Phân lập một số chủng nấm sợ có khả năng chuyển hoá rơm dạ

Phân lập một số chủng nấm sợ có khả năng chuyển hoá rơm dạ từ lúa làm phân hữu cơ trồng trọt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA SƯ PHẠM BỘ MÔN SINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG CHUYỂN HÓA RƠM RẠ TỪ LÚA LÀM PHÂN HỮU CƠ TRỒNG TRỌT Chủ nhiệm đề tài: Ths. KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH Long Xuyên, tháng 9 năm 2010. TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA SƯ PHẠM BỘ MÔN SINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG CHUYỂN HÓA RƠM RẠ TỪ LÚA LÀM PHÂN HỮU CƠ TRỒNG TRỌT BAN GIÁM HIỆU LÃNH ĐẠO ĐƠN VỊ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI Long Xuyên, tháng 9 năm 2010. TÓM LƯỢC Ô nhiễm môi trường trong sản xuất nông nghiệp hiện nay đang là vấn đề cấp bách cần giải quyết. Các chế phẩm sinh học thân thiện với môi trường được sử dụng ngày càng rộng rãi và trở thành một giải pháp tối ưu trong nông nghiệp. Các chủng vi sinh vật như nấm sợi có khả năng sinh enzym ngoại bào phân giải các thành phần hữu cơ trong các phế thải nông nghiệp, đặc biệt là cellulose khó phân hủy, để làm phân bón hữu cơ là hướng nghiên cứu đang rất được quan tâm. Từ đó đề tài : “Phân lập một số chủng nấm sợi có khả năng chuyển hóa rơm rạ từ lúa làm phân hữu cơ trồng trọt” nhằm nghiên cứu về vấn đề này. Đề tài sử dụng các phương pháp nghiên cứu vi sinh thông dụng như: phân lập các chủng nấm sợi từ rơm rạ theo phương pháp phân lập trực tiếp của Uyenco, xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch, xác định hoạt độ enzym cellulase theo phương pháp định lượng đường khử bằng 3,5-dinitrosalysilic (DNS), định danh nấm sợi theo phương pháp hình thái. Kết quả nghiên cứu đã đạt được: 1. Đã phân lập được 54 chủng nấm sợi khác nhau từ rơm rạ ở các ruộng lúa thuộc 6 xã huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang. 2. Đã xác định được 100% chủng nấm sợi đều có khả năng sinh enzym cellulase. Tổng số chủng có enzym : 54/54 chiếm 100% Tuyển chọn 3 chủng có hoạt độ cellulase cao nhất trong 7 chủng được chọn ban đầu là: Đ1 (10,33mg/ml), Đ2 (9,45mg/ml), Đ4 (9,87mg/ml). 3. Ba chủng nấm sợi tuyển chọn được định danh như sau: Đ1: Trichoderma viride Đ2: Curvularia pallescens Đ4 : Trichoderma harzianum Rifai 4. Đã xác định được điều kiện MT tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của ba chủng nấm sợi Đ1, Đ2, Đ4 là: - Tỉ lệ nguồn cacbon tốt nhất là MT có tỉ lệ 6C: 4R. - pH thích hợp nhất để ba chủng nấm sinh trưởng và sinh enzym cellulase mạnh là 6-7. - Độ ẩm thích hợp nhất cho sinh tổng hợp enzym cellulase là 55% - 65%. - Nhiệt độ thích hợp nhất là 30 0 C. - Thời gian thu nhận enzym tốt nhất là 3-4 ngày 5. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của ba chủng nấm sợi Đ1, Đ2, Đ4 cho thấy chúng đều có khả năng sinh cả 4 loại enzym là cellulase, protease, amylase, kitinase và sinh kháng sinh kháng lại một số VSV gây bệnh. MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Tóm lược Mục lục Danh mục các bảng Danh mục hình Danh mục các chữ viết tắt Chương I : MỞ ĐẦU 1 1.1. Lí do chọn đề tài . 1 1.2. Mục tiêu của đề tài . 2 1.3. Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài . 2 Chương II : TỔNG QUAN 3 2.1. Rơm rạ lúa ở Việt Nam . 3 2.1.1. Thành phần, ứng dụng và tình hình sử dụng rơm rạ . 3 2.1.2. Sản xuất phân hữu cơ từ rơm rạ 4 2.2. Nấm sợi sinh enzym phân hủy rơm rạ . 5 2.2.1. Đặc điểm hình thái nấm sợi . 5 2.2.2. Đặc điểm phân loại nấm sợi 7 2.2.3. Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học của nấm sợi 7 2.3. Enzym cellulase từ nấm sợi 9 2.3.1. Khái quát về enzym . 