A A AB B B B Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = 0.4700 0.3900 0.3000 0.1400 0.1100 0.07000 A A AB B B B Bảng 13 Hoạt tính cellulase thí nghiệm khảo sát thời gian môi trường tối ưu Môi trường PGB Avicel Môi trường PGB Avicel Thử thật 0,101 0,112 0,117 0,124 0,137 0,117 Thử thật 0,205 0,205 0,213 0,146 0,154 0,155 ngày Thử ∆OD không 0,012 0,089 0,015 0,097 0,013 0,104 0,033 0,091 0,030 0,107 0,033 0,084 ngày Thử ∆OD không 0,067 0,138 0,066 0,139 0,069 0,144 0,062 0,084 0,086 0,068 0,081 0,074 Thử thật 0,130 0,135 0,138 0,144 0,156 0,149 Thử thật 0,194 0,202 0,200 0,129 0,116 0,117 ngày Thử ∆OD không 0,015 0,115 0,016 0,119 0,017 0,121 0,030 0,114 0,033 0,123 0,038 0,111 ngày Thử ∆OD không 0,151 0,043 0,153 0,049 0,155 0,045 0,062 0,067 0,059 0,057 0,062 0,055 Thử thật 0,171 0,167 0,173 0,361 0,360 0,363 Thử thật 0,074 0,078 0,078 0,078 0,086 0,089 ngày Thử ∆OD không 0,042 0,129 0,039 0,128 0,040 0,133 0,063 0,298 0,062 0,298 0,068 0,295 ngày Thử ∆OD không 0,051 0,023 0,050 0,028 0,052 0,026 0,042 0,036 0,050 0,036 0,051 0,038 Bảng 14 Bảng số liệu cho xử lý thống kê thí nghiệm xác định hoạt tính cellulase chủng 10 Mơi trường PGB Ngày Hoạt tính MnP (UI/L) 645,333 710,519 767,556 857,185 889,778 906,074 971,259 963,111 1003,852 1044,593 1052,741 1093,481 270,519 319,407 286,815 107,556 148,296 132,000 Hoạt tính MnP trung bình (UI/L) 707,802 884,346 979,407 1063,605 292,247 129,284 Mơi trường Avicel Hoạt tính MnP (UI/L) 661,630 792,000 604,593 849,037 922,370 824,593 2348,296 2348,296 2323,852 604,593 474,222 523,111 466,074 384,593 368,296 213,481 213,481 229,778 Hoạt tính MnP trung bình (UI/L) 686,074 865,333 2340,148 533,975 406,321 218,914 Bảng 15 Bảng ANOVA cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme Cellulase chủng 10 môi trường PGB dựa số liệu Bảng 14 One way ANOVA grouped over variable (Ngay) with values from to Variable (Hoat tinh cellulase tren PGB) A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2198627.741 439725.548 402.759 0.0000 Within 12 13101.393 1091.783 Total 17 2211729.134 Coefficient of Variation = 4.89% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 2123.408 707.803 61.16 19.08 3.00 2653.037 884.346 24.89 19.08 3.00 2938.220 979.407 21.56 19.08 3.00 3190.810 1063.603 26.19 19.08 3.00 876.741 292.247 24.89 19.08 3.00 387.852 129.284 20.51 19.08 -Total 18.00 12170.068 676.115 360.70 85.02 Within 33.04 Bảng 16 Bảng trắc nghiệm phân hạn cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme Cellulase chủng 10 môi trường PGB dựa số liệu Bảng 14 Error Mean Square = 1092 Error Degrees of Freedom = 12 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 82.41 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = 707.8 884.4 979.4 1064 292.3 129.3 D C B A E F Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = 1064 979.4 884.4 707.8 292.3 129.3 A B C D E F Bảng 17 Bảng ANOVA cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme Cellulase chủng 