PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NẤM Beauveria GÂY BỆNH VÔI TẰM DÂU Bombyx mori HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC LIỆU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NẤM Beauveria GÂY BỆNH VÔI TẰM DÂU Bombyx mori HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC LIỆU Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THANH NGA Niên khóa: 2007 - 2011 Tháng 07 năm 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NẤM Beauveria GÂY BỆNH VÔI TẰM DÂU Bombyx mori HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC LIỆU Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS LÊ THỊ DIỆU TRANG NGUYỄN THỊ THANH NGA Tháng 07 năm 2011 LỜI CẢM ƠN Lời xin dành cho ba mẹ- người khơng quản khó khăn, vất vả ni nấng cho ăn học đến ngày hôm Cảm ơn gia đình ln bên cạnh chia sẻ niềm vui nỗi buồn, động viên, tiếp sức vượt qua khó khăn Và để đạt kết ngày hôm xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: TS Lê Thị Diệu Trang người theo suốt tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, tất quý Thầy Cô truyền dạy kiến thức cho tơi suốt q trình học tập trường Ban lãnh đạo tồn thể q Thầy Cơ , Anh Chị bạn làm việc, thực tập Viện Công Nghệ Sinh Học Và Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM giúp đỡ thời gian thực tập Viện Tập thể lớp DH07SH đồng hành, giúp đỡ chia sẻ lúc gặp trở ngại Những người bạn sát cánh san sẻ khó khăn, động viên ủng hộ tơi Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng năm 2011 Người viết Nguyễn Thị Thanh Nga i TÓM TẮT Bạch cương tàm (tằm vôi) vị thuốc quý y học cổ truyền Người ta tìm nấm Beauveria bassiana nguyên nhân gây bệnh vôi vào năm 1835 nhiều chủng Beauveria khác có khả Bạch cương tàm thường khó tìm xuất vào mùa mưa Tuy nhiên, khả phát tán nấm gây bệnh rộng nên bệnh lây lan nhanh ảnh hưởng nhiều đến suất tơ tằm Để sản xuất bạch cương tằm làm dược liệu mà không gây tác hại đến việc sản xuất tơ kén ta cần có biện pháp ni tạo tằm vơi phạm vi kiểm sốt nhằm hạn chế việc lây lan tự nhiên Trên sở chúng tơi tiến hành đề tài “Phân lập số chủng nấm Beauveria gây bệnh vôi tằm dâu Bombyx mori Hướng ứng dụng dược liệu” đặt tảng cho nghiên cứu sau sản xuất nguồn dược liệu Nội dung nghiên cứu: phân lập chủng nấm gây bệnh tằm vôi mẫu bệnh thu thập địa phương, định danh chủng nấm kí sinh giải trình tự đoạn gen 28S rRNA so sánh với liệu GeneBank công cụ Blast (NCBI) kết hợp với quan sát hình thái, đặc điểm sinh trưởng phát triển Phân tích thành phần số axít amin có mẫu tằm bệnh để khẳng định khả ứng dụng dược liệu Kết quả: Phân lập định danh chủng nấm Nomuraea rileyi (tên trước Beauveria rileyi) Ghi nhận được đặc điểm hình thái sợi nấm, bào tử, tớc đợ sinh trưởng của Nomuraea rileyi Xác định thành phần axít amin mẫu tằm vôi thu thập Kết luận: Xác định thêm chủng nấm Beauveria rileyi gây bệnh tằm vôi Đánh giá đặc điểm sinh trưởng phát triển Trong môi trường PGA tốc độ phát triển khả hình thành bào tử chủng nấm chậm Do cần khảo sát thêm nhiều điều kiện mơi trường ni cấy khác để tìm điều kiện tối ưu cho