9 2.3.2. Cellulose và enzym cellulase 9 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tạo thành enzym cellulase của nấm sợi trên MT lên men bán rắn 13 2.3.4. Ứng dụng và sản xuất enzym cellulase . 14 Chương III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17 3.1. Vật liệu . 17 3.2. Phương pháp nghiên cứu 20 3.2.1. Phương pháp phân lập mẫu theo Uyenco, 1988 . 20 3.2.2. Phương pháp bảo quản nấm sợi trên MT thạch có lớp dầu khoáng .…. 21 3.2.3. Phương pháp quan sát đại thể nấm sợi 21 3.2.4. Phương pháp quan sát vi thể nấm sợi 21 3.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzym ngoại bào của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán trên thạch…………………………….…22 3.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzym cellulase bằng phương pháp định lượng đường khử bằng 3,5- Dinitrosalycylic acid…………………23 3.2.7. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzym cellulase ………. … 24 3.2.8. Phương pháp ly trích enzym cellulase …………………………………… 25 3.2.9. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng của MT đến khả năng sinh enzym cellulase của nấm sợi………………………………. 25 3.2.10. Phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng sinh ………………………… .26 3.2.11. Phương pháp sử dụng phần mềm thống kê để xử lý số liệu thực nghiệm …………………………………………………………………… .……………26 Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ rơm, rạ lúa 27 4.1.1. Phân lập các chủng nấm sợi từ rơm, rạ lúa . 27 4.1.2. Tuyển chọn những chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase . 27 4.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và phân loại bảy chủng nấm sợi . 31 4.3. Khảo sát một số yếu tố MT ảnh hưởng đến hoạt độ cellulase của ba chủng nấm sợi . 35 4.4. Nghiên cứu đặc tính sinh học khác của ba chủng nấm sợi . 42 Chương V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 46 5.1. Kết luận 46 5.2. Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG trang Bảng 1 : Khả năng sinh enzym celllase của 54 chủng nấm sợi phân lập 28 Bảng 2 : 7 chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase cao 29 Bảng 3 : Hoạt độ cellulase của 7 chủng nấm sợi (đơn vị mg/ml) .30 Bảng 4 : Đặc điểm hình thái và phân loại của 7 chủng nấm .31 Bảng 5 : Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ enzym cellulase của 3 chủng nấm .35 Bảng 6 : Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ cellulase của 3 chủng nấm 37 Bảng 7 : Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ cellulase của 3 chủng nấm .38 Bảng 8 : Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ cellulase của 3 chủng nấm .40 Bảng 9 : Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ cellulase của 3 chủng nấm 41 Bảng 10: Khả năng tạo enzym ngoại bào của ba chủng nấm sợi .42 Bảng 11: Khả năng sinh kháng sinh của ba chủng nấm sợi .44 DANH MỤC CÁC HÌNH trang Hình 1 : Bào tử mọc ra khuẩn ty . 6 Hình 2 : KL nấm . 6 Hình 3 : Các dạng bào tử trần của nấm sợi . 6 Hình 4 : Sự tiếp hợp của nấm sợi . 6 Hình 5 : Hoạt tính enzym của nấm sợi trên MT thạch . 8 Hình 6 : Cấu trúc đơn vị cellulose . 10 Hình 7 : Liên kết hydro trong cấu trúc phân tử của cellulose 10 Hình 8 : Cấu tạo của phân tử cellulose trong không gian . 10 Hình 9 : Cấu trúc enzym cellulase trong không gian 11 Hình 10 : Cấu trúc tinh thể của endoglucanase 11 Hình 11 : Cấu trúc CBH 12 Hình 12 : Vị trí cắt exoglucanase 12 Hình 13 : Cơ chế tác động của enzym cellulase . 