KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN MỘT SỐ CHỦNG (SEROVAR) SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM PHÂN LẬP TRÊN GÀ THỊT VÀ GÀ ĐẺ TRỨNG THƯƠNG PHẨM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI – THÚ Y **************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN MỘT SỐ CHỦNG (SEROVAR) SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM PHÂN LẬP TRÊN GÀ THỊT VÀ GÀ ĐẺ TRỨNG THƯƠNG PHẨM Sinh viên thực hiện: VÕ CHẤN HƯNG Lớp : DH06DY Ngành : Dược Thú Y Khóa : 2006 – 2011 THÁNG 08/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y **************** VÕ CHẤN HƯNG KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN MỘT SỐ CHỦNG (SEROVAR) SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM PHÂN LẬP TRÊN GÀ THỊT VÀ GÀ ĐẺ TRỨNG THƯƠNG PHẨM Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sỹ Thú y Giáo viên hướng dẫn TS TRẦN THỊ QUỲNH LAN THÁNG 08/2011 i PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên thực hiện: VÕ CHẤN HƯNG Tên khóa luận: “Khảo sát diện số chủng (serovar) Salmonella gây ngộ độc thực phẩm phân lập gà thịt gà đẻ trứng thương phẩm” Sinh viên hồn thành khóa luận tốt nghiệp theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn ý kiến Hội đồng chấm bảo vệ luận văn tốt nghiệp ngày …/…/2011 Giáo viên hướng dẫn TS Trần Thị Quỳnh Lan ii LỜI CẢM ƠN ♥ Kính dâng cha mẹ Người sinh thành, nuôi dưỡng dạy dỗ cho có ngày hơm ♥ Xin trân trọng tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thị Quỳnh Lan tận tình hướng dẫn truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quí báu, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp ♥ Chân thành cảm ơn TS Trần Thị Bích Liên, BSTY Lê Thị Hà, tồn thể q thầy cán công nhân viên Khoa Chăn nuôi – Thú Y Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức chun mơn kinh nghiệm q báu cho tơi suốt thời gian học tập trường ♥ Xin chân thành cảm ơn Anh Quân, anh Mỹ, chị Hoa, anh Thành tạo điều kiện thuận lợi cho hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp ♥ Cảm ơn Các bạn Nhung, Nhẫn toàn thể bạn lớp Dược Y 32 giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập iii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Khảo sát diện số chủng (serovar) Salmonella gây ngộ độc thực phẩm phân lập gà thịt gà đẻ trứng thương phẩm” tiến hành phịng Vi Sinh, Khoa Chăn Ni – Thú Y, Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh thời gian từ tháng 01/2011 đến tháng 07/2011 Bằng phương pháp nuôi cấy phân lập huyết học, chúng tơi khảo sát 210 mẫu ngốy lổ huyệt (swab) gà thịt gà đẻ trứng thương phẩm trại chăn nuôi Kết thu sau: Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella gà trại biến động từ % đến 15,91 % Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella gà thịt 11,36 % gà đẻ trứng thương phẩm 1,64 % 100 % Salmonella phân lập qua nuôi cấy ngưng kết dương tính với kháng huyết Salmonella đa giá OMA 94,74 % Salmonella phân lập xác định Salmonella Typhimurium, 5,26 % Salmonella phân lập chưa xác định chủng Các chủng Salmonella Typhimurium nhạy cảm với norfloxacin, bactrim ciprofloxacin; đề kháng cao với amoxicilin, tetracyclin, cephalexin colistin Đặc biệt có chủng Salmonella Typhimurium đề kháng từ đến loại kháng sinh (77,77 %) iv MỤC LỤC Trang Trang tựa i Phiếu xác nhận giáo viên hướng dẫn ii Lời cảm ơn iii Tóm tắt .iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách bảng ix Danh sách hình x Danh sách biểu đồ xi Danh sách sơ đồ xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI 1.3 YÊU CẦU Chương TỔNG QUAN 2.1 SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN SALMONELLA 2.1.1 LỊCH SỬ VÀ PHÂN BỐ VI KHUẨN SALMONELLA 2.1.2 PHÂN LOẠI 2.1.3 ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN SALMONELLA 2.1.3.1 Hình thái học 2.1.3.2 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.3.3 Đặc tính sinh hóa 2.1.3.4 Sức đề kháng 2.1.3.5 Cấu trúc kháng nguyên độc tố 2.1.3.6 Tính gây bệnh 2.1.3.7 Sự phân bố lây nhiễm v 2.2 BỆNH DO VI KHUẨN SALMONELLA GÂY RA 10 2.2.1 BỆNH DO VI KHUẨN SALMONELLA GÂY RA TRÊN GIA CẦM 10 2.2.1.1 Truyền nhiễm học 10 2.2.1.2 Cơ chế sinh bệnh 11 2.2.1.3 Triệu chứng 12 2.2.1.4 Bệnh tích 12 2.2.2 NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO MỘT SỐ CHỦNG SALMONELLA GÂY RA TRÊN NGƯỜI 13 2.2.2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm Salmonella 13 2.2.2.2 Cơ chế gây ngộ độc 14 2.2.2.3 Triệu chứng lâm sàng 15 2.2.2.4 Phòng điều trị bệnh 15 2.4 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGOÀI NƯỚC 17 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 19 3.1.1 THỜI GIAN 19 3.1.2 ĐỊA DIỂM 19 3.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.4.1 NỘI DUNG 20 3.4.1.1 Vật liệu 20 3.4.1.2 Phương pháp tiến hành 20 3.4.1.3 Chỉ tiêu theo dõi 23 3.4.2 NỘI DUNG 24 3.4.2.1 Vật liệu 24 3.4.2.2 Phương pháp tiến hành 24 3.4.2.3 Chỉ tiêu theo dõi 25 3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 25 vi Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN SALMONELLA 26 4.1.1 Kết phân lập Salmonella theo khu vực lấy mẫu (trại) 26 4.1.2 Kết phân lập Salmonella theo loại gà 27 4.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH SALMONELLA SPP BẰNG KHÁNG HUYẾT THANH SALMONELLA ĐA GIÁ OMA 31 4.3 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG (SEROVAR) SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 32 4.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 5.1 KẾT LUẬN 38 5.2 ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 44 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BGA : Brilliant Green Agar BGS : Brilliant Green Agar bổ sung Sulphamandelate BSA : Bismuth Sulfite Agar CDC : Centers for Disease Control and Prevention CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute c-AMP : cyclo adenosine - monophosphate c-GMP : cyclo guanosine - monophosphate ctv : cộng tác viên ECDC : European Centre for Disease Prevention and Control EFSA : European Food Safety Authority FAO : Food and Agriculture Organization FDA : Food and Drug Administration IMViC : Indol, Methyl red, Voges – Proskauer, Citrat KIA : Kliger Iron Agar LT : Heat – Labile toxin MHA : Mueller Hinton Agar NA : Nutrient Agar NB : Nutrient Broth OIE : International Office of Epizootics RV : Rappaport Vassiliadis ST : Heat – Stable toxin XLD : Xylose Lysin Deoxycholate WHO : World Health Organization viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Đặc tính sinh hóa phân biệt lồi phụ loài Salmonella Bảng 3.1 Số lượng mẫu khảo sát 19 Bảng 3.2 Kháng huyết đặc hiệu dùng định danh Salmonella 23 Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm Salmonella theo khu vực lấy mẫu (trại) 26 Bảng 4.2 Kết xác định Salmonella