Pikovskya khuẩn lac có màu trắng đục, nhỏ, bờ tròn đều, đường kính 1–2 mm. Mật độ tế bào (CFU/g) là 1.5 x 106
3.3 Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng phân giải của Bacillus mucilaginosus Bacillus mucilaginosus
3.3.1 Ảnh hưởngcủa pH ban đầu lên sự phát triển của Bacillus mucilaginosus
pH là nhân tố quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. pH có trong môi trường làm thay đổi trang thái điện tích của thành tế bào, pH làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu của tế bào vi sinh vật với những ion nhất định có trong môi trường.
Mặt khác chúng cũng làm ức chế phần nào các enzyme có mặt trên thành tế bào. pH môi trường vượt mức bình thường đối với vi sinh vật thì sự sống bị ức chế (Thư Viện Sinh Học.com;giáo viên sinh học; ảnh hưởng của các yếu tố hóa học đến sinh trưởng của vi sinh vật). Vì vậy việc nghiên cứu pH ban đầu là nhằm mục đích tối ưu hóa sự sinh trưởng phát triển của Bacillus mucilaginosus, xác
định được khoảng pH thích hợp của vi khuẩn này.
Chủng Bacillus mucilaginosus được nuôi trong các bình tam giác chứa
100ml môi trường Pikovskya lỏng. pH được điều chỉnh từ 4,5 – 8, có bước nhảy là 0,5. Tiến hành lắc trên máy lắc 150 vòng/phút sau 24 giờ đo độ đục của môi trường với OD có bước sóng 630nm.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 pH OD giá trị OD 24 giờ giá trị OD 48 giờ
Biểu đồ 1. Thể hiện sự ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và
phát triển của Baciluss mucilaginosus.
Kết quả thí nghiệm cho thấy pH thích hợp của Bacillus mucilaginosus nằm
trong khoảng 7–8. Tuy nhiên nó vẫn phát triển tốt nhất ở môi trường pH=7, với giá trị OD từ 0,516 lên 1,925 sau 24 giờ nuôi cấy (từ 24 giờ - 48 giờ), ở môi trường acid vi khuẩn phát triển rất chậm, ở môi trường acid nhẹ vi khuẩn cũng phát triển tương đối. Nhìn vào biểu đồ cho thấy khả năng thích ứng của vi khuẩn này đối với sự thay đổi pH là tương đối rộng nằm trong khoảng 6- 8.
Như vậy pH = 7 là thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus
mucilaginosus. Chúng tôi chọn pH này để khảo sát các điều kiện tiếp theo.
3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự phát triển của vi khuẩn Bacillus
mucilaginosus
Đường là nguồn cung cấp cacbon cho vi sinh vật phát triển, sinh tổng hợp các chất trong tế bào do đó không thể thiếu.
Bacillus mucilaginosus được nuôi cấy trong môi trường Pikovskya lỏng chứa các nồng độ đường succarose khác nhau. Sau 24 giờ xác định khả năng sinh
trưởng phát triển của nó bằng cách đo độ đục OD bằng máy đo mật độ quang học ở bước sóng 630nm: 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 4 2 1 0,5 0,25 0,175 0,0875 OD Nồng độ đường(%) OD 24 giờ
Biểu đồ 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự phát triển của vi khuẩn
Bacillus mucilaginosus.
Qua biểu đồ 2 cho thấy nồng độ đường thích hợp cho sự phát triển của
Bacillus mucilaginosus là 1(%) vì có giá trị OD cao nhất là 0,408. Ở các nồng độ
thấp hơn và cao hơn vi khuẩn đều phát triển nhưng thấp hơn so với sự phát triển ở nồng độ đường 1(%), do nồng độ đường thấp thì không đủ cho vi khuẩn phát triển thiếu nguồn dinh dưỡng, còn nồng độ đường cao ức chế sự phát triển của nó.
Với nồng độ đường 1% đây là nồng độ thích hợp nhất cho sự phát triển của
Bacillus mucilaginosus.
3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân giải phốt pho khó tan của
Bacillus mucilaginosus
Mỗi cơ thể sinh vật tồn tại trên trái đất này kể cả sinh vật đẳng nhiệt hay biến nhiệt đều chịu tác động của nhiệt độ ở ba giới hạn khác nhau: Nhiệt độ thấp
nhất, nhiệt độ tối thích, nhiệt độ cao nhất. Thế nên vi khuẩn Bacillus mucilaginosus cũng không nằm ngoài giới hạn này. Do đó việc nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân giải phốt pho của Bacillus mucilaginosus
là điều cần thiết.