trình sinh bào tử phục vụ cho việc lây nhiễm nhân tạo sản xuất bạch cương tàm ii SUMMARY The thesis title: Isolation of some trains of entomopathogenic fungi Beauveria cause white muscardin disease on silkworm Bombyx mori A perspective in pharmaceutial material applying Bach cuong tam (white muscardin diseased silkworm), which has the first position on “Ban Kinh” book, is one of the precious medicaments of China traditional medicine People discovered Beauveria bassiana which caused disease in 1835 and many other Beauveria species also have this ability Bach cuong tam is very difficult to find It only appears in rain reason and winter However, due to its wide spread so rapidly spread to affect a lot of silk production Bach cuong tam contains protid 67.44%, 4.38% lipid, vitamins A, B2, D, beauvericin substances, amino axíts, sterols, steroids, ammonium oxalate, According to some reseaches, Bach cuong tam has ability in anti- inflammatory ,anti-bacteria, pain relief, convulsion inhibition To produce white muscardin silkworm as pharmaceuticals material we need to take measures and create a culture within the reach of control to limit the spread in the wild On that basis, we conducted the project " Isolation of some trains of entomopathogenic fungi Beauveria cause white muscardin disease on silkworm Bombyx mori A perspective in pharmaceutial material applying” to set up a background for the following reseach on producing medicine Our research includes isolate strains of fungal pathogens reach the samples collected at the local, parasitic fungal species identified by molecular biology techniques sequenced 28S rRNA gene, compared with data from GeneBank using Blast tools (NCBI) in combination with morphological observations and the characteristics of growth development Analysis of amino axít composition in some samples to confirm the silkworm disease possibility in the pharmaceutical applications Results: Nomuraea rileyi (used to be called Beauveria rileyi before) has been classified and identified Structures, spores, characteristics and growing speed of Nomuraea rileyi grown in Petri disc have been recorded iii In conclusion, A entomopathogenic fungi strain, Nomuraea rileyi, has been determined The development of growth characteristics has been assessed In the PGA media growth and sporulation ability of fungal species slow Therefore further investigation in several conditions and different cultures to find the optimal conditions for sporulation to is needed Key words: Entermopathogenic fungi, Nomuraea rileyi, Bombyx mori iv MỤC LỤC Trang LỜI CÁM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC v DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử nghiên cứu nấm gây bệnh côn trùng 2.2 Sơ lược bệnh vôi tằm dâu Bombyx mori 2.3 Công dụng bạch cương tàm 2.4 Tổng quan nấm bất tồn kí sinh trùng 2.4.1 Sơ lược nấm Beauveria bassiana 2.4.1.1 Đặc điểm hình thái 2.4.1.2 Đặc điểm nuôi cấy 2.4.1.3 Hoạt tính sinh học nấm Beauveria bassiana 2.4.1.4 Tính an tồn nấm động vật máu nóng 2.4.2 Sơ lược