spp kháng huyết Salmonella đa giá OMA 31 Bảng 4.3 Kết định danh chủng (serovar) Salmonella gây ngộ độc thực phẩm 32 Bảng 4.4 Kết kháng sinh đồ chủng Sal Typhimurium phân lập 34 Bảng 4.5 So sánh kết đề kháng Salmonella với loại kháng sinh trại sử dụng 35 ix TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Võ Thị Trà An, 2007 Kháng sinh cho vật nuôi Nhà xuất Đà Nẵng Văn Thiên Bảo, 2004 Điều tra tình hình nhiễm Salmonella spp phân bị, heo, gà Tp Hồ Chí Minh số tỉnh phía nam Luận văn tốt nghiệp Khoa Chăn Ni - Thú Y trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Tơ Minh Châu, Trần Thị Bích Liên, 2001 Bài giảng vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, trang 42 – 45 Nguyễn Thị Chinh, Nguyễn Quang Tính, Trần Thị Hạnh, 2010 Nghiên cứu số đặc tính Salmonella Typhimurium Salmonella Enteritidis đàn vịt Bắc Ninh, Bắc Giang Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, tập XVII, số 4: trang 28 – 33 Phùng Quốc Chướng, 2005 Kết kiểm tra tính mẫn cảm số thuốc kháng sinh Salmonella phân lập từ vật ni Daklak Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, tập XII, số 1: trang 47 – 53 Nguyễn Thị Diệu, 2005 Phân lập vi khuẩn Salmonella phân bồ câu huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang Luận văn tốt nghiệp Khoa Chăn Nuôi – Thú Y trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Trần Đáng, 2008 Ngộ độc thực phẩm Nhà xuất Hà Nội Trang 72 Nguyễn Ngọc Hải, Nguyễn Thị Kim Loan, 2009 Thực hành nghiên cứu vi sinh vật Nhà xuất Nơng Nghiệp Tp Hồ Chí Minh, trang 102 Hồng Hải Hóa, 1999 Chẩn đốn huyết học bệnh thương hàn gà Salmonella pullorum Salmonella gallinarum gây phản ứng ngưng kết nhanh phiến kính khu vực quận Thủ Đức – thành phố Hồ Chí Minh Luận án Thạc sĩ trường Đại học Nông Nghiệp I, Việt Nam 10 Đỗ Thụy Kim Hoàng, 2001 Xác định mục tiêu chọn lọc thích hợp phân lập giám định Salmonella Đề tài nghiên cứu khoa học, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam 40 11 Đinh Nam Lâm, 1999 Nghiên cứu vi khuẩn học tình hình nhiễm Salmonella vịt tỉnh Cần Thơ Luận án Thạc sĩ trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam 12 Nguyễn Thị Phước Ninh, 2002 Bệnh truyền nhiễm gia cầm Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, trang 36 – 39 13 Lê Anh Phụng, 2004 Bài giảng tập huấn vi trùng học đường ruột công ty NAFOVANY Long Thành Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, trang 35 14 Lý Thị Thanh Thúy, 2002 Điều tra tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella giống gà AA trại gà giống Thành phố Hồ Chí Minh Luận văn tốt nghiệp Khoa Chăn Nuôi – Thú Y trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam 15 Nguyễn Ngọc Tuân, 2007 Giáo trình vệ sinh thịt Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, trang 138 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 16 CLSI, 2010 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twentieth Information Supplement M100-S20, Vol 30, No 17 C Wray and A Wray, 2000 Salmonella in Domestic Animals First Edition CABI 463 pages 18 Robert S Breed, E G D Murray, Nathan R Smith, 1994 Bergey’s manual of determinative bacteriology Ninth Edition Lippincott Williams & Wilkins 787 pages 19 OIE, 2010 Terrestrial Manual Chapter 2.9.9 – Salmonellosis CABI Page 1267 20 Quinn P.J, Carter M E, Markey B.K, Carter G.R, 1998 Clinical veterinary