12 Hình 14 : Vị trí lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang 20 Hình 15 : Đồ thị hoạt độ cellulase của 7 chủng nấm sợi …… 30 Hình 16 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ1 33 Hình 17 : Hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ1 (x40) 33 Hình 18 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ2 . 33 Hình 19 : Hình dạng hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ2 (x40) . 33 Hình 20 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ4 33 Hình 21 : Hình dạng sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ4 (x40) . 33 Hình 22 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ5 34 Hình 23 : Hình dạng sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ5 (x40) . 34 Hình 24 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ8 34 Hình 25 : Hình dạng sợi nấm và đầu bông cúc chủng Đ8 (x40) 34 Hình 26 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ9 34 Hình 27 : Hình dạng sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ9 (x40) 34 Hình 28 : Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ11 . 35 Hình 29 : Hình dạng sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng Đ11 (x40) 35 Hình 30 : Đồ thị ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ cellulase của ba chủng nấm sợi . 36 Hình 31 : Đồ thị ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ cellulase của ba chủng nấm sợi . 38 Hình 32 : Đồ thị ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ cellulase của ba chủng nấm sợi . 39 Hình 33 : Đồ thị ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ cellulase của ba chủng nấm sợi . 40 Hình 34 : Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ cellulase của ba chủng nấm sợi . 41 Hình 35 : Đồ thị khả năng tạo enzym ngoại bào của ba chủng nấm sợi . 43 Hình 36 : Hoạt tính cellulase của ba chủng nấm 43 Hình 37 : Hoạt tính amylase của ba chủng nấm . 43 Hình 38 : Hoạt tính protease của ba chủng nấm 43 Hình 39 : Hoạt tính kitinase của ba chủng nấm . 44 Hình 40 : Hoạt tính kháng E. coli của ba chủng nấm . 44 Hình 41 : Hoạt tính kháng B. subtilis của ba chủng nấm . 45 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMP : Adenozin mono photphat CAP : Cataleolite gene Activator Protein CMC : Carboxymethyl cellulose CBH : Cellobiohydrolase hay Exoglucanase CBHI : Exoglucanase I CBH II : Exoglucanase II ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long DNS : 3,5-dinitrosalicylic axit Enzym : Enzyme EG : Endoglucanase EGI : Endoglucanase I EGII : Endoglucanase II KHV : Kính hiển vi KL : Khuẩn lạc MT : Môi trường PTN : Phòng thí nghiệm PGA : Potato glucose agar VSV : Vi sinh vật CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU 1.1. Lí do chọn đề tài Nấm sợi là vi sinh vật (VSV) rất đa dạng, phong phú và thích hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam. Nấm sợi có tiềm năng lớn nhất sinh các loại enzym thủy phân ngoại bào mạnh, phân giải các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong tự nhiên, cung cấp chất dinh dưỡng và năng lượng cho toàn bộ hệ sinh thái. Nghiên cứu các loại nấm sợi có khả năng sinh enzym phân hủy rác thải, phế phụ phẩm nông nghiệp thành phân bón hữu cơ sinh học là góp phần xây dựng một nền nông nghiệp sinh thái phát triển bền vững, năng suất cao và thân thiện với môi trường. Việt Nam là một nước nhiệt đới có nền nông nghiệp rất phong phú, đa dạng và đang trên đà phát triển, vì vậy, lượng phế thải nông nghiệp rất dồi dào. Xã hội ngày càng phát triển, việc sử dụng rơm, rạ làm chất đốt phục vụ sinh hoạt gia đình không còn phát huy tác dụng như trước đây. Sau khi thu hoạch lúa, người nông dân thường đốt hết rơm rạ ngay tại ruộng hoặc vứt