nấm Nomuraea rileyi (Beauveria rileyi) 10 2.4.3 Cơ chế xâm nhiễm nấm gây bệnh côn trùng 11 2.4.4 Sự thay đổi bệnh rối loạn chức thể côn trùng 12 2.4.5 Phương pháp định danh nấm 13 2.4.6 Các nghiên cứu nấm Beauveria 14 2.4.6.1 Nghiên cứu nước 14 2.4.6.2 Nghiên cứu nước 15 v Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 3.1.1 Thời gian 17 3.1.2 Địa điểm 17 3.2 Vật liệu thí nghiệm 17 3.2.1 Nguồn phân lập 17 3.2.2 Thành phần môi trường sử dụng lít (PGA) 17 3.2.3 Dụng cụ thiết bị 18 3.2.3.1 Dụng cụ 18 3.2.3.2 Thiết bị 18 3.3 Phương pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Thu thập mẫu tằm nhiễm bệnh 18 3.3.2 Chuẩn bị môi trường 18 3.3.3 Phương pháp phân lập 18 3.3.4 Định danh lồi nấm kí sinh 19 3.3.6 Phân tích số axít amin mẫu tằm vôi 19 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 19 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 Kết 20 4.1.1 Một số khuẩn lạc nấm thu sau phân lập 20 4.1.2 Khảo sát hình thái 21 4.1.3 Định danh kĩ thuật phân tử 24 4.1.4 Tốc độ phát triển nấm Nomuraea rileyi mơi trường PGA 27 4.1.5 Thành phần axít amin mẫu tằm vôi 28 4.2 Thảo luận 29 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT DOR: Directorate of Oilseeds Research PDBC: Project Directorate of Biological control HPLC: High performance liquid chromatography PGA: Potato glucoza agar PMA: Potato maltoza agar CNSH - MT: Công nghệ sinh học - môi trường SDA: Sabouraud’s dextrose agar YPDA: Yeast extract potato dextrose agar PDA: Potato dextrose agar Nsc: Ngày sau cấy vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1 Kích thước tản nấm đo môi trường thạch PGA 27 Bảng 4.2 Thành phần axít amin mẫu tằm vôi 29 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cuống sinh bào tử bào tử nấm Beauveria bassiana Hình 2.2 Cấu trúc hóa học độc tố beauvericin Hình 2.3 Nấm Nomuraea rileyi gây bệnh sâu 10 Hình 2.4 Hình thái Nomuraea rileyi Nomuraea atypicola 11 Hình 3.1 Các mẫu tằm bệnh thu thập Bảo Lộc-Lâm Đồng 17 Hình 4.1 Một số khuẩn lạc nấm thu thập sau phân lập 20 Hình 4.1 (tt) Một số khuẩn lạc nấm thu thập sau phân lập 21 Hình 4.2 Cấu trúc sợi nấm khuẩn lạc (11) quan sát kính hiển vi 22 Hình 4.3 Cấu trúc sợi nấm khuẩn lạc (12) quan sát kính hiển vi 22 Hình 4.4 Cuống sinh bào tử bào tử khuẩn lạc (11) 23 Hình 4.5 Cuống sinh bào tử bào tử khuẩn lạc (12) 23 Hình 4.8 Khuẩn lạc nấm Nomuraea rileyi sau 30 ngày nuôi cấy 28 viii hay không, tiến hành so sánh chuỗi trình tự phần mềm CLUSTALX  Trình tự đoạn gen 28S rRNA Nomuraea rileyi Ogawa ctv công bố ATATCAATAA GGCAACAGCT CTTTTGGCGA GTCTGGTTGG CTGCTCTAAA CACAAGTAGA AATTGTTGAA CGCTGGTGCA GGGAATGTGG GGTTCGCGCA GACC GCGGAGGAAA CAAATTTGAA GGCGCCTTCC ATGCCGAGCC TGGGAGGTAT GTGATCGAAA AGGGAAGCGC CTTTGCCGGG CTCCCTCGGG TCTGCAAGGA AGAAACCAAC ATCTGGTCCC GAGTTCCCTG TCTGTAAAGC ATGTCTTCTA GATGAAAAGC TTATGACCAG CTCAGGCCAG AGTGTTATAG TGCTGGCGTA AGGGATTGCC CAGGGCCCGA GAACGGGACG TCCTTCGACG AAGCTAAATA ACTTTGAAAA ACTTGGGCCC CATCAGTTTG CCCATTGCAC ATGGTCATCA CCAGTAACGG GTTGTAATTT CCATAGAGGG AGTCGAGTAG CCGGCCAGAG GAGGGTTAAA GGTGAATCAT CCCCGGGGGA AATACCCTGG