Phân lập một số chủng nấm đảm có khả năng sinh laccase và nghiên cứu tiềm năng ứng dụng laccase trong oxy hóa các hợp chất s phenolic và một số hợp chất ô nhiễm vòng thơm

VIN I HC M H NI KHOA CễNG NGH SINH HC - KHểA LUN TT NGHIP TI: PHN LP MT S CHNG NM M Cể KH NNG SINH LACCASE V NGHIấN CU TIM NNG NG DNG LACCASE TRONG OXY HểA CC HP CHT S-PHENOLIC V MT S HP CHT ễ NHIM VềNG THM Ngi hng dn: ThS o Th Ngc nh Sinh viờn thc tp: Bựi Th Sn Lp: 11-04 H Ni - 2015 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc LI CM N Trc tiờn, tụi xin gi li cm n chõn thnh v sõu sc ti ThS o Th Ngc nh, PGS TS ng Th Cm H, TS inh Th Thu Hng, ThS Phựng Khc Huy Chỳ, ó ch bo, quan tõm hng dn v dỡu dt tụi sut quỏ trỡnh hc tp, nghiờn cu v hon thnh lun vn, giỳp tụi cú thờm nhiu kin thc v kinh nghim quý bỏu nghiờn cu khoa hc ng thi, tụi cng xin li cm n ti KS Nguyn Duy Trung, NCS Nguyn Th Lan Anh, KS Trn Th Thu Hin, KS Nguyn Hi Võn cựng cỏc anh ch cỏn b ca nhúm nghiờn cu, cỏc nghiờn cu sinh v cỏc bn sinh viờn ang cụng tỏc v hc ti phũng Cụng ngh sinh hc tỏi to mụi trng ó tn tỡnh giỳp tụi sut quỏ trỡnh thc hin lun Tụi xin cm n cỏc thy cụ Khoa Cụng ngh sinh hc Vin i hc M H Ni, nhng ngi thy ó truyn t cho tụi nhng kin thc c bn, quý bỏu quỏ trỡnh hc ti trng Cui cựng, tụi xin gi li cm n b m, anh ch, nhng ngi thõn gia ỡnh v bn bố ó to iu kin ng viờn, giỳp tụi c v vt cht ln tinh thn thi gian qua Tụi xin chõn thnh cm n! H Ni, thỏng nm 2015 Sinh viờn Bựi Th Sn Bựi Th Sn Page ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc M U CHNG 1: TNG QUAN TI LIU 10 1.1 Laccase 10 1.1.1 Tng quan v laccase 10 1.1.2 C ch xỳc tỏc ca laccase 13 1.1.3 Mt s tớnh cht húa sinh ca laccase 16 1.1.4 ng dng ca laccase 16 1.2 Oxy húa hp cht S-phenolic bi laccase 17 1.3 Nghiờn cu s dng laccase loi mu thuc nhum 19 1.3.1 Thuc nhum 19 1.3.2 Nghiờn cu loi mu thuc nhum bi laccase t vi sinh vt 21 1.4 Nghiờn cu phõn hy cỏc cht dit c 23 1.4.2 Cht dit c 2,4,5-T 23 1.4.2 S dng vi sinh vt sinh laccase v laccase phõn hy cht dit c 24 CHNG 2: VT LIU V PHNG PHP 27 2.1 Vt liu 27 2.1.1 i tng nghiờn cu 27 2.1.2 Húa cht 27 2.1.3 Thit b, mỏy múc 27 2.2 Phng phỏp phõn lp nm m cú kh nng sinh laccase 27 2.3 Phng phỏp xỏc nh hot tớnh laccase 28 2.4 Xỏc nh kh nng sinh laccase ca cỏc chng thun khit 29 2.5 ỏnh giỏ kh nng oxy húa c cht S-phenolic bng dch enzyme thụ 30 2.6 ỏnh giỏ kh nng loi mu bng dch enzyme thụ 30 Bựi Th Sn Page ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc 2.7 ỏnh giỏ kh nng phõn hy 2,4,5 T bng dch enzyme thụ 31 CHNG 3: KT QU V THO LUN 32 3.1 Phõn lp cỏc chng nm 32 3.2 Kho sỏt kh nng sinh tng hp laccase ca cỏc chng nm 34 3.3 Kh nng oxy húa c cht S-phenolic bng dch enzyme thụ 37 3.4 Kh nng loi mu thuc nhum bng dch enzyme thụ 40 3.6 Kh nng phõn hy 2,4,5-T bng dch enzyme thụ ca FAL1 46 KT LUN V KIN NGH 48 Ti liu tham kho 50 Ph lc 53 Bựi Th Sn Page ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc Danh mc cỏc ký hiu v thut ng vit tt 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8- Tetrachlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T 2,4,5- Trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 2,4- Dichlorophenoxyacetic acid 2,4-DCP 2,4- Dicalcium Phosphate ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) DBF Dibenzofuran DD Dibenzo-p-dioxin DDT Dichlorodiphenyl Trichloroethane dl-PCBs cỏc polychlorinated biphenyl ng phng DRCs Dioxins and Related Compounds EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid HAA 3-Hydroxyanthranillic acid HBT N-hydroxybenzo-trialzone HCH Hexachlorocyclohexane HPI N-hydroxyphtaimide I-TEQ International Toxic Equivalent Lac Laccase LiP Lignin peroxidase Mediator Cht gn kt MnP Manganese peroxidase PAHs