Thu nhận và xử lý ngà răng người làm giá thể nuôi cấy tế bào gốc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN THỊ NHẬT UYÊN THU NHẬN VÀ XỬ LÝ NGÀ RĂNG NGƯỜI LÀM GIÁ THỂ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG NGƯỜI Chuyên ngành: Sinh lý động vật Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN LÊ BẢO HÀ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012 LỜI CẢM ƠN Luận văn tốt nghiệp này là thành quả của những năm học tập, nghiên cứu cùng với sự quan tâm, chia sẻ nhiệt tình của gia đình, thầy cô và bạn bè. Nếu không có sự giúp đỡ và động viên của nhiều người có lẽ tôi khó hoàn thành tốt luận văn này. Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Lê Bảo Hà, đã tận tình hướng dẫn, góp ý và động viên tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Ths. Phan Kim Ngọc, người đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về vật chất lẫn tinh thần để tôi học tập và nghiên cứu tại PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM. Tôi xin cảm ơn chị Tuyền, các bạn Giang, Xuân và các em Vũ, Quân, Hương, Hằng đã luôn sát cánh cùng tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Lời cảm ơn cuối cùng, tôi xin gởi đến ngoại, cha mẹ và em gái đã hết lòng quan tâm và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Tp Hồ Chí Minh, 02/2012 Nguyễn Thị Nhật Uyên i MỤC LỤC Trang Bìa chính Bìa phụ Lời cảm ơn Mục lục i Danh mục từ viết tắt iv Danh mục bảng và đồ thị vi Danh mục hình vii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Kỹ nghệ mô 3 1.1.1. Giá thể ba chiều 3 1.1.1.1. Các đặc tính của giá thể ba chiều 4 1.1.1.2. Nguyên liệu thiết kế giá thể 4 1.1.2. Tế bào trong kỹ nghệ mô 4 1.1.3. Khả năng tương tác của tế bào với giá thể 5 1.1.3.1. Sự bám dính 5 1.1.3.2. Sự di chuyển 5 1.1.3.3. Sự tăng trưởng và biệt hóa 6 1.1.4. Giá thể dùng trong nha khoa . 8 1.2. Ngà răng 11 1.2.1. Cấu trúc ngà răng 12 1.2.2. Thành phần cấu tạo và các đặc tính của ngà răng 13 1.2.2.1. Thành phần hữu cơ 13 1.2.2.2. Thành phần vô cơ 14 1.2.2.3. Đặc tính của ngà răng 14 1.2.3. Giá thể ngà răng 15 1.3. Tế bào gốc trong mô tủy răng 15 ii 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 16 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 16 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 18 Chương 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 19 2.1.1. Mẫu vật 19 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 20 2.1.3. Hóa chất 21 2.2. Phương pháp 24 2.2.1. Sơ đồ quy trình thí nghiệm tổng quát 24 2.2.2. Tạo giá thể từ ngà răng người 25 2.2.3. Qui trình nuôi cấy tế bào tủy răng người 26 2.2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp 26 2.2.3.2. Phương pháp cấy chuyền tế bào tủy răng 27 2.2.4. Đánh giá tế bào tủy răng thu được 28 2.2.4.1. Phương pháp xác định kiểu hình miễn dịch 28 2.2.4.2. Khảo sát sự tăng trưởng của tế bào thu được từ mảnh mô 28 2.2.5. Khảo sát sự bám dính và tăng sinh của tế bào tủy răng trên giá thể ngà đã xử lý 29 2.2.5.1. Phương pháp đưa tế bào lên giá thể 29 2.2.5.2. Phương pháp MTT 30 2.2.5.3. Phương pháp SEM 31 Chương 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1. Thu nhận và xử lý giá thể từ mô ngà răng người 32 3.1.1. Thu nhận các mẫu ngà từ thân răng người 32 3.1.2. Đánh giá kết quả xử lí bề mặt của giá thể ngà răng 32 3.2. Kết quả nuôi cấy tế bào gốc từ tủy răng người 36 3.2.1. Kết quả nhuộm Hematoxylin – Eosin (H&E) mô tủy răng. 36 3.2.2. Kết quả nuôi cấy sơ cấp 37 iii 3.2.3. Kết quả cấy chuyền tế bào 40 3.3. Kết quả đánh giá tế bào thu được từ tủy răng. 41 3.3.1. Sự biểu hiện một số marker của tế bào gốc trung mô. 41 3.3.2. Kết quả đánh giá sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt nuôi cấy 42 3.4. Kết quả khảo sát sự tăng sinh của tế bào tủy răng trên bề mặt giá thể 44 3.5. Khả năng bám của tế bào gốc tuỷ răng trên giá thể 46 Chương 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ Kết luận 48 Kiến nghị 48 Danh mục công trình của tác giả viii