GCGACCCGTC CGAGTGAAGC GCAGAGGATG TGAGAGCCCC TTTGGGAATG ACCGATAGCG TAGTACGTGA CCAGCGTTCT TAAAGGCTTT GGCGGACTGA TTGAAACACG  Trình tự đoạn gen 28S rRNA Nomuraea rileyi Kalkar ctv công bố CAATAAGCGG ACAGCTCAAA TGGCGAGGCG GGTTGGATGC TCTAAATGGG AGTAGAGTGA GTTGAAAGGG GGTGCACTTT ATGTGGCTCC CGCGCATCTT AGGAAAAGAA TTTGAAATCT CCTTCCGAGT CGAGCCTCTG AGGTATATGT TCGAAAGATG AAGCGCTTAT GCCGGGCTCA CTCGGGAGTG GCAAGGATGC ACCAACAGGG GGTCCCCAGG TCCCTGGAAC TAAAGCTCCT CTTCTAAAGC AAAAGCACTT GACCAGACTT GGCCAGCATC TTATAGCCCA TGGCGTAATG ATTGCCCCAG GCCCGAGTTG GGGACGCCAT TCGACGAGTC TAAATACCGG TGAAAAGAGG GGGCCCGGTG AGTTTGCCCC TTGCACAATA GT TAACGGCGAG TAATTTGCAG AGAGGGTGAG GAGTAGTTTG CCAGAGACCG GTTAAATAGT AATCATCCAG GGGGGATAAA CCCTGGGGCG TGAAGCGGCA AGGATGCTTT AGCCCCGTCT GGAATGCTGC ATAGCGCACA ACGTGAAATT CGTTCTCGCT GGCTTTGGGA GACTGAGGTT Kết so sánh CLUSTALX cho thấy có tương đồng hồn tồn trình tự Với: gi>13537212:Trình tự đoạn gen 28S rRNA mẫu nấm số 12 gi>13537211:Trình tự đoạn gen 28S rRNA mẫu nấm số 11 gi>13537217:Trình tự 28S rRNA Nomuraea rileyi Kalkar ctv công bố (2005) gi>674822882:Trình tự 28S rRNA Nomuraea rileyi Ogawa ctv công bố 2000 Như mẫu nấm thuộc chủng Nomuraea rileyi 26 4.1.4 Tốc độ phát triển nấm Nomuraea rileyi môi trường PGA Nấm nuôi cấy nhiệt độ 25 - 270C môi trường PGA đĩa petri Quan sát đo đường kính vòng phát triển sợi nấm Kết đo liên tục từ ngày nuôi cấy đến ngày thứ 30 với khoảng thời gian - ngày/lần đo Với đường kính khoanh nấm cấy đĩa vào ngày khoảng 0,2 - 0,3 cm, sau 40 ngày sợi nấm phát triển gần hết diện tích mặt đĩa với đường kính trung bình 6,03 cm Tốc độ phát triển trung bình chủng nấm khoảng 0,16 cm/ngày Thời gian sinh bào tử nấm môi trường thạch khoai tây sau 30 ± ngày, bề mặt tản nấm có màu xanh nhạt Bảng 4.1 Kích thước tản nấm đo mơi trường thạch PGA Đường kính (cm) Ngày sau cấy Min Max Giá trị trung bình (cm) 0,2 0,3 0,15 0,5 0,74 1,5 1,55 12 1,8 2,6 2,24 16 2,1 3,2 2,83 20 4,3 3,58 24 3,2 4,8 4,21 28 3,5 5,8 4,77 32 4,7 5,16 35 6,5 5,59 37 5,4 6,7 6,03 27 Hình 4.8 Khuẩn lạc nấm Nomuraea rileyi sau 30 ngày nuôi cấy 4.1.5 Thành phần axít amin mẫu tằm vơi Kết phân tích phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC viện Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Theo kết phân tích mẫu tằm vơi có hàm lượng Alanin cao 88,93 mg/g sau Glycine với 70,84 mg/g, Serine 58,43 mg/g Mẫu tằm vơi có 7/8 axít amin thiết yếu cần thiết phải bổ sung cho thể người: Isoleucine 45,98 mg/g, Valine 19,23 mg/g, Leucine 6,20 mg/g, Threonine 4,91 mg/g, Lysin 3,85 mg/g, Phenylalanine 3,58 mg/g Methionine 3,54 mg/g Ngồi axít amin khác có hàm lượng từ 7,53 mg/g đến 43,25 mg/g 28 Bảng 4.2 Thành phần axít amin mẫu tằm vơi Thành phần axít amin Hàm lượng (mg/g) Asparagine Glutamine Serine Glycine Histidine Arginine Threonine Alanine Proline Tyrosine Valine Methionine Cysteine Isoleucine Leucine Phenylalanine Lysin 43,25 34,24 58,43 70,84 9,79 16,70 4,91 88,93 10,50 33,62 19,23 3,54 7,53 45,98 6,20 3,58 3,85 4.2 Thảo luận Mẫu tằm bệnh thu thập có đặc điểm giống với mơ tả tằm vơi, tồn thân bao