Polycyclic aromatic hydrocarbons PCB Polychlorinated biphenyl Bựi Th Sn Page ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc PCDDs polychlorinated dibenzo-p-dioxin , gi tt l dioxin PCDFs polychlorinated dibenzofuran , gi tt l furan ppm parts per million (l n v o cỏc mt tng i thp) RBBR Remazol Brilliant Blue TCDD Tetra-chloro Dibenzo-dioxin TNT Trinitrotoluene VLA Violuric Acid Danh mc cỏc bng v hỡnh minh Bng Mt s vi sinh vt cú kh nng sinh laccase/ laccase-like 11 Bng 3.1 Hỡnh thỏi khun lc 10 chng thun khit 32 Bng 3.2 Hot tớnh laccase ca hai mu M v mu C sau ngy theo dừi 47 Hỡnh 1.1 Hỡnh nh chung v khụng gian chiu ca laccase 12 Hỡnh 1.2 Trung tõm hot ng ca laccase 13 Hỡnh 1.3 C ch xỳc tỏc ca laccase 14 Hỡnh 1.4 Cỏc kiu xỳc tỏc ca laccase 15 Hỡnh 1.5 Cu trỳc mt s cht thuc nhúm S-phenolic 19 Hỡnh 1.6 Cu trỳc mt s loi thuc nhum 20 Hỡnh 1.7 Cu trỳc cht dit c 2,4,5-T 23 Hỡnh 3.1 Hot tớnh laccase ca cỏc chng nm nuụi cy trờn mụi trng PDB 35 Hỡnh 3.1 Hot tớnh laccase ca cỏc chng nm nuụi cy trờn mụi trng TSH1 35 Hỡnh 3.3 Kt qu oxy húa c cht sinapic acid ca chng nm nghiờn cu 39 Bựi Th Sn Page ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc Hỡnh 3.4 Kt qu oxy húa c cht acetonsyringone ca chng nm nghiờn cu.39 Hỡnh 3.5 Kt qu oxy húa c cht syringaldehyde ca chng nm nghiờn cu 40 Hỡnh 3.6 Kt qu loi mu Methyl Orange ca chng nm nghiờn cu 41 Hỡnh 3.7 Kh nng loi mu Methyl Orange ca chng nm nghiờn cu 41 Hỡnh 3.8 Kt qu loi mu RBBR ca chng nm nghiờn cu 42 Hỡnh 3.9 Kh nng loi mu RBBR ca chng nm nghiờn cu 42 Hỡnh 3.10 Kt qu loi mu Evans Blue ca chng nm nghiờn cu 43 Hỡnh 3.11 Kh nng loi mu Evans Blue ca chng nm nghiờn cu 43 Hỡnh 3.14 S thay i mu gia mu C v mu cha dch laccase thụ ca FAL11 sau 24h thớ nghim 45 Hỡnh 3.15 Kt qu quột ph UV-VIS ca mu M v mu i chng 46 Hỡnh 3.16 Kt qu quột ph UV-VIS ca mu M v mu i chng C 47 Bựi Th Sn Page ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc M U S ụ nhim mụi trng hin ngy cng nghiờm trng cỏc hot ng sn xut cụng nghip ca ngi c bit cú nhng hp cht hu c rt bn vng, c hi v khú phõn hy sinh t cỏc hot ng cụng nghip (nh nc thi mu thuc nhum) hoc l h qu t chin tranh (nh cht dit c/ dioxin) v.v Vic x lý nhng cht ụ nhim ny bng cỏc phng phỏp húa hc, lý hc hay húa-lý u cho thy nhng hn ch nh chi phớ cao, tn kộm, hiu qu cha cao, cha phõn hy trit , d to cỏc sn phm ph cũn c cao, khú phõn hy, gõy nguy c ụ nhim th cp Gn õy, vi s phỏt trin khụng ngng ca cụng ngh sinh hc, phng phỏp phõn hy sinh hc s dng cỏc loi enzyme ang tr thnh cụng c x lý hiu qu cao, chi phớ thp v c bit rt thõn thin vi mụi trng Trong cỏc enzyme hin ang nghiờn cu v ng dng vo x lý ụ nhim mụi trng hin nay, hng nghiờn cu enzyme ngoi bo nh laccase, manganese peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP) t cỏc chng vi sinh vt ó c quan tõm tớnh xỳc tỏc khụng c hiu ca cỏc enzyme ny, c bit l laccase bi ph c cht rt rng ca nú Laccase cựng MnP v LiP ó c chng minh cú kh nng phõn hy dioxin, PAH, cỏc thuc nhum mu v.v [3] Ngoi ra, laccase cũn c s dng nhiu lnh vc khỏc nhau, mt s ú l tham gia quỏ trỡnh chuyn húa sinh thc vt nhm to ngun nguyờn liu cho sn xut cỏc cm húa cht kin to Do ú phõn lp, tuyn chn cỏc chng vi sinh vt cú kh nng sinh cỏc loi enzyme trờn ó c nhiu nh nghiờn cu thc hin, u tiờn Trờn th gii v Vit Nam nghiờn cu v laccase ch yu trung nm m bi kh nng sinh tng hp laccase ngoi bo cao v s a dng ca chỳng Ngoi cng cú mt s cụng b v nm si cú mt t nhim cỏc cht hu c khú phõn hy c bit l khu vc cht dit c/ dioxin Tuy nhiờn, cỏc nghiờn cu ỏnh giỏ chi tit v c tớnh sinh hc v hiu qu x lớ cht ụ nhim hu c khú phõn hy ca laccase cha nhiu Xut phỏt t nhng lý trờn, ti Phõn lp mt s chng nm m cú kh nng sinh laccase v nghiờn cu tim nng ng dng laccase oxy