- Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri.
- Dùng khoan nút chai vô trùng có d = 8 mm, khoan các khối thạch.
- Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông thấm nước, nước cất vô trùng.
- Đặt 1 hoặc 2 khối thạch trên mỗi phiến kính. Cấy một ít bào tử lên bề xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vô trùng lên trên bề mặt các khối thạch.
- Các phiến kính có khối thạch cấy nấm sợi nghiên cứu được đặt trong các hộp petri có sẳn một ít bông thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Giữ các hộp
petri này trong tủấm 3-4 ngày.
- Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch có một giọt thuốc nhuộm lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất.
- Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta được tiêu bản thứ hai.
- Dùng kính hiển vi quan sát và vẽ mô tả các đặc điểm: + Hình dạng cuống sinh bào tử.
+ Hình dạng thể bình. + Hình dạng các thể bọng.
+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn. + Đặc điểm bào tửđính.
+ Màu sắc, kích thước bào tử…
- Chụp hình trên kính hiển vi quang học ởđộ phóng đại 400-1000 lần.
3.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzym ngoại bào của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
a. Nguyên tắc.
Cho enzym tác dụng lên cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy, độ đục MT giảm, MT trở nên trong suốt. Độ lớn của phần MT trong suốt phản ánh hoạt động của enzym. Phương pháp này chỉđịnh tính enzym, chỉ đánh giá sơ bộ chứ chưa nghiên cứu sâu.
b. Tiến hành thí nghiệm.
* Phương pháp khuếch tán trên MT thạch.
- Thu dịch nuôi cấy: Lấy 10g MT nuôi cấy nấm sợi trên môi trường xốp đã ủ 3 ngày trong tủấm, sấy khô, nghiền với 100ml nước cất, ly tâm 10 phút, tốc độ quay 5000 vòng/ phút. Thu được dịch enzym thô.
- Dùng khoan nút chai vô trùng, khoan các lỗ thạch trên MT thử hoạt tính các enzym cellulase, protease, amylase, kitinase trên các đĩa petri. Dùng pipet vô trùng nhỏ
0,1ml dịch enzym vào các lỗ khoan. Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 40C trong 1- 2 giờ, sau
đó chuyển sang giữ trong tủ ấm trong 24 giờ. Sau 24 giờ dùng thuốc thử lugol, HgCl2
Bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp lại.
c. Kiểm tra kết quả
- Kiểm tra hoạt tínhcellulase, amylase, kitinase: Cả ba loại enzym này đều dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt thạch:
y Nếu nấm sợi có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ
khoan chứa dịch enzym do cellulose bị phân giải.Vùng cellulose chưa bị phân giải có
màu tím hồng nhạt.
y Nếu nấm sợi có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt xung quanh KL hoặc lỗ khoan có chứa dịch enzym.Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu xanh tím
đậm.
y Nếu nấm sợi có hoạt tính kitinase, vùng kitin chưa bị phân giải có màu nâu
đỏ nhạt.
- Kiểm tra hoạt tính protease: Dùng HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch. Nếu nấm sợi sinh ra protease, sẽ có một vòng trong suốt quanh KL hoặc quanh lỗ khoan, do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2. Vùng chứa protein chưa bị
phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng vớI HgCl2 protein bị kết tủa.
d. Đánh giá khả năng tạo enzym.
Đặt sấp hộp petri. Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d), hoặc đường kính lỗ thạch (d=8mm).
Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzym của các chủng nấm sợi. Nếu giá trị (D-d) càng lớn thì khả năng sinh enzym của nấm sợi càng cao.
Theo Mai Thị Hằng (2002) quy ước:
D-d ≥ 20mm : hoạt tính enzym mạnh D-d ≥ 10mm : hoạt tính enzym trung bình. D-d < 10mm : hoạt tính enzym yếu.
3.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzym cellulase dựa vào lượng đường khử được tạo thành (định lượng đường khử bằng 3,5- Dinitrosalicylic acid)
(Nguyễn Đức Lượng, 2003)
a. Nguyên tắc.
Hoạt động enzym được tính bằng đơn vị/ml môi trường. Đơn vị hoạt động là lượng enzym mà ở điều kiện xác định 400C, pH 5,0, sau 1 giờ phân giải cơ chất tạo thành 1mg glucoza.
Phương pháp này dựa trên việc đo mật độ quang của phức màu đỏ cam đặc trưng tạo ra giữa đường khử và thuốc thử DNS ở dước sóng 540nm .
b. Cách tiến hành
Các hóa chất cần chuẩn bị:
- Dung dịch cơ chất CMC 1%: Cân chính xác 1,0g CMC, hòa tan trong 80 ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH 5, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch đệm đến vạch và lắc đều.
- Dung dịch enzym: Pha loãng dịch enzym với dung dịch đệm Na-acetate 50 mM, pH 5,0 đến độ pha loãng thích hợp.
- Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS): hòa tan 10g DNS vào 200ml dung dịch NaOH 2M. (1)
- Sodium potassium tartrate: hòa tan 300g muối này vào 500ml nước. (2)
- Dinitrosalicylic dùng cho phản ứng: trộn (1) vào (2), thêm nước cất cho đủ 1 lít
* Dựng đường glucose chuẩn.
Hòa tan 100 mg glucose với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều, ta được dung dịch glucose nồng độ 1mg/ml. Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng sau đây:
Nồng độglucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - dd glucose 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - dd CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 - dd DNS- 2 2 2 2 2 2 2 Các ch ấ t b ổ sung (ml) - Nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4
Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh
đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đo độ hấp thu OD ở bước sóng 540 nm. Dựa vào sự tương quan giữa nồng độ glucose chuẩn và độ hấp thụ OD dựng
đường biểu diễn sự biến thiên của OD và nồng độ glucose chuẩn. Đường này là một
đường thẳng đi qua gốc tọa độ.
* Tiến hành phản ứng
- Hút 1ml dung dịch enzym cho vào ống nghiệm thử thật (ống TN), thay 1 ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH 5 đối với ống đối chứng (ĐC)
- Đặt vào bểổn nhiệt 400C/5 phút. Đồng thời ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 400C/5 phút.
- Sau đó, thêm 1 ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzym và lắc
đều. Để phản ứng ở 400C chính xác 10 phút.
-Thêm 2 ml dung dịch DNS, lắc đều để phản ứng enzym.
- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát.
- So màu ở bước sóng 540nm, dựa theo đường glucose chuẩn tính được nồng độ
glucose của mẫu thí nghiệm. Đo 3 lần lặp lại thí nghiệm.
3.2.7. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzym cellulase
a. Nguyên tắc:
Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng có sẳn trong MT để sinh trưởng tạo thành một lượng lớn enzym ngoại bào lẫn trong MT, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn enzym thô.
Nấm sợi được nuôi cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng chứa MT PGA ủ trong tủấm trong thời gian 4-5 ngày. Rửa bào tử từ bề mặt thạch nghiêng với dung dịch chứa Tween 80 0,1%, thu được huyền phù bào tử của từng chủng.
Cho vào bình tam giác chứa 30g MT xốp đã làm ẩm và hấp khử trùng ở 1atm trong 60 phút. Nuôi ủở nhiệt độ phòng trong 3- 4 ngày.
Sau khi nuôi đủ thời gian, thu lấy MT đem sấy nhẹ, có quạt gió ở nhiệt độ 400C
đểđạt độẩm 8%- 12%, nghiền nhỏ, bảo quản trong chai, lọ sứ thuỷ tinh. Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzym thô (Nguyễn Đức Lượng, 2003).
3.2.8. Phương pháp ly trích enzym cellulase
a. Nguyên tắc
Dựa trên khả năng hòa tan trong nước của các enzym trong nước cất tạo thành dịch enzym.
b. Cách tiến hành
Chế phẩm enzym thô thu được đem sấy khô ở 400C, nghiền mịn, cho nước cất vào với tỉ lệ 1: 3, lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng /phút/ 1 giờ. Sau đó ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút/ 15 phút, thu dịch trong, làm lạnh.
Để giảm ảnh hưởng của đường tự do có trong môi trường lên men, đem tủa dịch lọc bằng cồn 960đã làm lạnh theo tỉ lệ (1:3). Thu tủa và hòa lại bằng dung dịch đệm Na- acetate 50mM, pH5, ta được dịch enzym sử dụng trong các thí nghiệm.
3.2.9. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng của MT đến khả năng sinh enzym cellulase của nấm sợi sinh enzym cellulase của nấm sợi
* Ảnh hưởng thời gian
Để xác định ảnh hưởng thời gian ta nuôi 3 chủng nấm sợi trên MT xốp cơ sởở
các thời gian khác nhau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày. Sau khi nuôi cấy, ly trích enzym và xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp định lượng đường khử
bằng 3,5- dinitrosalycylic.
Bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp lại.
* Ảnh hưởng nguồn cacbon
Để xác định ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đóng vai trò là chất cảm
ứng đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase, ta tiến hành nuôi các chủng nấm sợi trên MT bán rắn với tỉ lệ cacbon khác nhau như sau:
- 4 cám: 6trấu (4C:6T) - 6 cám : 4 rơm (6C:4R). - 4 rơm : 6 cám (4R: 6C) - 100% rơm (1R) Bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp lại. Mẫu đối chứng là MT xốp cơ sở. * Ảnh hưởng pH
Để xác định ảnh hưởng pH đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase của các chủng nấm sợi nghiên cứu, tiến hành nuôi trên MT sinh enzym cao nhất được chọn ở thí nghiệm trên, dùng HCl 5%, NaOH 5% điều chỉnh pH MT về các độ pH 4, 5, 6, 7, 8.
Bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp lại. Mẫu đối chứng là MT xốp cơ sở, pH5,5.
* Ảnh hưởng độẩm
Để xác định ảnh hưởng độ ẩm đến sinh tổng hợp enzym cellulase ta cũng nuôi trên MT có nguồn cacbon và pH tốt nhất ở 2 thí nghiệm trên, điều chỉnh độ ẩm bằng nước biển vô trùng về các độẩm 50%, 55%, 60%, 65%, 70%.
Bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp lại. Mẫu đối chứng là MT xốp cơ sở, độẩm 60
* Ảnh hưởng nhiệt độ
Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ ta cũng nuôi trên MT có nguồn cacbon, pH, độẩm tốt nhất ở 3 thí nghiệm trên và ủở các nhiệt độ khác nhau 250C, 300C, 500C, 550C.
Bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp lại. Mẫu đối chứng là MT xốp cơ sở, nhiệt độ
phòng.
Ly trích enzym cellulase và đánh giá khả năng sinh enzym cellulase theo phương pháp định lượng đường khử bằng 3,5- Dinitrosalycylic acid.
3.2.10. Phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng sinh
a. Nguyên tắc
Chất kháng sinh do nấm sợi sinh ra sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định làm cho VSV không phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch kháng sinh hay khối thạch chứa nấm tạo thành vòng vô khuẩn trong suốt.
b. Cách tiến hành
- Cấy nấm sợi trên MT PGA không có thạch, rồi ủ ba ngày ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 3000 vòng/ 10 phút, thu dịch kháng sinh.
- Dùng khoan nút chai khoan các khối thạch của MT có chứa VSV kiểm định (E.coli, Bacillus subtilis).
- Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch kháng sinh vào các lỗ khoan.
- Để trong tủ lạnh 40C trong 8 giờ để dịch kháng sinh khuếch tán vào trong thạch. Sau đó chuyển sang tủấm 300C. Kiểm tra vòng ức chế sau 24h.
c. Kiểm tra kết quả
Nếu nấm nghiên cứu sinh ra chất kháng sinh sẽ có một vòng trong suốt xung quanh khối thạch do các chất kháng sinh đã ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng tròn trong suốt (vòng vô khuẩn) xung quanh lỗ khoan. Khả năng sinh kháng sinh được đáng giá bằng hiệu số (D-d, mm).
Bố trí thí nghiệm 3 lần lặp lại.
3.2.11. Phương pháp sử dụng phần mềm thống kê để xử lý số liệu thực nghiệm nghiệm
Các kết quả thí nghiệm trong đề tài được xử lý bằng chương trình Data analysis trong Excel. Do yêu cầu của đề tài, chỉ một số chức năng được sử dụng như: Tính đại lượng thống kê mô tả (Decriptives) và phân tích ANOVA (analysis of variance) ở mức ý nghĩa 0,05.
CHƯƠNG IV.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ
rơm, rạ lúa
4.1.1. Phân lập các chủng nấm sợi từ rơm, rạ lúa
Tiến hành lấy mẫu từđất mặt, rơm rạ vừa thu hoạch và đang bị phân hủy trên mặt đất, đã phân lập được 54 chủng nấm sợi khác nhau. Trong đó 28 chủng phân lập từ đất mặt ruộng có rơm rạ đang phân hủy, 26 chủng phân lập được từ rơm, rạ chưa phân hủy.
Từ kết quả trên cho thấy ởđất ruộng sau khi thu hoạch với phần rơm, rạ lúa thải ra bỏ lại trên đồng, chứa hệ nấm sợi vô cùng phong phú. Chúng phân bố rộng rãi trên tất cả các cơ chất như trên rơm, rạ tươi, đang phân hủy và cả trong đất. Trong đó, các chủng nấm sợi có trong MT đất nhiều hơn trong rơm, rạ. Điều này có thể giải thích do nấm sợi là VSV hiếu khí, do đó lớp đất mặt là nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn là xác bã rơm, rạ, động vật, vỏ xác tôm cua, cá…đang bị phân hủy. Đồng thời, với điều kiện
đất ruộng có lượng nước ra vào thường xuyên, lớp đất mặt luôn giữ được độ ẩm thích hợp cho các chủng nấm sợi sinh trưởng phát triển. Số chủng nấm sợi trên rơm, rạ ít hơn trong đất. Do thức ăn chủ yếu là hợp chất hữu cơ giàu cellulose, không đủ các nguồn dinh dưỡng như trong đất. Đồng thời, nước mưa sẽ làm rửa trôi lượng lớn bào tử nấm sợi. Đặc biệt, trên rơm, rạđang phân hủy số lượng nấm sợi nhiều hơn. Vì đây là những nguồn hữu cơđang bị phân hủy, một phần đã phân giải thành glucose là nguồn cacbon mà nấm dễ hấp thụ nhất.
Do đó, nguồn rơm rạ sau thu hoạch với thành phần cellulose trên 40% rất khó phân hủy với điều kiện bình thường, nếu được sử dụng làm nguồn cơ chất cho VSV có mặt trong rơm, rạ và trong đất thì sẽđược phân hủy rất nhanh và trở thành nguồn phân bón rất tốt cho cây trồng đồng thời trả lại cho đất chất dinh dưỡng bị mất đi, hạn chếđược tình trạng đất bạc màu, cằn cỗi. Ngày nay xu hướng ủ rơm rạ tại ruộng sau khi thu hoạch, có bổ sung thêm các chế phẩm vi sinh được nông dân rất ưa chuộng và triển khai thực hiện ngày càng nhiều, điều này thể hiện sự tiến bộ của công nghệ sinh học được
ứng dụng vào thực tiễn ngày càng rộng rãi.
Như vậy, MT sống ở ruộng lúa có đầy đủ các yếu tố cần thiết cho nấm sợi sinh trưởng và phát triển. Chúng sử dụng các chất hữu cơ sẳn có để tồn tại, đồng thời tham gia phân hủy các chất thải, giúp giảm bớt ô nhiễm MT trong sản xuất nông nghiệp.
Từ các chủng thuần khiết phân lập được nói trên, chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng nấm dựa trên khả năng sinh enzym cellulase của chúng.
4.1.2. Tuyển chọn những chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase Tuyển chọn lần 1 Tuyển chọn lần 1
Kiểm tra khả năng sinh enzym cellulase của 54 chủng nấm sợi theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
Kết quả trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Khả năng sinh enzym celllase của 54 chủng nấm sợi phân lập
STT Kí hiệu chủng D-d (mm) STT Kí hiệu chủng D-d (mm) STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 1 Đ1 24,5 20 Đ20 12,0 39 T1 18,0 2 Đ2 23,5 21 Đ21 17,0 40 T2 12,0 3 Đ3 15,0 22 Đ22 10,5 41 T3 14,5