10 mơi trường Avicel dựa số liệu Bảng 14 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 8826709.972 1765341.994 552.033 0.0000 Within 12 38374.681 3197.890 Total 17 8865084.653 Coefficient of Variation = 6.72% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 2058.223 686.074 96.07 32.65 3.00 2596.000 865.333 50.88 32.65 3.00 7020.444 2340.148 14.11 32.65 3.00 1601.926 533.975 65.86 32.65 3.00 1218.963 406.321 52.39 32.65 3.00 656.740 218.913 9.41 32.65 -Total 18.00 15152.296 841.794 722.13 170.21 Within 56.55 Bảng 18 Bảng trắc nghiệm phân hạn cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme Cellulsase chủng 10 môi trường Avicel dựa số liệu Bảng 14 Error Mean Square = 3198 Error Degrees of Freedom = 12 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 141.0 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 666.1 C Mean = 2340 Mean = 865.3 B Mean = 865.3 Mean = 2340 A Mean = 666.1 Mean = 534.0 CD Mean = 534.0 Mean = 406.3 D Mean = 406.3 Mean = 218.9 E Mean = 218.9 A B C CD D E a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) m) n) o) p) q) r) s) t) Hình Đường kính vòng phân giải chủng nấm môi trường chất lignin a) Chủng (0,8 cm); b) Chủng (0,7 cm); c) Chủng (0 cm); d) Chủng (0,7 cm); e) Chủng 11 (0,2 cm); f) Chủng 16 (0,5 cm); g) Chủng 20 (0,7 cm); h) Chủng 24 (0,6 cm); i) Chủng 28 (0,5 cm); j) Chủng 29 (0,7 cm); k) Chủng 30 (0,7 cm); l) Chủng 31 (0,5 cm); m) Chủng 35 (0,7 cm); n) u) Chủng 41 (0,6 cm); o) Chủng 42 (0 cm); p) Chủng 44 (0,7 cm); q) Chủng 460 cm); r) Chủng 54 (0,7 cm); s) Chủng BD (0,8 cm); t) Chủng NCT (0,7 cm); u) Chủng TG3 (0 cm) a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) m) n) o) p) q) r) s) t) Hình Đường kính vòng phân giải chủng nấm môi trường chất CMC a) Chủng 1( 0,8 cm); b) Chủng (0,8 cm); c) Chủng (0,4 cm); d) Chủng (0,4 cm); e) Chủng 11(1 cm) f) Chủng 16(0,7 cm); g) Chủng 20 (0,9cm); h) Chủng 24 (0,4 cm); i) Chủng 28 (0,7 cm); j) Chủng 29 (0,7 cm); k) Chủng 30 (0,9 cm); l) Chủng 31 (0,5 cm); m) Chủng 35 (0,6 cm); n) Chủng u) 41 (0,7 cm); o) Chủng 42 (0,4 cm); p) Chủng 44 (0,7 cm); q) Chủng 46 (0 cm) ; r) Chủng 54 (0, cm); s) Chủng BD (0,7 cm); t) Chủng NCT (0,7 cm); u) Chủng TG3 (0 cm) Phụ lục 10 Nuôi cấy lắc môi trường PGB lỏng ngày thứ chủng nấm tuyển chọn Phụ lục 11 Khảo sát số điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme phân hủy lignin cellulose Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày ... enzyme phân hủy lignin cellulose có ý nghĩa Từ lí trên, đề tài: Khảo sát khả phân hủy lignin cellulose từ số chủng nấm phân lập từ tự nhiên tiến hành nhằm mục đích phát chủng nấm có hoạt tính phân. .. đó, khóa luận Khảo sảt khả phân hủy lignin cellulose từ số chủng nấm phân lập từ tự nhiên tiến hành nhằm tìm chủng nấm có hoạt tính phân hủy lignin tốt cho phép loại bỏ lignin từ nguồn phế thải... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LIGNIN VÀ CELLULOSE TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ TỰ