bừa bãi trên các đường giao thông nội đồng, kênh mương gây ô nhiễm môi trường và làm ách tắc dòng chảy, rơm rạ trở thành nguồn phế thải rất lớn. Rơm của các vùng đồng bằng sản xuất lúa gạo ở Việt Nam rất nhiều, thông thường để sản xuất một tấn hạt lúa, cây lúa phải có 6 tấn rơm. Do đó, hiện nay vấn đề sử dụng nguốn phế thải nông nghiệp này như thế nào để mang lại lợi ích kinh tế cho xã hội là rất cần thiết và giảm thiểu các vấn đề ô nhiễm môi trường đã và đang xảy ra. Nhất là trong các vụ hè thu và vụ thu đông. Hiện nay sử dụng lại nguồn rơm này rất nhỏ so với lượng rơm phải bỏ đi. Thông thường nông dân phải đốt bỏ, chỉ một số ít được sử dụng lại cho việc sản xuất nấm rơm, hoặc dùng cho che phủ đất cho cây trồng cạn, cho chăn nuôi đại gia súc .Cùng với sự công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, ô nhiễm môi trường đang trở thành nguy cơ thật sự. Thành phần chính trong phế thải rắn trong sinh hoạt công, nông, lâm nghiệp là cellulose, sản phẩm của quá trình phân hủy chất hữu cơ trong phế thải là mùn có thể làm phân bón rất tốt cho cây trồng. Do đó, xử lý chất thải bằng vi sinh vật, đặc biệt là các chủng nấm sợi có khả năng sinh các loại enzym, là hướng tích cực có nhiều ưu điểm so với các phương pháp lí, hóa, cơ học, đang rất được quan tâm khai thác (Nguyễn Thị Kim Cúc, 2001). Phân bón hóa học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác bị chai sạn, thoái hóa, các loại giun đất không phát triển được, làm hạn chế độ xốp, lượng không khí cần thiết cho bộ rễ cây thiếu hụt. Ngoài ra nếu sử dụng thêm các loại thuốc trừ sâu hóa học độc hại, thì các sinh vật, VSV hữu ích cũng bị tiêu diệt theo, gây ô nhiễm cho môi trường, làm ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người trồng trọt và người tiêu thụ. Vì vậy, các nước có nền nông nghiệp phát triển trên thế giới có xu hướng sử dụng các phân bón hữu cơ sinh học, đặc biệt là phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu vi sinh có tác dụng tăng cường dinh dưỡng, độ xốp cho đất, cây trồng đồng thời có tác dụng phòng trừ các loại bệnh có hại cho cây và đảm bảo an toàn cho môi trường (theo http://www.khoamt-cnsh.co.nr) Xử lý chất thải hữu cơ bằng vi sinh vật để làm phân bón hữu cơ là hướng nghiên cứu đang rất được các nhà khoa học quan tâm vì tính ứng dụng thực tiễn rất cao. Từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên gợi ý cho tôi chọn đề tài : “Phân lập một số chủng nấm sợi có khả năng chuyển hóa rơm rạ từ lúa làm phân hữu cơ trồng trọt”, nhằm tận dụng nguồn phế thải nông nghiệp sản xuất phân bón cho cây trồng, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp sạch và bền vững, giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường. 1 [...]...1.2 Mục tiêu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ nguồn rơm rạ lúa - Xác định thành phần môi trường tối ưu sinh tổng hợp enzym cellulase 1.3 Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài - Phân lập các chủng nấm sợi từ rơm rạ lúa ở các xã thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang - Tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase cao - Nghiên... trên mặt đất, đã phân lập được 54 chủng nấm sợi khác nhau Trong đó 28 chủng phân lập từ đất mặt ruộng có rơm rạ đang phân hủy, 26 chủng phân lập được từ rơm, rạ chưa phân hủy Từ kết quả trên cho thấy ở đất ruộng sau khi thu hoạch với phần rơm, rạ lúa thải ra bỏ lại trên đồng, chứa hệ nấm sợi vô cùng phong phú Chúng phân bố rộng rãi trên tất cả các cơ chất như trên rơm, rạ tươi, đang phân hủy và cả trong... của đề tài, chỉ một số chức năng