Tài liệu tham khảo ix Phụ lục iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BMPs Bone morphogenetic proteins DFCs Dental follicle cells DMEM Dullbecco Modification of Eagle’s Medium DMSO Dimethyl sulfoxide DPCs Dental Pulp Cells DPSCs Dental Pulp Stem Cells ECM Extra Cellular Matrix EDTA Ethylene Diaminetertraacetid Acid EGF Epithelial Growth Factor FBS Fetal Bovine Serum FGF Fibroblast Growth Factor g Gram HE Haematoxylin Eosin l Litre mg Miligram ml Mililitre mm Milimetre NaCl Sodium Chlorite NaOCl Sodium Hypochlorite NCPs Non – collagenous proteins hTDM Hunan treated dentin matrix PBS Phosphatev - Buffered Saline PDL Periodontal ligament SEM Scanning Electron Microscope HA Hydroxyapatite TCP Tricalcium phosphate TGF-β Transforming Growth Factor-β v WNTs Wingless- and int-related proteins μl Microlitre μm Micrometre vi DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ Trang Bảng 2.1. Danh sách các dụng cụ sử dụng 20 Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị sử dụng 21 Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng của tế bào tủy răng người nuôi cấy ở lần cấy chuyền thứ 3 42 Đồ thị 3.2. Biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang (OD) với các mốc thời gian nuôi cấy 45 vii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Các nhân tố trong kĩ nghệ mô 3 Hình 1.2. Ba yếu tố quan trọng cho kỹ nghệ mô trong nha khoa: tín hiệu cho sự phát triển, tế bào gốc và khung nâng đỡ của chất nền ngoại bào 8 Hình 1.3. Ngà răng – tủy hình thành phức hợp với định hướng tối ưu cho các ứng dụng lâm sang của liệu pháp tái sinh 9 Hình 1.4. Nguyên bào ngà và ống ngà 13 Hình 1.5. Hình dạng ống ngà 13 Hình 1.6. Bề mặt ngà chưa xử lý dưới SEM 15 Hình 2.1. Mẫu răng người sau khi thu nhận 19 Hình 2.2. Cách cắt răng tạo hình mẫu ngà 25 Hình 2.3. Nguyên tắc phương pháp MTT 30 Hình 3.1. Mẫu ngà thu nhận để làm thí nghiệm sau khi xử lý 32 Hình 3.2. Mẫu chứng bề mặt ngà chưa xử lý 33 Hình 3.3. Bề mặt ngà xử lý bằng EDTA / Axit Citric 33 Hình 3.4. Mô tủy răng sau khi nhuộm H&E (100X) 36 Hình 3.5. Mô tủy răng sau khi nhuộm H&E (200X) 36 Hình 3.6. Quần thể tế bào sau khi thu nhận 37 Hình 3.7. Quần thể tế bào sau 5ngày nuôi cấy. 38 Hình 3.8. Quần thể tế bào sau 14 ngày nuôi cấy 39 Hình 3.9. Quần thể tế bào sau 21 ngày nuôi cấy 39 Hình 3.10. Quần thể tế bào sau 4 ngày (a) và sau 15 ngày (b) cấy chuyền 40 Hình 3.11. Kết quả phân tích sự biểu hiện một số marker của tế bào tủy răng sau 3 lần cấy chuyền 41 Hình 3.12. Giá thể ngà sau khi ủ hóa chất MTT: a) Giá thể không có tế bào, (b) Giá thể có tế bào 44 Hình 3.13. Tế bào bám trên giá thể xử lý bằng EDTA / Axit citric (x600) 47 Hình 3.14. Tế bào bám trên giá thể xử lý bằng EDTA / Axit citric (x7.000) 47 viii DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ I. BÀI BÁO KHOA HỌC 1. Đoàn Nguyên Vũ, Phạm Trần Hương Trinh, Nguyễn Thị Nhật Uyên, Tô Minh Quân, Phan Kim Ngọc, Trần Lê Bảo Hà, Nguyễn Thị Thư, Đặng Vũ Ngọc Mai, Hoàng Đào Bảo Trâm, Hoàng Tử Hùng, Trịnh Thị Trúc Ly (2011). Nuôi cấy tế bào gốc từ tủy răng người. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(3), 297-301. [...]... bào gốc Các kết quả thu được như một bước khởi đầu cho những nghiên cứu sau này trong lĩnh vực chữa trị và phục hồi nha khoa lâm sàng Mục tiêu chuyên biệt - Thu nhận và xử lý được giá thể từ ngà răng người - Nuôi cấy và nhận diện được tế bào gốc tủy răng người - Đánh giá được sự bám dính và tăng sinh của tế bào tủy răng người trên giá thể ngà đã xử lý 3 1.1 Kỹ nghệ mô [4], [46] Kỹ nghệ mô là ngành... nghiệm tổng quát Thu tủy răng Mẫu răng Cắt thành những mẫu ngà có kích thước 1 x 2 x 1mm Nuôi tế bào thu từ tủy Cấy chuyền Xử lý bề mặt ngà Xác định tế bào gốc tủy răng Đưa tế bào lên giá thể Khảo sát sự bám dính và tăng sinh Chụp SEM Phương pháp MTT 25 2.2.2 Tạo giá thể từ ngà răng người - Cơ sở khoa học Lớp mùn ngà là lớp giữa cấu trúc ngà - tủy, gồm có các nguyên bào ngà, các sợi collagen và các protein... Huang và cộng