húa Bựi Th Sn Page ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc cỏc hp cht S-phenolic v mt s hp cht ụ nhim vũng thm ó c tin hnh vi ni dung nh sau: - Phõn lp cỏc chng nm sinh tng hp laccase t mt s a phng - ỏnh giỏ kh nng oxy húa cỏc hp cht S-phenolic ca laccase t cỏc chng nm phõn lp c - ỏnh giỏ kh nng loi mu thuc nhum ca laccase thụ t cỏc chng nm trờn - ỏnh giỏ kh nng phõn hy cht dit c 2,4,5-T ca laccase thụ sinh tng hp t chng i din Bựi Th Sn Page ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc CHNG 1: TNG QUAN TI LIU 1.1 Laccase 1.1.1 Tng quan v laccase Laccase (p-benzenediol: oxygen oxidoreductase; EC 1.10.3.2) l mt nhúm cỏc enzyme a nhõn ng thuc nhúm oxidoreductase Cỏc enzyme cha ng l cofactor cú vai trũ rt quan trng nhiu phn ng ca cỏc quỏ trỡnh chuyn húa t bo sng Chỳng liờn quan trc tip n cỏc quỏ trỡnh quang hp, phosphoryl húa, cõn bng ion, d húa cỏc cht dinh dng v cỏc cht c [3] Trong phõn t laccase cú cha nguyờn t ng cú kh nng oxy húa c cht s dng phõn t oxy lm cht nhn in t Khỏc vi phn ln cỏc enzyme khỏc, laccase cú ph c cht rt a dng bao gm diphenol, polyphenol, cỏc dn xut phenol, diamine, amin thm, benzenthiol, dioxin v thm c cỏc hp cht vụ c nh iot [3] Laccase l mt enzyme ph bin t nhiờn, c tỡm thy rt nhiu cỏc loi cõy, nm, x khun v vi khun, úng nhiu vai trũ quỏ trỡnh sng ca sinh vt [11] Cỏc loi laccase tỏch chit t cỏc ngun khỏc thỡ khỏc v lng phõn t, tớnh cht glycosyl húa v tớnh cht ng hc [2] Laccase ca tng loi vi sinh vt thỡ cú mt s c tớnh riờng bit khỏc Cho n laccase vi khun rt ớt c tỡm thy nhng nhng nghiờn cu gn õy v b gene ca vi khun ó cho thy laccase cú th c phõn b rng rói vi khun [4] Ngoi ra, mt s chng x khun thuc chi Streptomyces cng cú kh nng sinh tng hp laccase ó c phõn lp nhng nm gn õy nh S coelicolor, S psamoticus [25] Tuy nhiờn, cỏc nghiờn cu cng nh ng dng ca laccase ch yu trờn i tng nm ln, cỏc i tng nh nm si, x khun v vi khun cha c nghiờn cu nhiu Mt s vi sinh vt cú kh nng sinh laccase v laccase-like (thuc nhúm Bựi Th Sn Page 10 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc C FTQ8 FTQ9 FMD2 FMD10 FAL1 FAL11 Hỡnh 3.6 Kt qu loi mu Methyl Orange ca chng nm nghiờn cu 80 Kh nng loi mu (%) 70 60 FTQ8 50 FTQ9 40 FMD2 30 FMD10 20 FAL1 FAL11 10 0' 10' 20' 30' 40' 50' 60' 1440' Thi gian Hỡnh 3.7 Kh nng loi mu Methyl Orange ca chng nm nghiờn cu Bựi Th Sn Page 41 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc C FTQ8 FTQ9 FMD2 FMD10 FAL1 FAL11 Hỡnh 3.8 Kt qu loi mu RBBR ca chng nm nghiờn cu 100 90 Kh nng loi mu (%) 80 70 FTQ8 60 FTQ9 50 FMD2 40 FMD10 30 FAL1 20 FAL11 10 0' 10' 20' 30' 40' 50' 60' 1440' Thi gian Hỡnh 3.9 Kh nng loi mu RBBR ca chng nm nghiờn cu Bựi Th Sn Page 42 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc C FTQ8 FTQ9 FMD2 FMD10 FAL1 FAL11 Hỡnh 3.10 Kt qu loi mu Evans Blue ca chng nm nghiờn cu 100 Kh nng loi mu (%) 90 80 70 FTQ8 60 FTQ9 50 FMD2 40 FMD10 30 FAL1 20 FAL11 10 0' 10' 20' 30' 40' 50' 60' 1440' Thi gian Hỡnh 3.11 Kh nng loi mu Evans Blue ca chng nm nghiờn cu Vi mu Methyl Orange, kh nng loi mu bi dch enzyme thụ t cao nht ba chng FMD10 (72,22%), FAL11 (51,55%), FTQ8 (45,62%), thp nht chng FMD2 (0,57%) sau 24h Theo mt nghiờn cu v chng nm Phanerochaete chrysosporium ca Praveen Sharma v cng s, hiu qu loi mu azo Orange II l 86,34% ti pH 5, thp hn ti pH 6-7 (69,56% v 51,42% tng ng) [19] Bựi Th Sn Page 43 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc Vi mu RBBR, kh nng loi mu ca dch laccase thụ ca chng FMD10 (84,5%), FAL11(88,94%), FAL1 (75,97%) t cao nht sau 24h, cao hn hn so vi cỏc chng nm cũn li Chng FTQ9 sinh enzyme thụ loi mu RBBR kộm nht (16,27%) chng nm Rt nhiu nghiờn cu trờn th gii ó chng minh c vic s dng laccase t nm loi mu