được sử dụng như: Tính đại lượng thống kê mô tả (Decriptives) và phân tích ANOVA (analysis of variance) ở mức ý nghĩa 0,05 26 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ rơm, rạ lúa 4.1.1 Phân lập các chủng nấm sợi từ rơm, rạ lúa Tiến hành lấy mẫu từ đất mặt, rơm rạ vừa thu hoạch và đang bị phân hủy trên... hoặc có vách ngang (septum) Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể (hình 2.1) Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng khuẩn lạc (KL) khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm (hình 2.2) KL nấm sợi thường có dạng hình tròn, hoặc gần tròn Bề mặt KL có thể mượt, nhẳn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng... các chủng nấm sợi có trong MT đất nhiều hơn trong rơm, rạ Điều này có thể giải thích do nấm sợi là VSV hiếu khí, do đó lớp đất mặt là nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn là xác bã rơm, rạ, động vật, vỏ xác tôm cua, cá…đang bị phân hủy Đồng thời, với điều kiện đất ruộng có lượng nước ra vào thường xuyên, lớp đất mặt luôn giữ được độ ẩm thích hợp cho các chủng nấm sợi sinh trưởng phát triển Số chủng nấm sợi... bị phân giải.Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu tím hồng nhạt Nếu nấm sợi có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt xung quanh KL hoặc lỗ khoan có chứa dịch enzym.Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu xanh tím đậm Nếu nấm sợi có hoạt tính kitinase, vùng kitin chưa bị phân giải có màu nâu đỏ nhạt - Kiểm tra hoạt tính protease: Dùng HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch Nếu nấm sợi sinh ra protease, sẽ có. .. ra, còn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia tích cực vào quá trình phân giải cellulose Các loài vi sinh vật như: Cytophaga, Cellulomonas, giống Bacillus, giống Clostridium, Aspergillus, Penicillium …(Nguyễn Đức Lượng, 2004) 2.2.1 Đặc điểm hình thái của nấm sợi Nấm sợi là VSV có nhân chuẩn Thành tế bào nấm chủ yếu cấu tạo từ kitinglucan, kitozan Hệ nấm sợi được cấu tạo bởi các sợi nấm (hypha)... Các dạng bào tử trần của nấm sợi (nguồn: internet) Sinh sản hữu tính Nấm sợi có các hình thức sinh sản hữu tính như: đẳng giao, dị giao, và tiếp hợp Ngoài ra, lớp nấm Túi và nấm Đảm sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospores) và bào tử đảm (basidiospores) Hình 4 Sự tiếp hợp của nấm sợi (nguồn: internet) 2.2.2 Đặc điểm phân loại của nấm sợi Trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm. .. Aspergillus, Penicillium còn có khả năng sinh enzym phân giải dầu mỏ và khí đốt là hợp chất có cấu tạo phức tạp và khó phân giải, góp phần xử lý ô nhiễm dầu do các tai nạn chìm tàu dầu Hình 5 Hoạt tính enzym của nấm sợi trên MT thạch - Khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi Kháng sinh là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm... xốp, phẳng, có những vết khía xuyên tâm, hoặc lồi lõm không đều Mép KL trơn, răng cưa (Nguyễn Lân Dũng, 2001) 5 Hình 1 Bào tử mọc ra khuẩn ty Hình 2 KL nấm (nguồn: internet) Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào môi trường (MT) hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm Các đặc điểm hình thái khác như có bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết, sắc tố hòa tan…, làm KL nấm sợi có tính đặc . khó phân hủy, để làm phân bón hữu cơ là hướng nghiên cứu đang rất được quan tâm. Từ đó đề tài : Phân lập một số chủng nấm sợi có khả năng chuyển hóa rơm. Phân lập một số chủng nấm sợi có khả năng chuyển hóa rơm rạ từ lúa làm phân hữu cơ trồng trọt”, nhằm tận dụng nguồn phế thải nông nghiệp sản xuất phân