phủ lớp nấm màu trắng, cứng giòn, vết bẻ có màu trắng xám, ruột có màu hồng Sau tiến hành phân lập nhiều lần từ tháng - 6, thu thập nhiều khuẩn lạc khác thời gian phát triển chúng chậm, dễ bị tạp nhiễm Do nhiều thời gian cho việc phân lập giữ vài khuẩn lạc Hầu hết khuẩn lạc có chung đặc điểm tản nấm trắng mịn, xốp, nhô lên cao so với bề mặt tản nấm, mọc lan rộng tạo vân tròn, tiết sắc tố vào môi trường nuôi cấy, tạo vết nứt môi trường thạch Trong số khuẩn lạc nấm phân lập tập trung ý vào khuẩn lạc (11), (12) phân lập sớm nhất, có bào tử hình thành dễ dàng cho việc quan sát so sánh với khóa phân loại Một số khuẩn lạc bị mất, số phân lập chưa hình thành bào tử quan sát thấy hệ thống sợi nấm chằng chịt, không thấy đặc điểm cấu trúc cuống sinh bào tử, bào tử 29 chưa thể định danh Quan sát hình thái khuẩn lạc (11), (12) tơi nhận thấy chúng có đặc điểm giống Hình dạng sợi nấm thấy suốt, nhỏ mọc đan xen nhau, có vách ngăn Khi có bào tử xuất thường xen kẽ với hệ thống sợi nấm chằng chịt môi trường nuôi cấy Cuống sinh bào tử nhỏ, suốt, có vách ngăn, có hay thể bình mọc xung quanh sinh bào tử có dạng chuỗi mắc xích Bào tử nhẵn, suốt khơng vách ngăn, thường có dạng hình elip hay hình trụ, đường kính đo x µm So sánh với khóa phân loại cho thấy khuẩn lạc có đặc điểm gần giống với chủng Nomuraea rileyi (tên trước gọi Beauveria rileyi) Beauveria bassiana định danh Nomuraea rileyi có sợi nấm sinh dưỡng nhỏ, nhẵn có vách ngăn, suốt, đường kính 2,0 - 3,0µm Cuống bào tử đính thẳng đứng có vách ngăn cuống bào tử đính mang hay thể bình mọc xung quanh cuống Thể bình 4,7 - 6,5 x 2,3 - 3,0 µm thường hình trụ ngắn, đơi phình đáy Bào tử dạng chuỗi hạt, hình trái xoan, hình trụ hay gần vậy, bề mặt nhẵn, bào tử màu xanh nhạt, sinh khối màu xanh 3,5 - 4,5 x 2,0 - 3,1 µm Còn Beauveria bassiana tế bào sinh bào tử hình bình, hình chữ Z, bào tử trần hình cầu (đường kính - µm) Sợi nấm hình ngang khoảng - µm phát triển dày đặt môi trường, mang nhiều cuống sinh bào tử bào tử Với quan sát hình thái chúng tơi nhận định sơ chủng nấm phân lập Nomuraea rileyi Để xác định lại điều hai mẫu phân lập (5) (6) đưa xác định trình tự rRNA 28S Chủng (5) có trình tự tương đồng với 100% trình tự rRNA 28S Nomuraea rileyi strain: IFO 8560 Ogawa, H., Sugiyama, J Sugawara, H., 2000 vị trí nucleotid thứ 372 - 559, chủng (6) tương đồng 100% trình tự rRNA 28S Nomuraea rileyi Kalkar, O., Carner, G.R., Scharf, D Boucias, D.G., 2005 vị trí nucleotid thứ 369 - 575 Tiếp theo tiến hành khảo sát đặc điểm sinh trưởng khuẩn lạc nấm phân lập Ban đầu thử khảo sát nhiệt độ 200C nhiệt độ phòng thí nghiệm 25 - 270C xong nhận thấy khơng có khác biệt lớn Do chúng tơi theo dõi tốc độ sinh trưởng phát triển, thời gian hình thành bào tử, quan sát đặc điểm hình thái sợi nấm, bào tử,…trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm Kết cho thấy tốc độ phát triển nấm chậm, so với kích thước khoanh nấm ban đầu cấy vào đĩa petri, mức độ phát triển tản nấm sau 40 ngày gấp 43,87 lần, trung bình ngày phát triển 0,16 cm Do thời gian nấm phát triển môi trường nhân