microbiology Mosby 684 pages 21 Trần Thị Quỳnh Lan, 2010 Étude de l’efficacité de la vaccination Salmonella Enteritidis chez la poule pondeuse et de la protection contre l’infection 22 WHO/FAO, 2002 Risk Assessments of Salmonella in Eggs and Broiler Chickens Series ISBN 92 156229 302 pages 41 TÀI LIỆU TỪ INTERNET CDC, 2011 No Progress in Salmonella During Past 15 Years Ngày truy cập 20/6/2011 C García, J M Soriano, V Benítez, P Catalá-Gregori, 2011 Assessment of Salmonella spp in feces, cloacal swabs, and eggs (eggshell and content separately) from a laying hen farm Poultry Science 90:1581-1585 Ngày truy cập 4/7/2011 Daniel J DeNoon, 2010 Egg Recall: Frequently Asked Questions Ngày truy cập 23/6/2011 Davies R.H, Wray C, 1995 Mice as carriers of Salmonella enteritidis on persistently infected poultry units Veterinary Record 137:337-341 Ngày truy cập 4/7/2011 Đăng Trần, 2011 Quyết tâm cải thiện tình trạng an tồn vệ sinh thực phẩm Ngày truy cập 2/6/2011 EFSA/ECDC, 2011a Analysis of the baseline survey on the prevalence of Campylobacter in broiler batches and of Campylobacter and Salmonella on broiler carcasses in the EU, 2008 EFSA Journal 9(2):2017 Ngày truy cập 4/7/2011 EFSA/ECDC, 2011b The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreak in 2009 EFSA Journal 9(3):2090 Ngày truy cập 4/7/2011 Hồ Sỹ Biên, 2010 Nguyên nhân ngộ độc thực phẩm cách phòng tránh Ngày truy cập 10/6/2011 42 Health Canada, 2006 Salmonella Prevention Ngày truy cập 15/6/2011 10 Klaus Torborg, 2010 Don’t drop your salmonella guard – UK egg producers warned Ngày truy cập 4/7/2011 11 Marler Clark, 2011 About Salmonella Ngày truy cập 18/5/2011 < http://www.about-salmonella.com/> 12 MMWR Weekly, 2009 Preliminary FoodNet Data on the Incidence of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - 10 States in 2008 58(13);333-337 Ngày truy cập 18/5/2011 13 Quốc Việt, 2011 Giảm 30% số trường hợp ngộ độc thực phẩm tập thể Ngày truy cập 25/6/2011 14 Snow L.C , Davies R.H, Christiansen K.H, Carrique-Mas J.J, Wales A.D, O’Connor J.L, Cook A.J, Evans S.J, 2007 Survey of the prevalence of Salmonella species on commercial laying farms in the United Kingdom Veterinary Record 161:471-476 Ngày truy cập 4/7/2011 15 Võ Thị Hồng Mi, 2005 Các phương pháp chẩn đốn thương hàn thông dụng Ngày truy cập 23/6/2011 16 Jennifer Nelson R.D, Katherine Zeratsky R.D, 2010 Salmonella: Response to latest outbreak and recall Ngày truy cập 28/6/2011 43 PHỤ LỤC CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ DÙNG TRONG NUÔI CẤY PHÂN LẬP Nutrient Broth (NB) Thành phần Pepton 5g Beef Extract 3g Cách pha chế Cân g môi trường cho vào 1000 ml nước cất Hịa tan hồn tồn mơi trường Phân vào ống nghiệm ml đậy nút lại, sau hấp tiệt trùng autoclave 121oC 15 phút Rappaport Vassiliadis (RV) Thành phần Soya pepton 5g Sodium chloride 8g Potassium dihydrogen phosphate 1,6g Magnesium chloride 40 g Malachite green 0,04 g Cách pha chế Cân 30 g mơi trường cho vào 1000 ml nước cất Hịa tan hồn tồn mơi trường, phân vào ống nghiệm 10 ml môi trường đậy nút lại, sau hấp tiệt trùng autoclave 121oC 15 phút Brilliant Green Agar (Modified) bổ sung Sulphamandelate Thành phần cho lít mơi trường BGA ‘Lab – lemco’ powder 5g Peptone 10 g Yeast extract 3g 44 Disodium hydrogen phosphate 1g Sodium dihydrogen phosphate 0,6g Lactose 10 g Sucrose 10 g Phenol red 0,09 g Brilliant green 0,0047 g Agar 12 g Sulphamandelate (Thành phần ống bổ sung cho 500 ml BGA) Sodium sulphacetamide 500 mg Sodium mandelate 125 mg Cách pha chế Thao tác vô trùng, cân 52 g môi trường cho vào 1000 ml nước cất vơ trùng, sau đun cách thủy để hịa tan hồn tồn Cho ml nước cất vơ trùng vào ống Sulphamandelate, lắc cho tan hoàn toàn cho vào 500 ml môi trường BGA (đã làm nguội đến 50oC) Lắc đổ vào đĩa petri (khoảng 18 ml/đĩa) MÔI TRƯỜNG ĐỊNH DANH VI KHUẨN 4.1 KIA (Kligler Iron Agar) Thành phần Beef extract 3g Yeast extract 3g Peptone 15 g Sodium chloride 5g Proteose peptone 5g Lactose 10g Dextrose 1g Ferrous sulphate 0,2g Sodium thiosulphate 0,3g Phenol red 0,024g 45 Agar 15g Cách pha chế Cân 57,5 g môi trường cho vào 1000 ml nước cất Hịa tan hồn tồn mơi trường Phân vào ống nghiệm (cỡ 12mm) ml, sau đậy nút lại Tiệt trùng autoclave 121oC 15 phút Đặt ống nghiệm nghiêng khoảng 2mm 4.2 Indol Thành phần Tryptone 20g Disodium phosphate 2g Dextrose 1g Potassium nitrate 1g Agar 1g Cách pha chế Cân 25 g mơi trường cho vào 1000 ml nước cất Hịa tan hồn tồn mơi trường Phân vào ống nghiệm ml, sau đậy nút bơng lại Tiệt trùng autoclave 121oC 15 phút 4.3 MR – VP Thành phần Bufferred pepton 7g Dextrose 5g Dipotassium phosphate 5g Cách pha chế Cân 17 g môi trường cho vào 1000 ml nước cất Hịa tan hồn tồn mơi trường Phân vào ống nghiệm ml, sau đậy nút lại Tiệt trùng autoclave 121oC 15 phút 4.4 Simmons citrate Thành phần Magnesium sulphate 0,2 g 46 Amonium dihydrogen phosphate 1g Dipotassium phosphate 1g Sodium chloride 5g Sodium citrate 2g Bromothymol blue 0,08 g Agar 15 g Cách pha chế Cân 24,28 g môi trường cho vào 1000 ml nước cất Hịa tan hồn tồn môi trường Phân vào ống nghiệm ml, sau đậy nút bơng lại Tiệt trùng autoclave 121oC 15 phút Đặt phần nghiêng môi trường tới đáy ống nghiệm 4.5 Môi trường thử urê Canh pepton – glucose có urê MƠI TRƯỜNG GIỮ GIỐNG VI KHUẨN THẠCH MÁU CỪU Thành phần Sheep blood 10% Enzymatic Digest of Casein, Type H 15 g Enzymatic Digest of Soybean Meal 5g Sodium Chloride 5g Agar 15 Cách pha chế Cân 40 g môi trường cho vào 1000 ml nước cất Hịa tan hồn tồn mơi trường Tiệt trùng autoclave 121oC 15 phút Làm nguội đến 50oC, cho 10% máu cừu vào lắc cho vào đĩa petri vơ trùng (18ml/đĩa) MƠI TRƯỜNG THỬ KHÁNG SINH ĐỒ MHA (Mueller Hinton Agar) (HiMedia, M173) Thành phần Beef extract 300 g 47 Casein amino acid 17,5 g Starch 1,5 g Agar 17 g Cách pha chế Cân 38 g môi trường cho vào 1000 ml nước cất Đun cách thủy để hịa tan hồn tồn mơi trường Phân vào ống nghiệm 18 ml, đậy nút lại, hấp tiệt trùng autoclave 121oC 15 phút Sau rót vào đĩa petri (loại đĩa có đường kính 9mm) THUỐC THỬ 7.1 Thuốc thử Kovac’s Thành phần Paradimethyl aminobenzaldehyde 5g Iso – amyl alcohol 75 ml Acid chlohydride đặc 25 ml Cách pha chế Cho paradimethyl aminobenzaldehyde vào cồn để vào nước ấm 50 – 60oC, lắc đề cho tan hoàn toàn, đợi nguội, cho từ từ HCl đặc vào Bảo quản thuốc thử nhiệt độ lạnh khoảng 4oC 7.2 Thuốc thử Methyl red Thành phần Methyl red 0,1 g Ethanol (95%) 300 ml Nước cất vừa đủ 500 ml Cách pha chế Hòa tan methyl red vào cồn, sau cho nước cất vào vừa đủ 500 ml 7.3 Thuốc thử VP (Voges – Proskauer) Thành phần Dung dịch α – napthol 5g 48 alcol tuyệt đối 100 ml Dung dịch KOH 10g Nước cất 100ml CÁCH GIỬ GIỐNG VI KHUẨN SALMONELLA Giống vi khuẩn phân lập cấy chuyển