RBBR Theo mt nghiờn cu v chng nm m Myrothecium sp IMER1 ca Juan Huang v cng s, hiu qu loi mu RBBR ca laccase thụ l 65% khong pH 5-6, thp hn 30% khong pH 8-10 [14] Kh nng loi mu RBBR ca laccase thụ c sn xut bi chng Trametes versicolour CCT-4521 c nh trờn vt liu hp ph IRA-400 tng 70% so vi laccase thụ c nh trờn cỏc vt liu thụng thng thi gian 30 phỳt Chng nm trng Trametes sp SQ01 phõn hy 97-99% thuc nhum azo v RBBR vũng ngy nuụi cy Laccase tinh sch t chng Trametes sp SQ01 (hot tớnh ban u 500 U/l) cú kh nng loi b ti 80% RBBR khong nng 50-400 ppm 30 phỳt pH 4,5, nng 1000 ppm 30% RBBR b loi b 30 phỳt[7] Laccase thụ t chng nm trng Pichia Pastoris GS115 hot tớnh ban u 600 U/l cú kh nng phõn hy RBBR t 30% n 100% cú mt Cu2+ mụi trng phn ng sau khong 2h [32] Kh nng loi mu Evans Blue ca dch enzyme thụ sinh t chng FMD10 l cao nht (88,33%), so vi cỏc chng nm dựng cựng thớ nghim, v hai chng FAL1 v FAL11 cng ó cho thy kh nng loi mu khỏ cao (80,05% v 86,57%) Dch enzyme ca hai chng FTQ9 v FTQ8 t hiu qu loi mu ny thp nht (35,74% v 37,45%) Theo mt nghiờn cu ca Jie Yang v cng s, laccase tinh sch t chng nm Cerrena sp HYB07 cú hiu sut loi mu RBBR, indigo carmine and Evans Blue cao, 100% sau khong 30 phỳt thớ nghim [13] Trong chng FTQ8, FTQ9, FMD2, FMD10, FAL1, FAL11, la chn chng nm i din sinh dch laccase thụ cú tim nng loi mu cao Chng nm c la chn l FAL11 Mu Methyl Orange s c dựng thớ nghim ny, bi õy l mt mu khú loi, nhiu chng nm sinh laccase cỏc nghiờn cu khỏc i vi Bựi Th Sn Page 44 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc mu ny cha t nhiu kt qu tt Cỏc mu thớ nghim bao gm: Control (m Tartrate Buffer + mu), M (enzyme + m Tartrate Buffer + mu) c quột ph ỏnh giỏ kh nng loi mu ca dch enzyme thụ t chng FAL11 Kt qu hỡnh 3.11 cho thy, rừ rng s gim mu bc súng 468 nm ( 470 nm) s dng enzyme thụ ca chng FAL11 x lý loi mu Hỡnh 3.14 S thay i mu gia mu C v mu cha dch laccase thụ ca FAL11 sau 24h thớ nghim 4.0 209.1 206.1 221.4 215.9 Abs 3.0 270.5 468.5 2.0 270.5 1.0 468.5 0.0 200.0 Bựi Th Sn 250.0 300.0 350.0 400.0 450.0 500.0 550.0 600.0 650.0 700.0 750.0 800.0 nm Page 45 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc Hỡnh 3.15 Kt qu quột ph UV-VIS ca mu M v mu i chng Mu i chng Mu cú enzyme ca chng FAL11 Vy dch enzyme chng FAL11 cú kh nng loi mu Methyl Orange lờn ti 61,11%, Methyl Orange l mt mu khú phõn hy sinh hc v cha cú nhiu nghiờn cu thnh cụng Theo mt nghiờn cu loi mu ca Isabel Pardo v cỏc cng s, sau 3h tin hnh thớ nghim, nhúm nghiờn cu ó thu c kt qu l 10 mU laccase t chng nm men Saccharomyces cerevisiae cú kh nng loi mu Methyl Orange 50 àM vi hiu qu l 10% sau 3h [12] iu ny ó chng t tim nng cao ca laccase sinh t chng FAL11 ng dng vo cụng ngh x lý loi mu nc thi dt nhum 3.6 Kh nng phõn hy 2,4,5-T bng dch enzyme thụ ca FAL1 FAL1 c la chn tin hnh thớ nghim ỏnh giỏ kh nng phõn hy cht dit c 2,4,5-T Hai mu thớ nghim M v C sau ngy xỏc nh s thay i hot tớnh laccase, kt qu trỡnh by ti bng 3.2 Bng 3.2 Hot tớnh laccase ca hai mu M v mu C sau ngy theo dừi Thi gian (ngy) Mu C (U/l) Mu M (U/l) - 2890 - 2592 - 2087 - 1781 - 1234 - Bựi Th Sn : Khụng cú hot tớnh Page 46 ỏn tt nghip 4.0 Abs 3.5 Khoa Cụng ngh sinh hc 239.6 3.0 289.1 2.5 2.0 234.0 1.5 206.3 1.0 207.6 278.4 0.5 0.0 190.0 200.0 210.0 220.0 230.0 240.0 250.0 260.0 270.0 280.0 290.0 300.0 310.0 320.0 330.0 340.0 350.0 360.0 370.0 380.0 390.0 400.0 nm Hỡnh 3.16 Kt qu quột ph UV-VIS ca mu M v mu i chng C Mu i chng Mu cú enzyme ca chng FAL1 Da trờn kt qu quột ph thu c, dch enzyme thụ ca chng FAL1 cú kh nng phõn hy cht dit c 2,4,5-T vi hiu qu l khong (71,2%) sau ngy Theo mt nghiờn cu ca Marco-Urrea v cỏc cng s, dch enzyme laccase tinh sch t chng nm Trametes versicolor ó t