Chúng tôi đã tiến hành cấy giống vào môi trường Pikovskya lỏng cho lắc trên máy lắc và điều chỉnh nhiệt ở các mức khác nhau. Sau 24 giờ nuôi cấy, đem đo độ đục của môi trường nuôi cấy trên máy so màu ở bước sóng 630nm.
Kết quả được thể hiện đồ thị 3:
Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng và phát triển của
Bacillus mucilaginosus.
Qua thí nghiệm cho thấy nhiệt độ thích hợp của Bacillus mucilaginosus là tương đối cao ở nhiệt độ 250C - 300C. Và vi khuẩn Bacillus mucilaginosus phát triển nhất ở nhiệt độ 300C đây là nhiệt độ tối thích của nó, so với đề tài khoa học “Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải phốt pho khó tan trên đất đỏ bazan ở Dak Lak”, Nguyễn Chiến Thắng, Trường Đại Học Tây Nguyên thì nhiệt độ thích hợp của Bacillus mucilaginosus thấp hơn so với các chủng vi
khuẩn phân giải phốt pho ở Việt Nam.
Với nhiệt là 30OC, đây là nhiệt độ thích hợp cho chủng vi khuẩn Bacillus
3.3.4 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau đến quá trình lên men
Bacillus mụilaginosus
Cũng giống như pH, nhiệt độ, nồng độ đường, nitơ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như Bacillus mucilaginosus. Vi sinh vật có thể sử dụng các nguồn nitơ khác nhau nhưng
không phải nguồn nitơ nào cũng thích hợp cho nó, việc tìm ra nguồn nitơ nào thích hợp cho sự phát triển của chúng là rất cần thiết, nó giúp cho quá trình chuyển hóa các hợp chất phốt pho khó tan thành dễ tan được tốt hơn.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với Bacillus mucilaginosus nuôi cấy trên
máy lắc (150 vòng/phút) ở nhiệt độ phòng trong 100 ml môi trường Pikovskya lỏng có bổ sung 1% các nguồn nitơ khác nhau: NaNO3, (NH4)2SO4, pepton và ure. Sau 24 giờ xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của nó bằng đo độ đục OD trên máy so màu.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1 2 3 4 OD CÁC NGUỒN NITƠ 24 giờ
Biểu đồ 4: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau lên
Qua biểu đồ 4 cho thấy nguồn nitơ thích hợp là pepton, giá trị OD đo được ở sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn là 2,650, tiếp đó là (NH4)2SO4 với giá trị OD là 2,284, NaNO3 là thấp nhất, ure cũng thấp đây là một khó khăn lớn gặp phải vì hầu hết trong nông nghiệp đều sử dụng nguồn nitơ từ ure.
Vậy với nguồn nitơ là pepton thì thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus mucilaginosus.
3.3.5 Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus mucilaginosus
Sau khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Bacillus mucilaginosus chúng tôi có kết quả nó phát triển tốt nhất
ở PH = 7, nhiệt độ từ 350C–400C, nguồn nitơ tốt nhất là pepton. Từ đó, tiến hành nuôi cấy Bacillus mucilaginosus để nghiên cứu xây dựng đường cong sinh trưởng.
Nuôi cấy Bacillus mucilaginosus trên máy lắc 150 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng trong bình tam giác lớn 500ml dịch Pikovskya lỏng chứa các nguồn trên và điều chỉnh pH = 7. Xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của nó sau khi nuôi cấy được 5 ngày.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 20 40 60 80 100 120 140 O D
Thời gian ( giờ)
Đường cong sinh trưởng
Nhận xét:
Quan sát chủng vi khuẩn Bacillus mucilaginosus trong quá trình nuôi cấy, trải qua 4 giai đoạn phát triển liên tiếp gồm: pha lag, pha log, pha cân bằng, pha suy vong.
Pha lag được tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy giống đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia, nhưng trọng lượng và thể tích tế bào tăng rõ rệt do trong thời kỳ này vi khuẩn đang thích nghi với môi trường và chất dinh dưỡng. Kết quả cho thấy, pha lag diễn ra trong 12 giờ đầu của quá trình nuôi cấy.
Pha log từ 24 giờ đén 60 giờ nuôi, nồng độ tế bào tăng nhanh chóng vì sau pha lag vi khuẩn đã thích nghi được với môi trường, trong môi trường số lượng tế bào lớn. Bên cạnh đó giai đoạn này vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme ngoại bào lớn nhất để phân giải các chất dinh dưỡng trong môi trường. Chính vì thế ở giai đoạn này các tế bào vi sinh vật diễn ra quá trình trao đổi chất mạnh mẽ nhất, số lượng tế bào tăng theo lũy thừa.