qua thạch máu, 37oC 24 Dùng que cấy vòng thu hoạch khuẩn lạc cho vào eppendorf có chứa 0,5 ml glycerin 0,5 ml NB, trộn cho khuẩn lạc tách ra, trữ nhiệt độ - 20oC CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA CỦA SALMONELLA 9.1 Phản ứng Indol Nguyên tắc: Trong mơi trường canh dinh dưỡng Nutrient Broth (NB) có chứa tryptophan Một số vi khuẩn có khả sinh enzyme tryptophanse thủy phân tryptophan có mơi trường NB tạo thành indol Lượng indol sinh kết hợp với paradimethylaminobenzaldehyde thuốc thử Kowacs tạo thành rositol (có vịng màu đỏ lên mặt) Ngược lại, vi khuẩn khơng có enzyme tryptophanse khơng thủy phân tryptophan để tạo thành indol, nhỏ thuốc thử kowacs vào không tạo rositol (không có vịng màu đỏ lên mặt) Mơi trường thuốc thử Môi trường: canh dinh dưỡng Nutrient Broth (NB) có chứa pepton Thuốc thử: thuốc thử Kowacs Tiến hành: dùng que cấy vịng, thao tác vơ trùng cấy vi khuẩn Salmonella vào môi trường NB, ủ 37oC, đọc kết sau 24 nuôi cấy Kết quả: nhỏ giọt thuốc thử Kowacs vào ống môi trường nuôi cấy vi khuẩn Salmonella 37oC/24 đọc kết quả: − Khơng xuất vịng màu đỏ bề mặt mơi trường (phản ứng sinh indol âm tính) 49 9.2 Phản ứng MR (Methyl Red) Nguyên tắc: Một số vi khuẩn có khả lên men đường glucose tạo thành axit pyruvic, acid sinh lại tiếp tục chuyển hóa thành nhiều loại axit hữu khác như: axit acetic, axit lactic…và làm cho pH môi trường giảm xuống, pH chất thị màu methyl red nhỏ vào giữ màu đỏ Ngược lại vi khuẩn lên men glucose yếu không lên men glucose sử dụng peptone làm pH môi trường tăng lên, làm chất thị màu methyl red đổi từ đỏ sang vàng Môi trường thuốc thử Mơi trường: mơi trường canh dinh dưỡng có chứa 1% đường glucose (môi trường pepton glucose) Thuốc thử: Methyl Red Tiến hành: dùng que cấy vòng, thao tác vô trùng cấy vi khuẩn Salmonella vào môi trường, ủ 37oC, đọc kết sau 24 nuôi cấy Kết quả: nhỏ giọt thuốc thử methyl red vào ống môi trường nuôi cấy khuẩn Salmonella 37oC/24 đọc kết quả: − Mơi trường có màu đỏ, phản ứng MR dương tính 9.3 Phản ứng VP (Voges – Proskauer) Nguyên tắc: Một số vi khuẩn có khả lên men đường glucose tạo thành acid pyruvic, lại khơng chuyển hóa acid pyruvic thành acid hữu mà chuyển hóa thành hợp chất acetyl methyl carbinol (acetoine)… Acetoine môi trường kiềm cao bị oxy hóa thành diacetyl Diacetyl sinh kết hợp với nhóm guanin agrinin có pepeton tạo thành phức chất có màu đỏ với thuốc thử α – napthol Môi trường thuốc thử Môi trường: Môi trường canh dinh dưỡng có chứa 1% đường glucose (mơi trường pepton glucose) Thuốc thử: NaOH 40% α – napthol 10% cồn Tiến hành: Dùng que cấy vòng, thao tác vô trùng cấy vi khuẩn Salmonella vào môi trường, ủ 37oC, đọc kết sau 24 nuôi cấy 50 Kết quả: cho 0,5 ml dung dịch NaOH 40%, sau nhỏ thêm giọt α – napthol 10% vào ống môi trường nuôi cấy vi khuẩn Salmonella 37oC/24 giờ, lắc kỹ, đợi – 10 phút Mơi trường (phần phía trên) khơng có màu đỏ nhạt, phản ứng VP âm tính 10 Phản ứng Simmons citrate Ngun tắc: mơi trường có chứa hợp chất sodium citrat (Na C H O ), số vi sinh vật có khả sử dụng citrat làm thừa gốc Na+ khiến cho môi trường trở nên kiềm (pH tăng) làm cho màu chất thị xanh brommothymol có mơi trường chuyển từ xanh sang màu xanh dương Môi trường chất thị màu Môi trường: môi trường Simmons citrat Chất thị màu: xanh brommothymol Tiến hành: dùng que cấy vịng, thao tác vơ trùng cấy vi