hiu qu phõn hy 10 mg/l 2,4,5-T l 34% sau 15 phỳt [23] Ngoi ra, laccase t chng nm Rhizoctonia praticola c thớ nghim phõn hy cỏc hp cht phenolic gõy ụ nhim nh 2,4-D v 2,4,5-T, nhng kt qu phõn hy 2,4,5-T bi laccase t chng ny khụng cú hiu qu(theo Bollag v cng s)[23] T ú, dch enzyme thụ t chng FAL1 cú tim nng cao ng dng phõn hy cht dit c núi riờng, cng nh cỏc hp cht vũng thm gõy ụ nhim khỏc, cha t hiu qu ti a Bựi Th Sn Page 47 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc KT LUN V KIN NGH Kt lun T cỏc nghiờn cu ỏn ln ny, cú th rỳt mt s kt lun: ó phõn lp v sng lc c 10 chng nm cú kh nng sinh tng hp laccase t cỏc khu vc a lý khỏc nhau: FBV311 t rng quc gia Ba Vỡ (H Ni); FMD2, FMD10 t rng Mó (ng Nai); FAL1, FAL11 t i Tht Bm - A Li (Tha Thiờn Hu); FTQ1, FTQ8, FTQ9 t Tuyờn Quang; FPT38, FPT48 t rng quc gia Xuõn Sn - Phỳ Th Trờn mụi trng PDB, hot tớnh laccase cao nht sinh t hai chng FAL11 (2.456 U/l) v FTQ8 (2.324 U/l), thp nht l hai chng FPT38 (25 U/l) v FPT48 (112 U/l) sau ngy nuụi cy Trờn mụi trng TSH1, sau 13 ngy nuụi cy, hai chng FTQ8 v FAL11 sinh laccase hot tớnh cao nht: 30.933 v 28.385 U/l; hai chng thp nht l FPT48 (100 U/l) v FBV311 (156 U/l) FMD10 v FAL1 cú hiu qu oxy húa tt vi c c cht S-phenolic l sinapic acid, acetonsyringone, syringaldehyde, ú FAL cú kh nng oxy húa rt tt vi c cht sinapic acid (bin thiờn OD cao nht ch sau 20 phỳt 1,922) Enzyme thụ hot tớnh 1000 U/l t cỏc chng FMD10 v FAL11 t hiu qu loi ba mu cựng nng ban u 20 àM, cao nht: vi Methyl Orange l 72,22% v 51,55%; vi RBBR l 84,5% v 88,94%; vi Evans Blue l 88,33% v 86,57% Dch enzyme thụ ca chng FAL1 cú kh nng phõn hy cht dit c 2,4,5-T nng ban u 33 ppm vi hiu sut 71,2% sau ngy Kin Ngh Phõn loi ca cỏc chng FMD10, FAL1, FAL11 Bựi Th Sn Page 48 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc Nghiờn cu tỡm iu kin sinh tng hp laccase thớch hp ca chng FAL1, FAL11, FMD10 Nghiờn cu cỏc c tớnh sinh húa ca laccase t chng FAL1 v FAL11 Tinh sch enzyme t chng FAL1 v FAL11 ng dng vo cỏc nghiờn cu sõu hn nhm x lý nc thi thuc nhum v cht dit c/ dioxin Bựi Th Sn Page 49 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc Ti liu tham kho Ti liu ting Vit Chõu Ngc ip (2010), Nghiờn cu la chn iu kin thớch hp n kh nng sinh enzyme ngoi bo manganese peroxidase, phõn hy thuc nhum t chng nm si Aspergillus sp FBH11, Lun thc s sinh hc, pp 6-13 o Th Ngc nh (2009), Nghiờn cu phõn loi, kh nng phõn hy DDT v sinh laccase ca chng nm si phõn lp t t ụ nhim hn hp thuc tr sõu, Lun thc s sinh hc, pp 28-38 Nguyn Nguyờn Quang (2010), Phõn lp v nghiờn cu kh nng chuyn húa mt s cht a vũng thm ca nm si sinh tng hp enzyme laccase t t nhim cht dit c/ dioxin, Lun thc s sinh hc, pp 5-32 Ti liu ting Anh Alexandre G, Zhulin IB (2000), Laccases are widespread in bacteria, Trends Biotechnol Vol 18, Issue 2, 4142 Bunge, M., Adrian, L., Klaus, A., Opel, M., Lorenz, W.G., Andresen, J.R., Gorisch, H., Lechner, U (2003), Reductive dehalogenation of chlorinated dioxins by an anaerobic bacterium, Nature 421: 357-360 Chawachart, N., Khanongnuch, C., Watanabe, T and Lumyong, S (2004), Rice bran as an efficient substrate for laccase production from thermotolerant basidiomycete Coriolus versicolor strain RC3, Fungal Diversity 15: 23-32 Fabien Durand, Sộbastien Gounel, Christian H Kjaergaard, Edward I Solomon, and Nicolas Mano (2012), Bilirubin oxidase from Magnaporthe oryzae: an attractive new enzyme for biotechnological applications, Appl Microbiol Biotechnol Vol 96(6), pp 14891498 Bựi Th Sn Page 50 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc Field JA, S.