Kết quả sau 24 giờ nuôi cấy, giá trị OD đo được của chủng Bacillus mucilaginosus là 1,225 (đạt 40% so với giá trị OD cực đại). Ở pha này giá trị OD
tăng liên tục, sau 12 giờ giá trị OD 630 tăng khoảng 13,8% - 24% cho tới khi chủng vi khuẩn phát triển chậm lại sau 72 giờ nuôi cấy. Ở pha này, mặc dù số lượng tế bào chưa đạt lớn nhất nhưng quần thể tế bào có trạng thái sinh hóa, sinh lý cơ bản như nhau, tế bào vi sinh vật hoàn thiện nhất, đây là giai đoạn người ta nghiên cứu các đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi sinh vật.
Bước sang pha cân bằng (từ 72 giờ - 96 giờ) thì tốc độ và khả năng sinh trưởng, trao đổi chất của vi sinh vật giảm. Số lường tế bào chết đi hầu như bằng với số lường tế bào sinh ra. Nguyên nhân gây ra hiện tượng này là chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm, các chất độc tích lũy, pH giảm. Tuy đây là giai đoạn tốc độ tăng trưởng của tế bào vi sinh vật chậm lại nhưng đây là giai đoạn số lường tế bào vi sinh vật lớn nhất và hoạt tính nitrogenase cũng đat cực đại nên thường chọn đầu pha cân bằng để thu sinh khối vi sinh vật.
Pha suy vong sau 108 giờ thì nồng độ tế bào Bacillus mucilaginosus bắt đầu giảm xuống, sau 120 giờ mật độ tế bào giảm nhanh, nồng độ tề bào chỉ còn lại 64,9% so với giá trị cực đại. Do môi trường nguồn dinh dưỡng giảm nhiều, sản phẩm bài tiết qua lớn, vi khuẩn chết đi và tự phân nhờ các enzyme của bản thân. Trong quá trình nuôi cần tránh xảy ra giai đoạn này.
Từ kết quả thí nghiệm ta thấy khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzyme của Bacillus mucilaginosus tăng nhanh sau 24 giờ nuôi cấy, bắt đầu ổn định sau
48 giờ, sinh khối tế bào và hoạt tính nitrogenase đạt cực đại sau 72 giờ nuôi cấy, pha suy vong bắt đầu từ sau 108 giờ, sinh khối tế bào và hoạt tính nitrogenase giảm đi nhanh chóng. Vậy thời gian thích hợp để thu sinh khối Bacillus mucilaginosus là sau 72 giờ nuôi cấy.
Hình 5: Môi trường xác định đường cong sinh trưởng.
3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của Bacillus mucilaginosus đối với cây cải bẹ xanh mỡ Khoảng cách giữa thực tế và thí nghiệm là rất lớn, để có thể ứng dụng Khoảng cách giữa thực tế và thí nghiệm là rất lớn, để có thể ứng dụng được Bacillus mucilaginosus vào thực tiến là một vấn đề, không chỉ dựa trên các hoạt tính phân giải phốt pho khó tan mà còn phải xác định được sự an toàn của
nó đối với cây trồng, xem khả năng của nó trong môi trường chứa vi khuẩn và sự tác động của nó lên cây trồng tốt hay xấu.
Để đánh giá ảnh hưởng của Bacillus mucilaginosus lên sự sinh trưởng và
phát triển của cây trồng chúng tôi gây nhiễm Bacillus mucilaginosus vào giấy vô trùng (lô giấy làm thí nghiệm) với bổ sung lượng dịch vi khuẩn khác nhau, gieo mỗi lô 30 hạt, tương tự làm với lô đất đối chứng. Theo dõi sự nảy mầm, động thái sinh trưởng và phát triển của cây.
Kết quả thu được sau khi trồng ở bảng 7 và 8.
Bảng 7: Tỉ lệ % hạt nảy mầm của cây cải ngọt dưới sự ảnh hưởng của vi khuẩn
Bacillus mucilaginosus. Mẫu (%) ngày 0 1 2 3 4 5 6 1 33.3 43.3 63.3 36.7 50 46.7 70 2 73.33 93.3 86.7 80 86.7 83.3 86.7
Bảng 8: Ảnh hưởng của Bacillus mucilaginosus tới chiều cao cây cải bẹ xanh mỡ (cm). Mẫu ngày 0 1 2 3 4 5 6 4 18 20 23 23 28 23 22 5 20 28 28 25 32 30 29 6 36 55 50 35 45 45 46 7 40 50 51 40 48 48 47 8 45 55 55 57 55 60 59 9 45 60 65 60 63 64 62
Nhận xét:
Qua bảng 7cho ta thấy khi bổ sung vi khuẩn hay ngâm hạt cải trong dịch vi khuẩn không những không gây hại cho cây cải mà còn có tác động tốt đến sự nảy mầm của cây cải, tỉ lệ nảy mầm cao hơn mẫu đối chứng. Theo như % hạt nảy mầm thì mẫu 1 là tốt nhất.