tạo 30 chậm nên sau thời gian khoảng 15 - 20 ngày, chúng thường bị nhân tố vi sinh khác mọc lấn át Thời gian hình thành bào tử chậm sau khoảng 30 ± ngày nuôi cấy Trong 15 ngày nuôi cấy nhiệt độ 250C, Sonai Rajan Muthukrishnan (2010) báo cáo đường kính phát triển chủng nấm Nomuraea rileyi môi trường Potato maltoza agar (PMA) đạt 4,45 cm (PDBC isolate), 4,4 cm (LOCAL isolate), 4,316 cm (DOR isolate) trung bình tăng khoảng 0,29 cm/ngày Còn theo quan sát chúng tơi tính khoảng 15 ngày đầu nuôi cấy tốc độ phát triển môi trường PGA đạt khoảng 0,2 cm/ngày Khả sử dụng nguồn cacbon nấm kí sinh trùng tốt từ đường đơn glucoza, đường đôi sử dụng maltoza Như môi trường PMA PGA khả cung cấp dinh dưỡng không khác nhiều Xong nhiều yếu tố ảnh hưởng nên tốc độ phát triển nấm nấm phân lập từ tằm bệnh PGA phát triển chậm điều dễ hiểu Với kết thu từ quan sát hình thái, giải trình tự đoạn gen 28S rRNA so sánh NCBI, xác định chủng nấm kí sinh gây bệnh vơi mẫu tằm thu thập Nomuraea rileyi Để xác định tằm vơi nấm Nomuraea rileyi gây có khả ứng dụng dược liệu hay không phân tích hàm lượng axít amin Kết phân tích ghi nhận từ Viện CNSH – MT phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC cho thấy mẫu tằm vơi có 17 axít amin với hàm lượng cao Trong số có 7/8 loại axít amin thiết yếu cần cho bổ sung cho thể người Lysine, axít amin cấu thành nhiều loại thuốc bổ khơng đóng vai trò bổ trợ chất dinh dưỡng mà tham gia nhiều phản ứng chuyển hóa thể để cải thiện tình trạng suy nhược chức Có khả hấp thụ canxi, giúp cho xương khỏe, chống lão hóa cột sống, trì trạng thái cân nitơ có thể, tránh tượng giãn mệt mỏi Ngồi ra, lynsine có tác dụng giúp thể tạo chất kháng thể điều tiết hormone truyền tải thông tin Thiếu lysine dẫn đến rối loạn trình tạo máu, hạ thấp số lượng hồng cầu hemoglobin, cân protein bị rối loạn có hàng loạt biến đổi gan phổi 31 Methionin axít amin cấu tạo phân tử chứa lưu hùynh có tác dụng bảo vệ đặc hiệu cho tế bào gan Còn yếu tố hướng mỡ (lipotrope), tác nhân methyl hóa sulfur hóa, ngồi có tác dụng chống nhiễm độc Methionin sử dụng yếu tố ngăn ngừa thoái hóa mỡ tế bào gan Ngồi có ảnh hưởng cụ thể vào chuyển hố lipid phosphatid gan giữ vai trò quan trọng việc ngăn ngừa chữa xơ vữa động mạch Do trước có loại biệt dược lobamin mà hoạt chất methionin thầy thuốc ưa sử dụng trường hợp cần giải độc gan Phenylalanine có chức bồi bổ não, tăng cường trí nhớ, tác động trực tiếp đến hoạt động não Ngồi ra, làm tăng lượng chất dẫn truyền xung động thần kinh, tăng tỷ lệ hấp thụ tia UV từ ánh sáng mặt trời, giúp tạo vitamin D nuôi dưỡng da Valine giúp chữa lành tế bào hình thành tế bào mới, đồng thời giúp cân nitơ cần thiết Ngồi ra, phân hủy đường glucoza có thể Isoleucine đóng vai trò sống trình phục hồi sức khỏe sau quãng thời gian luyện tập thể dục thể thao Đồng thời giúp điều tiết lượng đường máu, hỗ trợ trình hình thành hemoglobin đơng máu Leucine tương đối quan trọng trình điều chỉnh hàm lượng đường máu, trì lượng hormone tăng trưởng để thúc đẩy q trình phát triển mơ Chức threonine hỗ trợ hình thành collagen elastin - hai chất liên kết tế bào thể Ngồi ra, tốt cho hoạt động gan, tăng cường hệ miễn dịch thúc đẩy thể hấp thụ mạnh dưỡng chất Với hàm lượng axít amin cao tằm vôi nguồn cung cấp axít amin ưa chuộng bổ sung vào loại thực phẩm chức 32 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận  Phân lập định danh nấm Nomuraea rileyi gây bệnh vôi tằm dâu Bombyx mori  Xác định tốc độ phát triển nấm Nomuraea rileyi môi trường PGA thời gian hình thành bào tử  Nhận dạng hình thái sợi nấm kính hiển vi  Xác định thành phần axít amin mẫu tằm thu thập được.Với hàm lượng axít amin cao khả tằm vơi nhiễm nấm Nomuraea rileyi sử dụng làm thuốc tằm vôi nhiễm nấm Beauveria bassiana 5.2 Đề nghị  Định danh khuẩn lạc nấm lại  Lây nhiễm nấm Nomuraea rileyi lên tằm dâu  Cần khảo sát tìm hiểu thêm yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng, khả sinh bào tử nấm Nomuraea rileyi  Khảo sát thêm hoạt chất sinh học: chất kháng viêm, chất chống oxy hóa… tằm bị nhiễm Nomuraea rileyi tằm bị nhiễm Beauveria bassiana  Nghiên cứu hiệu lực diệt côn trùng để ứng dụng bảo vệ thực vật 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Ngơ Văn Tố 1996 Phòng trừ sâu hại cơng nghệ vi sinh Nhà xuất lao động Hà Nội, trang 38-42 Nguyễn Lân Dũng 1981 Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại trồng NXB khoa học kĩ thuật Hà Nội Nguyễn Ngọc Tú Nguyễn Cửu Thị Hương Giang 1997 Bảo vệ trồng chế phẩm từ vi nấm Nhà xuất Nơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh Nguyễn văn Long- Nguyễn Huy Trí- Bùi Thị Điểm- Trần Thị Ngọc 2005 Giáo trình Dâu tằm- Ong mật NXB nơng nghiệp Hà Nội Nguyễn Xuân Thành- Lê Văn Hưng- Phạm Văn Toản 2003.Giáo trình cơng nghệ vi sinh vật sản xuất nông nghiệp xử lý ô nhiễm môi trường NXB nông nghiệp Hà Nội Phạm Thị Thùy, Nguyễn Thị Bắc, Đồng Thanh, Trần Thanh Tháp, Hoàng Cơng Điền, Nguyễn Đậu Tồn 1996 Nghiên cứu cơng nghệ sản xuất ứng dụng chế phẩm nấm Beauveria Metarhizium để phòng trừ số sâu hại trồng (1991-1995) Tuyển tập cơng trình nghiên cứu BVTV 1990-1995, viện BVTV, Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Phạm Thị Thùy 2004 Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật NXB Đại học quốc gia Trần Văn Mão 2008 Sử dụng côn trùng vi sinh vật có ích (tập 2) Sử dụng vi sinh vật có ích NXB nông nghiệp Hà Nội Trần Thị Thanh 2000 Công nghệ vi sinh NXB giáo dục TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 10 Champlin F R and Grula E A 1979 Noninvolvement of Beauvericin in the Entomopathogenicity of Beauveria bassiana 11 Herta Stutz Dalla Santa, Osmar Roberto Dalla Santa, Débora Brand, Luciana Porto de Souza Vandenberghe and Carlos Ricardo Soccol 2005 Spore Production of Beauveria bassiana From Agro-Industrial Residues Special n.: pp 51-60 12 Kamp A M and Bidochka M J 2002 Conidium production by insect pathogenic fungi on commercially available agars Letter in applied microbiology 3: 74 – 77 13 Kumar, Vineet, Singh, G P., Babu, A M., Ahsan, M M and Datta, R K 1999 Germination,penetration, and invasion of Beauveria bassiana on silkworm, 34 Bombyx