-A.R (2008), "Microbial degradation of chlorinated dioxins", Chemosphere 71: 1005-1018 Hadibarata T., Y.A.R.M., Kristanti R.A (2012), "Decolorization and meabolism of Anthraquionone-type dye by laccase of white-rot fungi Polporus sp S133", Water Air Solid Pollut 233: 933-941 10 Haugland R.A.; Schelenm D.J ; Lyons R.P.III ; Sferra P.R; Chakrabarty A.M (1990), Degradation of the chlorinated phenoxyacetate herbicides 2,4- dichlorophenoxyacetic acid and 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by pure and mixed bacterial cultures, Appl Environ Microbiol 56, pp 1357-1362 11 Hullo M.F., M.I., Danchin A., Martin-Verstraete I (2001), CotA of Bacillus subtilis is a copper-dependent laccase ", J Bacteriol 183(18): 5426-5430 12 Isabel Pardo, Xiomara Chanagỏ, Ana Isabel Vicente, Miguel Alcalde and Susana Camarero (2013), New colorimetric screening assays for the directed evolution of fungal laccases to improve the conversion of plant biomass, BMC technology Vol 13(90) 13 Jie Yang, Qi Lin, Tzi Bun Ng, Xiuyun Ye and Juan Lin (2014), Purification and Characterization of a Novel Laccase from Cerrena sp HYB07 with Dye Decolorizing Ability, Journal PLoS One vol 9(10) 14 Juan Huang, Yun Fu and Youxun Liu (2014), Comparison of Alkali-Tolerant Fungus Myrothecium Sp IMER1 and White-Rot Fungi for Decolorization of Textile Dyes and Dye Effluents, Journal of Bioremediation & Biodegradation Vol 5(3) 15 Kunamneni, A Camareno, S , Garcia-Burgos, C., F.J Ballesteros, A and Alcalde M (2008), Engineering and Application of fungal laccase for organic synthesis, Micro Cell Fact, 7(32), pp 1-17 16 McMullan, G., Meehan, C., Conneely, A., Nirby, N., Robinson, T., Nigam, P., Banat, I.M., Marchant, S.W.F (2001), "Mini review: microbial decolorization and degradation of textile dyes", Appl Microbiol Biotechnol 56: 8187 Bựi Th Sn Page 51 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc 17 Morozova, O.V., Shumakovich, G.P., Gorbacheva, M.A., Shleev, S.V and Yaropolov, A.L (2007), Blue Laccase, Biochemistry (Moscow), 72(10), pp 11361150 18 Porto de Souza Vandenberghe, Juliana Silveira Valle, Porto de Souza Vandenberghe , Thiago Teodoro Santana , Giani Andrea Lindel , Nelson Barros Colauto and Carlos Ricardo Soccol (2014), Optimization of Agaricus blazei laccase production by submerged cultivation with sugarcane molasses, African Journal of Microbiology Research, pp 941-943 19 Praveen Sharma, Lakhvinder Singh and Neeraj Dilbaghi (2009), Biodegration of Orange II dye by Phanerochaete chrysosporium in simulated wastewater, Journal of Scientific and Industrial Research Vol 68, pp 157-161 20 Rani C., J.A.K., Bansal A (2011), "Studies on the biodegradation of azo dyes by white rot fungi Daedalea flavida in the absence of external carbon source", International Conference on Environmental Science and Technology 6(2): 147-150 21 Ruggaber, T.P and Talley, J.W (2006), Enhancing bioremediation with enzymatic processes: A review pratice periodical of hazardous, toxic, and Radioactive, Waste Management, 10(2), pp 73-85 22 Ryan TP, B.J (1989), "Biodegradation of 2.4.5-trichlorophenoxyacetic acid in liquid culture and in soil by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium", Appl Microbiol Biotechnol 31(3): 302-3072.1.1 22 Selvam K., S.P.M (2012), "Biological treatment of azo dyes and textile industry effluent by newly isolated white rot fungi Schizophyllum commune and Lenzites eximia", Int Biodet Biodeg 2(4): 1926-1935 23 Serap Gedikli, Pinar Aytar, Arzu ĩnal, Mustafa Yamaỗ, Ahmet ầabuk, Nazif Kolankaya (2010), Enhancement with inducers of lacasse production by some strains and application of enzyme to dechlorination of 2,4,5-trichlorophenol, Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458, pp 2-12 Bựi Th Sn Page 52 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc 24 Sergio Riva (2006), Laccase: Blue laccase for green chemistry, Trends in Biotechnology, 24(5), pp 219-226 25 Tereza Skỏlovỏ et al (2009), The Structure of the Small Laccase from Streptomyces coelicolor reveals a Link between Laccases and Nitrite Reductases, Journal of Molecular Biology Volume 385, Issue 4, 1165-1178 26 Top E M , Holben W.E and Jorney E J (1995), Characterization of Diverse 2,4 Dichlorophenoxyacetic Acid - Degradation Plasmids Isolated from Soil by Complementation , Applied and Environment Microbiology, Vol 61, No.5, pp 16911698 27 Vernekar Madhavi and S S Lele (2009) Laccase properties, use, BioResources 4(4), pp 1694-1717 28 Vroumsia T, S.R., Seigle-Murandi F, Benoit-Guyod JL, Groupe pour IEtude du Devenir des Xenobiotiques dans IEnvironment (GEDEXE) (2005), Fungal bioconversion of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 2,4-dichlorophenol (2,4DCP)", Chemosphere 60: 1471-1480 29 Wang, J.W., Wu, J.H., Huang, W.Y and Tan R.X (2006), "Laccase production by Monotospora sp., and endophytic fungus in Cynodon dactylon", Bioresource Technology 97(5): 786-789 30 Wensenberg, D., Kyriakides, I., Agathos, S.N (2003), "A review: White-rot fungi and their enzymes for the treatment of the treatment of industrial dye effluents", Biotechnol Advance 2: 161-187 31 Zhao Dan Zhao, Xi Zhang, Daizong Cui, Min Zhao (2012), Characterisation of a Novel White Laccase from the Deuteromycete Fungus Myrothecium verrucaria NF-05 and Its Decolourisation of Dyes, Plublic Library of Science, 7(6), p.1 32 Zhi Quan Xue, Mei Rong Hu, Ya Peng Chao, Guo Qing Zhang , Shijun Qian (2008), Laccase-mediator system in the decolorization of different types of recalcitrant dyes, Bựi Th Sn J Ind Microbiol Biotechnol, DOI 10.1007/s10295-008-0471-1 Page 53 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc PH LC Ph lc Hot tớnh laccase cỏc chng nm nuụi trờn mụi trng PDB Hot tớnh Laccase trờn mụi trng PDB (U/l) Tờn chng ngy ngy ngy ngy ngy ngy ngy ngy ngy FTQ - - - 34 122 340 480 420 314 FTQ - - 251 360 687 1211 2324 1922 1765 FTQ - - 15 61 210 429 893 610 534 FPT 38 - - - 23 78 101 112 89 78 FPT 48 - - - 12 21 25 24 19 16 FMD2 - - 234 832 1575 416 334 210 140 FMD10 - - 15 28 99 121 134 79 FAL1 - - 87 131 303 489 832 521 110 FAL11 - - 99 689 1866 1526 2456 1489 895 FBV311 - - - 23 78 156 79 56 12 Chỳ thớch (-): Khụng cú hot tớnh laccase Bựi Th Sn Page 54 ỏn tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc Ph lc Hot tớnh laccase cỏc chng nm nuụi trờn mụi trng TSH1 Hot tớnh laccase trờn mụi trng nuụi cy TSH1 (U/l) Tờn chng ngy ngy ngy ngy ngy ngy ngy 10 ngy 11 ngy 12 ngy 13 ngy 354 781 1278 1898 1789 1458 - FTQ - 34 104 214 FTQ 28 285 785 3005 10285 22750 24600 25735 30523 30933 28715 FTQ - 12 21 25 23 31 37 68 319 579 899 FPT 38 24 64 78 98 158 256 341 287 112 - - FPT 48 10 32 39 54 78 100 99 67 23 - - FMD 102 281 601 789 1047 1825 2082 12145 2012 1804 FMD 10 - 29 44 87 67 99 91 168 327 1037 2977 FAL - 11 15 43 146 1093 1368 2575 2706 3150 2672 FAL 11 54 123 165 386 2860 5531 16795 17280 25192 28385 FBV 311 21 56 100 121 156 101 58 21 - - Chỳ thớch (-): khụng cú hot tớnh Bựi Th Sn Page 55 [...]... Khoa Công nghệ sinh học enzyme oxy hóa đa nhân đồng có phổ cơ chất đa dạng và bản chất tương tự laccase) được miêu tả ở bảng 1 Bảng 1 Một s vi sinh vật có khả năng sinh laccase/ laccase- like Nấm đảm Nấm s i Xạ khuẩn Vi khuẩn Phanerochaete Melanocarpus Streptomyces Bacillus chryosponrium albomyces lavendulae licheniformis Pycnoporus Fusarium Streptomyces Bacillus halodurans cinnabarinus oxysporum pasmmoticus... Các chủng FBV311, FPT38 và FPT48 đạt hoạt tính tối đa thấp nhất trong s 10 chủng nấm nghiên cứu (156, 112 và 24 U/l) Trong các nghiên cứu về laccase, nhất là laccase từ nấm, môi trường PDB đã chứng tỏ là một môi trường tối ưu để các chủng nấm sinh tổng hợp laccase cao, phục Bùi Thế S n Page 34 Đồ án tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học vụ cho các công tác nghiên cứu s u hơn Theo một nghiên cứu của Serap... độ nhạy cao Laccase còn được s dụng để tham gia phân hủy các hợp chất lignocellulose, các hợp chất phenol phát thải từ hoạt động hóa dầu, s n xuất các hợp chất hữu cơ, và các chất ô nhiễm khó phân hủy thông qua quá trình oxy hóa khử Laccase được cố định trên các vật liệu mang và hệ thống laccase – chất gắn kết tỏ ra hiệu quả trong việc chuyển hóa các chất ô nhiễm chứa phenol và các hợp chất dẫn xuất... cỏ/dioxin và các chất tương tự dioxin đã được phân lập và nghiên cứu ngày càng s u về tính đa dạng, sinh thái và sinh học phân tử của các loài vi sinh vật này Các nghiên cứu chỉ ra có 4 cơ chế phân hủy và chuyển hóa dioxin khác nhau [26]: (1) Các enzyme hydrocarbon oxygenase oxy hóa cắt vòng thơm nhờ các vi sinh vật hiếu khí (2) Loại halogen của các s n phẩm cắt vòng bởi các vi sinh vật hiếu khí (3) Phân. .. chứng tỏ đặc tính oxy hóa sinh học càng cao của laccase sinh tổng hợp từ vi sinh vật đó, nhất là các chủng nấm đảm Các hợp chất S- phenolic được s dụng trong nghiên cứu s ng lọc các dòng laccase đột biến theo hướng ứng dụng trong phân hủy lignocellulose đã được tiến hành Phương pháp này giúp giảm thiểu thời gian cũng như tập trung khư trú thẳng vào mục đích nhằm s ng lọc nhanh chủng vi sinh vật sinh. .. như hợp chất PAH, PCB, thuốc nổ TNT trong khai khoáng, quân s , thuốc trừ s u DDT, HCH v.v, thuốc diệt cỏ (2,4-D, 2,4,5-T) dùng trong nông nghiệp[3][21][27] 1.2 Oxy hóa hợp chất S- phenolic bởi laccase Laccase xúc tác cho quá trình oxy hóa nhiều cơ chất phenol và các hợp chất thơm khác dưới điều kiện có oxy không khí Laccase từ nấm, đặc biệt từ các chủng nấm đảm Basidiomycetes tỏ ra có nhiều ứng dụng trong. .. pasmmoticus Rhizotononia solani Aspergillus Streptomyces Thermus nidulans viridosporus thermophilus Trichoderma Streptomyces Bacillus subtilis harzianum coelicolor Trametes vesicolor Trametes solani Aspergillus niger Lentinula edodes Aspergillus terreus Tuy nhiên, ở nấm thì laccase được nghiên cứu và khảo s t rất kỹ, đặc biệt là laccase từ nhiều đại diện thuộc 3 ngành nấm là: Ascomycetes, Deuteromycetes và. .. lạc của 10 chủng trên được thể hiện trên bảng 3.1 Các chủng nấm trên đều cho màu nâu đỏ đặc trưng khi s ng lọc laccase và peroxidase trên môi trường thạch đĩa có bổ sung Guaiacol 0,01 %, cho thấy các chủng này đều có khả năng sinh laccase hoặc manganese peroxidase hoặc lignin peroxidase Thí nghiệm s ng lọc khả năng sinh laccase được tiến hành để chọn những chủng nấm có khả năng sinh laccase với hoạt... triển vào cuối thập niên 40 của thế kỷ XX và s dụng trong nông nghiệp 2,4,5-T là chất có độc tính mạnh, gây ung thư dị thai, rối loạn nội tiết, nhiễm độc tuyến sinh dục và nhiều bệnh nghiêm trọng khác Bùi Thế S n Page 23 Đồ án tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 1.4.2 S dụng vi sinh vật sinh laccase và laccase để phân hủy chất diệt cỏ Trong thập kỷ qua, các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy chất. .. các tiểu phần S- lignin đã được Isabel Pardo và cộng s nghiên cứu Các thành phần này, vốn là cơ chất tự nhiên của laccase, có thể là mấu chốt trong s phân hủy lignocellulose dựa vào mối liên kết giữa carbonhydrats và lignin ở thành tế bào thứ cấp ở cỏ; hoặc được s dụng làm chất gắn kết hiệu quả nâng cao khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm và polymer phức hợp Khả năng chuyển hóa các cơ chất S- phenolic