khuẩn Salmonella lên bề mặt môi trường thạch nghiêng, ủ 37oC, đọc kết sau 24 nuôi cấy Kết quả: Mơi trường có màu xanh dương (pH môi trường tăng): vi khuẩn sử dụng citrat Phản ứng citrat dương tính 11 Khả phân giải Urê Nguyên tắc: Urê tác dụng enzyme urease vi sinh vật bị phân giải tạo thành NH làm kiềm hóa mơi trường làm cho thị màu phenol red chuyển từ màu đỏ hồng sang màu đỏ cánh sen Môi trường chất thị màu Môi trường: canh pepton – glucose có urê Chất thị màu: phenol red Tiến hành: dùng que cấy vịng, thao tác vơ trùng cấy vi khuẩn Salmonella vào môi trường, ủ 37oC, đọc kết sau 24 nuôi cấy Kết quả: Môi trường có màu đỏ hồng (mơi trường khơng bị kiềm hóa): Phản ứng phân giải urê âm tính 51 Phụ lục Kết định danh chủng (serovar) Salmonella gây ngộ độc thực phẩm Kháng huyết đơn giá Mẫu Gốc O Nhóm H a b c d i g,m Chủng 1 − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − + + − − − − − − − + − B S Typhimurium − − − − − − − − − − − − Không xác định 10 11 12 Chú thích: (+): dương tính; (−): âm tính 52 Phụ lục Kết kháng sinh đồ 18 chủng Sal Typhimurium Mẫu định danh Chủng thử Nr Co Ge Ax Bt Te Cp Ci Dx 10 11 12 13 14 15 16 17 18 S S S S S I S S S S S S S S S S S S I I I R R R R I I R R I R R R R I R S S S I I I S S I S S I S S S S R S R R R R R R R R R R R R R R R S S R S I I S S S R S S S S S I S S S I S S R R R R R R R R R R R R R R S R R S S R R I R R I R I R R R I R R R R S S I S S S I S S S S S S S S S R S S I R R R R R R R R R R R R R R R R 10 11 Số loại kháng sinh bị đề kháng 5 4 5 5 Chú thích: S: nhạy cảm; I: trung gian; R: đề kháng Nr: norfloxacin; Co: colistin; Ge: gentamycin; Ax: amoxicilin; Bt: bactrim; Te: tetracyclin; Cp: cephalexin; Ci: ciprofloxacin; Dx: doxycyclin Phụ lục 3: Đường kính vịng vơ khuẩn chuẩn theo phương pháp Kirby – Bauer Kháng sinh Hàm lượng (μg) / đĩa Đường kính vịng vô khuẩn (mm) Ampicillin 10 Đề kháng ≤13 Trung gian 14 – 16 Nhạy ≥17 Gentamycin 10 ≤12 13 – 14 ≥15 Neomycin 30 ≤12 13 – 16 ≥17 Streptomycin 10 ≤11 12 – 14 ≥15 Tetracyclin 30 ≤14 15 – 18 ≥19 Bactrim 25 ≤10 11 – 15 ≥16 Colistin 10 ≤8 – 10 ≥11 Norfloxacin 10 ≤12 13 – 16 ≥17 Cephalexin 30 ≤14 15 – 17 ≥18 Doxycyclin 30 ≤10 11 – 13 ≥14 Ciprofolxacin ≤15 16 – 20 ≥21 53 (Nguồn: CLSI, 2010) Xử lý kết trắc nghiệm Chi-Square So sánh tỷ lệ nhiễm Salmonella hai trại gà thịt DT 5,00 AT 41 39,00 Total 44 5,00 37 39,00 44 Total 10 78 88 Chi-Sq = 0,800 + 0,103 + 0,800 + 0,103 = 1,805 DF = 1, P-Value = 0,179 So sánh tỷ lệ nhiễm Salmonella gà thịt gà đẻ trứng thương phẩm DT 10 5,03 AT 78 82,97 Total 88 2 6,97 120 115,03 122 Total 12 198 210 Chi-Sq = 4,915 + 0,298 + 3,545 + 0,215 = 8,973 DF = 1, P-Value = 0,003 54 ... số chủng (serovar) Salmonella gây ngộ độc thực phẩm phân lập gà thịt gà đẻ trứng thương phẩm? ?? 1.2 MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Xác định chủng (serovar) Salmonella gây ngộ độc thực phẩm nhiễm gà nhằm đóng... DANH CÁC CHỦNG (SEROVAR) SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM Với mục đích khảo sát diện chủng (serovar) Salmonella gây ngộ độc thực phẩm gà, khảo sát hướng tới hai chủng Salmonella Typhimurium Salmonella. .. Salmonella đàn gà thịt hai trại khảo sát Kết tỷ lệ nhiễm Salmonella gà thịt cao gà đẻ Gà đẻ trứng thương phẩm tiềm ẩn nguy gây nhiễm chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm cho người sử dụng trứng trứng