mori, causing white muscardine', Italian Journal of Zoology, 66: 1, 39 – 43 14 Kumar, Vineet, Singh, G P., Babu, Kumar, Virendra , Babu, A.M.and Datta, R.K 1997 Sem study on the invasion of Nomuraea rileyi (Farlow) on silkworm, shape Bombyx mori Linn causing green muscardine Volume 139, Number 3, 141 -144 15 Michael J Furlong and Judith K Pell 2001 Horizontal transmission of entomopathogenic fungi by the diamondback month Biological control 22: 288 – 299 16 Samson, R.A 1974 Studies in Mycology 6: 80-85 17 Sonai Rajan T and Muthukrishnan, N 2010 Influence of various health drinks media on growth and sporulation of Nomuraea rileyi (Farlow) Samson isolates Journal of Biopesticides, 3: 463 – 465 TÀI LIỆU INTERNET 18 Ainsworth GC (1956) Agostino Bassi, 1773-1856 Nature 177: 255-257 http://dx.doi.org/10.1038/177255a0 19 http://www.informaworld.com/terms-and-conditions-of-access.pdf 20 http://baovethucvat.net/tai-lieu/pdf/Kho-giao-trinh/HUA1-bien-phap-sinh-hoctrong-bvtv-nv-dinh.pdf 21 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC243365/ 22 http://en.wikipedia.org/wiki/Beauvericin/ 23 http://vnexpress.net/gl/suc-khoe/2004/01/3b9cee64/ 24 http://suckhoedoisong.vn/3385p0c60/bach-cuong-tam-co-cong-dung-gi.htm 25 http://www.mycobank.org/Mycotaxo.aspx? link= T&Rec=416289/ 26 http://resources.metapress.com/pdf preview.axd?code=w6721257q8238515 27 http://www.dinhduong.com.vn/story/axit-amin-doi-dieu-can-biet 28 Nguyễn Thị Lộc, 2000 Hiệu chế phẩm sinh học Beauveria bassiana http://www.agroviet.gov.vn 35 PHỤ LỤC BẢNG SỐ LIỆU ĐƯỜNG KÍNH TẢN NẤM ĐO ĐƯỢC 4nsc 0,7 0,7 0,7 0,8 0,8 0,8 0,7 0,7 0,7 0,8 0,8 1 0,9 0,8 0,8 0,5 0,6 0,6 0,5 0,7 8nsc 12nsc 1,3 1,4 1,5 1,5 1,4 1.5 1,5 1,5 1,4 1,6 1,6 1,8 1,8 1,5 1,7 1,4 1,5 1,4 1,4 1,7 * 2,6 2,5 16nsc Đường kính (cm) 20nsc 24nsc 28nsc 32nsc 35nsc 37nsc 6,1 40nsc * 3,2 3,2 2,6 4,3 3,9 3,2 5** 4,5 5,5* 4,9 4,8* 5,2** 5,3** 5,7 5,7 2,5 2,6 2,6 2,5 2,5 3,2 2,8 2,9 2,8 2,8 2,9 2,8 3,4* 3,7 3,7 3,3 3,8 3,5 3,6 3,6 3,5 3,4 3,5 3,4 3,6 3,8 4,1 4,2 3,8 3,2 5 3.9* 4,3 4,3 4,3 4,1 3,9 4,6 4,6 5* 4,4 4,6 5,5 4,4 4,8 5 4,5 4,6 4,2* 4,5* 5** 5,3 5,7** 5,1 5,3 4,7 4,7 5.3** 5.5** 5.4** 5** 4,8 5** 5.7** 6,1 5,4 5.5** 6,5** 5,5 5,8 5,9 5,5** 5,4 ** 5,3 * 2,1 2,1 1,9 2,4 2,6 2,4 2,2 2,3 2,3 2,2 2,3 2,3 2,4 5.7** 5,4 6,7 5,5** 6,4 6,2 6,8 6,5 (*):Sợi nấm bị tạp lồi nấm khác (**): Sợi nấm có bào tử hình thành KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN ... sinh học ứng dụng dược liệu 1.2.2 Yêu cầu Phân lập, định danh loài nấm Beauveria gây bệnh vôi tằm dâu Bombyx mori 1.3 Nội dung thực  Phân lập chủng nấm gây bệnh vôi tằm dâu Bombyx mori  Quan... nấm Beauveria gây bệnh vôi tằm dâu Bombyx mori Hướng ứng dụng dược liệu thực đặt tảng để tiến hành xây dựng quy trình lây nhiễm nấm Beauveria tằm dâu Bombyx mori ứng dụng sản xuất nguồn dược liệu. .. BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NẤM Beauveria GÂY BỆNH VÔI TẰM DÂU Bombyx mori HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC LIỆU Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS LÊ THỊ DIỆU