Ảnh hưởng tới sự phát triển của cây trồng, sau 5 ngày gieo hạt bắt đầu có sự khác biệt giữa mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm, chiều cao của cây cải khác biệt rõ rệt.
Hình 6: Cải bẹ xanh mỡ sau 5 ngày gieo hạt
A: Bên phải, mẫu đối chứng B: Bên trái, mẫu 1 và mẫu 6
A: Bên trái, mẫu đối chứng. B: Bên phải, mẫu 2 và mẫu 3.
Hình 8: Cây cải bẹ xanh mỡ sau 5 ngày gieo hạt
A: Bên trái, mẫu đối chứng B: Bên phải, mẫu 4 và mẫu 5
Qua thí nghiệm cho thấy Bacillus mucilaginosus có ảnh hưởng tốt đến tỉ lệ hạt nảy mầm, từ mẫu thí nghiệm 1 đến mẫu thí nghiệm 6 tỷ lệ hạt nảy mần đều cao hơn so với mẫu đối chứng, tỷ lệ nảy mầm của cây cải bẹ xanh mỡ ở mẫu thí nghiệm 1 cao nhất là 93,3%, thấp nhất là mẫu 3 tỷ lệ hạt nảy mầm chỉ 80% nhưng vẫn cao hơn mẫu đối chứng chỉ có 77,33% (bảng 7).
Xét về chiều cao cây thì vi khuẩn Bacillus mucilaginosus có ảnh hưởng tốt tới chiều cao cây cải bẹ xanh mỡ, ở mẫu thí nghiệm sau 9 ngày gieo hạt thì chiều cao cây đạt tới 60–65 cm, cao nhất là mẫu 2 với 65cm, thấp nhất là 60cm ở mẫu 1 và mẫu 3 nhưng cao hơn mẫu đối chứng chỉ có 45cm.
Vậy vi khuẩn Bacillus mucilaginosus có ảnh hưởng tốt đến tỷ lệ hạt nảy
CHƯƠNG IV
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1Kết luận
1. Khả năng phân giải photpho khó tan của B. mucilaginosus là tương đối mạnh, tới ngày thứ 5 thì hoạt tính đường phân giải là 18mm.
Ở môi trường lỏng, hiệu ứng phân giải làm màu của môi trường thay đổi.
2. Chủng Bacillus mucilaginosus phát triển thích hợp ở môi trường pH=7, với nồng độ đường 1%, nguồn nitơ tốt nhất cho quá trình lên men là Pepton, nhiệt độ tối ưu là 300C.
3. Qua đường cong sinh trưởng cho thấy vi khuẩn này phát triển 4 ngày bắt đầu chết (bước sang pha chết).
4. Bacillus mucilaginosus đối với cây cải bẹ xanh mỡ là mang tính an toàn,
không gây hại mà kích thích nảy mầm và tăng chiều cao cây.
4.2 Kiến nghị
Do thời gian thực hiện đề tài còn hạn chế nên chúng tôi chưa khảo sát hết được các yếu tố ảnh hưởng, chưa nghiên cứu được sâu nên cần nghiên cứu sâu hơn nứa và áp dụng vào thực tiến.
- Tiếp tục khảo sát nguồn cacbon nào thích hợp cho sự phát triển của Bacillus mucilaginosus.
- Xây dựng quy trình nhân nuôi Bacillus mucilaginosus.
- Thử nghiệm kết hợp giữa các chủng phân giải ni tơ ở Việt Nam với chủng
TÀI LIỆU THAM KHẢO.
Tài Liệu Tiếng Việt.
1. Nguyễn Chiến Thắng, Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải phosphate khó tan trên đất bazan nâu đỏ ở Dak Lak. Đề tài khoa học Trường Đại Học Tây Nguyên.
2. Hoàng Thị Hà.Dinh Dưỡng Khoáng Thực Vật NXB Đại Học Quốc Gia, 1998.
3. Võ Thị Lài, Nghiên cứu nuôi cấy và khả năng phân giải lân khó tan của vi khuẩn
Bacillus Megaterrium. Luận Văn Tốt Nghiệp Trường Đại Học Tây Nguyên,
2006.
4. Bài giảng Nông Hóa. Trường Đại Học Tây Nguyên.
5. Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Quỳnh Mai, Hồ Thị Kim Anh, Nguyễn Thị Phương Chi. 2003. Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với vi sinh vật hòa tan Photphate. Những nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Báo cáo hội nghị CNSH Toàn Quốc.