sự thu nhận tế bào gốc tủy răng theo nhiều phương pháp khác nhau; sau đó biệt hóa thành nguyên bào ngà Họ cũng 17 chứng minh được tế bào tủy răng tăng sinh được trong collagen và trên bề mặt ngà răng [20] Năm 2006, Shunji Kumabe và cộng sự tách tế bào tủy răng và biệt hóa thành nguyên bào ngà Đồng thời, họ cấy tế bào vào giá thể alginate; sau đó cấy dưới da bụng chuột Sau 6 tuần cấy ghép,... dụng ngà răng được xử lý làm giá thể nuôi cấy các tế bào bao răng (DFCs) cho tái tạo ngà răng Kết quả cho thấy có sự hỗ trợ và tái tạo ngà răng đầy đủ [55] Năm 2010, A Tonomura và cộng sự tiến hành cấy ghép tế bào có nguồn gốc từ tủy răng lên giá thể polyglycolic acid (PGA) và hydroxyapatite/beta-tricalcium phosphate (HAp/β-TCP), kết quả cho thấy rằng hình dạng giá thể ảnh hưởng đến sự tái tạo mô của tế. .. một tổng thể tích lớn hơn hẳn so với tổng thể tích thân tế bào và thể tích tủy răng Trên một răng đã mọc và đang hoạt động chức năng, nguyên bào ngà là thành phần chức năng quan trọng nhất của răng 15 1.2.3 Giá thể ngà răng Giá thể ngà đã được chứng minh có khả năng kích thích tế bào tủy răng người biệt hóa thành nguyên bào ngà in vitro và hình thành nên ngà mới in vivo [10] Để đảm bảo cho tế bào giảm... bào bạch cầu và tế bào tủy (trong đó có quần thể tế bào gốc trung mô ứng viên) Các tế bào hồng cầu và bạch cầu trưởng thành là những tế bào không có khả năng bám dính trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy Ngoài các tế bào bạch cầu non có khả năng bám dính còn có quần thể tế bào tủy răng Do đó, việc chọn lọc tế bào gốc trung mô được tiến hành trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt cho phép tế bào gốc trung mô... trình nuôi cấy tế bào tủy răng người 2.2.3.1 Nuôi cấy sơ cấp - Cơ sở khoa học Miệng là môi trường dễ nhiễm nấm, vi khuẩn, vi rút,… Do đó, việc thu nhận răng từ bệnh nhân, thu nhận mô tủy và bảo quản được ở tình trạng vô trùng cho đến khi thực hiện thí nghiệm là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong nuôi cấy tế bào Sau khi được thu nhận, ba quần thể tế bào chủ yếu gồm: tế bào hồng cầu, tế bào bạch... qua lớp ngà đã khoáng hóa Đó là ống ngà, ống ngà được lấp đầy bởi các đuôi bào tương của nguyên bào ngà, dịch mô và các thành phần cấu trúc hữu cơ như sợi collagen và chất khuôn của ngà quanh ống, có vai trò nâng đỡ sinh lý cho ngà răng Các ống ngà có đường đi hình chữ S ở ngà thân răng, khá thẳng ở ngà chân răng 13 Nguyên bào ngà Ống ngà Hình 1.4 Nguyên bào ngà và ống ngà [11] a Ở răng cửa b Ở răng. .. nguyên và tế bào có thể bám, tăng sinh trên bề mặt ngà thì cần tiến hành xử lý loại bỏ lớp mùn ngà trên bề mặt Lớp mùn ngà là lớp giữa cấu trúc ngà - tủy, gồm có các nguyên bào ngà, các sợi collagen và các protein bề mặt Lớp mùn Nguyên bào ngà Ống ngà Hình 1.6 Bề mặt ngà chưa xử lý dưới SEM [52] 1.3 Tế bào gốc trong mô tủy răng Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng mô tủy của người trưởng thành chứa một quần thể. .. nhằm tái tạo răng Đã có nhiều công trình trên thế giới tiến hành nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng cũng như tạo khung nâng đỡ, dùng để phục hồi tủy răng trong chữa trị mà không cần loại bỏ hoàn toàn tủy răng Khi đó, tế bào tủy răng đã được nuôi trên giá thể polymer tổng hợp như giá thể alginate, giá thể polymer poly (lactic-co-glycolic) acid, giá thể composite và giá thể polymer tự . Thu nhận và xử lý giá thể từ mô ngà răng người 32 3.1.1. Thu nhận các mẫu ngà từ thân răng người 32 3.1.2. Đánh giá kết quả xử lí bề mặt của giá thể ngà răng 32 3.2. Kết quả nuôi cấy tế bào. và phục hồi nha khoa lâm sàng. Mục tiêu chuyên biệt - Thu nhận và xử lý được giá thể từ ngà răng người - Nuôi cấy và nhận diện được tế bào gốc tủy răng người - Đánh giá được sự bám dính và. NHIÊN  NGUYỄN THỊ NHẬT UYÊN THU NHẬN VÀ XỬ LÝ NGÀ RĂNG NGƯỜI LÀM GIÁ THỂ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG NGƯỜI Chuyên ngành: Sinh lý động vật Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC