Thu nhận và xử lý ngà răng người làm giá thể nuôi cấy tế bào gốc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN THỊ NHẬT UYÊN THU NHẬN VÀ XỬ LÝ NGÀ RĂNG NGƯỜI LÀM GIÁ THỂ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG NGƯỜI Chuyên ngành: Sinh lý động vật Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN LÊ BẢO HÀ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012 LỜI CẢM ƠN Luận văn tốt nghiệp thành năm học tập, nghiên cứu với quan tâm, chia sẻ nhiệt tình gia đình, thầy bạn bè Nếu khơng có giúp đỡ động viên nhiều người có lẽ tơi khó hồn thành tốt luận văn Trước tiên xin chân thành cảm ơn TS Trần Lê Bảo Hà, tận tình hướng dẫn, góp ý động viên tơi q trình thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Ths Phan Kim Ngọc, người tạo điều kiện tốt vật chất lẫn tinh thần để học tập nghiên cứu PTN Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM Tôi xin cảm ơn chị Tuyền, bạn Giang, Xuân em Vũ, Quân, Hương, Hằng sát cánh thời gian thực đề tài Lời cảm ơn cuối cùng, xin gởi đến ngoại, cha mẹ em gái hết lòng quan tâm tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tp Hồ Chí Minh, 02/2012 Nguyễn Thị Nhật Un i MỤC LỤC Trang Bìa Bìa phụ Lời cảm ơn Mục lục i Danh mục từ viết tắt iv Danh mục bảng đồ thị vi Danh mục hình vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kỹ nghệ mô 1.1.1 Giá thể ba chiều 1.1.1.1 Các đặc tính giá thể ba chiều 1.1.1.2 Nguyên liệu thiết kế giá thể 1.1.2 Tế bào kỹ nghệ mô 1.1.3 Khả tương tác tế bào với giá thể 1.1.3.1 Sự bám dính 1.1.3.2 Sự di chuyển 1.1.3.3 Sự tăng trưởng biệt hóa 1.1.4 Giá thể dùng nha khoa 1.2 Ngà 11 1.2.1 Cấu trúc ngà 12 1.2.2 Thành phần cấu tạo đặc tính ngà 13 1.2.2.1 Thành phần hữu 13 1.2.2.2 Thành phần vô 14 1.2.2.3 Đặc tính ngà 14 1.2.3 Giá thể ngà 15 1.3 Tế bào gốc mô tủy 15 ii 1.4 Tình hình nghiên cứu nước 16 1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 16 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 18 Chương VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Mẫu vật 19 2.1.2 Dụng cụ thiết bị 20 2.1.3 Hóa chất 21 2.2 Phương pháp 24 2.2.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm tổng qt 24 2.2.2 Tạo giá thể từ ngà người 25 2.2.3 Qui trình ni cấy tế bào tủy người 26 2.2.3.1 Nuôi cấy sơ cấp 26 2.2.3.2 Phương pháp cấy chuyền tế bào tủy 27 2.2.4 Đánh giá tế bào tủy thu 28 2.2.4.1 Phương pháp xác định kiểu hình miễn dịch 28 2.2.4.2 Khảo sát tăng trưởng tế bào thu từ mảnh mô 28 2.2.5 Khảo sát bám dính tăng sinh tế bào tủy giá thể ngà xử lý 29 2.2.5.1 Phương pháp đưa tế bào lên giá thể 29 2.2.5.2 Phương pháp MTT 30 2.2.5.3 Phương pháp SEM 31 Chương KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1 Thu nhận xử lý giá thể từ mô ngà người 32 3.1.1 Thu nhận mẫu ngà từ thân người 32 3.1.2 Đánh giá kết xử lí bề mặt giá thể ngà 32 3.2 Kết nuôi cấy tế bào gốc từ tủy người 36 3.2.1 Kết nhuộm Hematoxylin – Eosin (H&E) mô tủy 36 3.2.2 Kết nuôi cấy sơ cấp 37 3.2.3 Kết cấy chuyền tế bào 40 3.3 Kết đánh giá tế bào thu từ tủy 41 3.3.1 Sự biểu số marker tế bào gốc trung mô 41 3.3.2 Kết đánh giá tăng sinh tế bào bề mặt nuôi cấy 42 3.4 Kết khảo sát tăng sinh tế bào tủy bề mặt giá thể 44 3.5 Khả bám tế bào gốc tuỷ giá thể 46 Chương KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ Kết luận 48 Kiến nghị 48 Danh mục cơng trình tác giả viii Tài liệu tham khảo ix Phụ lục DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BMPs Bone morphogenetic proteins DFCs Dental follicle cells DMEM Dullbecco Modification of Eagle’s Medium DMSO Dimethyl sulfoxide DPCs Dental Pulp Cells DPSCs Dental Pulp Stem Cells ECM Extra Cellular Matrix EDTA Ethylene Diaminetertraacetid Acid EGF Epithelial Growth Factor FBS Fetal Bovine Serum FGF Fibroblast Growth Factor g Gram HE Haematoxylin Eosin l Litre mg Miligram ml Mililitre mm Milimetre NaCl Sodium Chlorite NaOCl Sodium Hypochlorite NCPs Non – collagenous proteins hTDM Hunan treated dentin matrix PBS Phosphatev - Buffered Saline PDL Periodontal ligament SEM Scanning Electron Microscope HA Hydroxyapatite TCP Tricalcium phosphate TGF-β Transforming Growth Factor-β WNTs Wingless- and int-related proteins J.Ll Microlitre J.lill Micrometre DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ Trang Bảng 2.1 Danh sách dụng cụ sử dụng 20 Bảng 2.2 Danh sách thiết bị sử dụng 21 Đồ thị 3.1 Đường cong tăng trưởng tế bào tủy người nuôi cấy lần cấy chuyền thứ 42 Đồ thị 3.2 Biểu diễn tương quan mật độ quang (OD) với mốc thời gian nuôi cấy 45 vii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Các nhân tố kĩ nghệ mơ Hình 1.2 Ba yếu tố quan trọng cho kỹ nghệ mô nha khoa: tín hiệu cho phát triển, tế bào gốc khung nâng đỡ chất ngoại bào Hình 1.3 Ngà – tủy hình thành phức hợp với định hướng tối ưu cho ứng dụng lâm sang liệu pháp tái sinh Hình 1.4 Nguyên bào ngà ống ngà 13 Hình 1.5 Hình dạng ống ngà 13 Hình 1.6 Bề mặt ngà chưa xử lý SEM 15 Hình 2.1 Mẫu người sau thu nhận 19 Hình 2.2 Cách cắt tạo hình mẫu ngà 25 Hình 2.3 Nguyên tắc phương pháp MTT 30 Hình 3.1 Mẫu ngà thu nhận để làm thí nghiệm sau xử lý 32 Hình 3.2 Mẫu chứng bề mặt ngà chưa xử lý 33 Hình 3.3 Bề mặt ngà xử lý EDTA / Axit Citric 33 Hình 3.4 Mơ tủy sau nhuộm H&E (100X) 36 Hình 3.5 Mô tủy sau nhuộm H&E (200X) 36 Hình 3.6 Quần thể tế bào sau thu nhận 37 Hình 3.7 Quần thể tế bào sau 5ngày nuôi cấy 38 Hình 3.8 Quần thể tế bào sau 14 ngày ni cấy 39 Hình 3.9 Quần thể tế bào sau 21 ngày nuôi cấy 39 Hình 3.10 Quần thể tế bào sau ngày (a) sau 15 ngày (b) cấy chuyền 40 Hình 3.11 Kết phân tích biểu số marker tế bào tủy sau lần cấy chuyền 41 Hình 3.12 Giá thể ngà sau ủ hóa chất MTT: a) Giá thể khơng có tế bào, (b) Giá thể có tế bào 44 Hình 3.13 Tế bào bám giá thể xử lý EDTA / Axit citric (x600) 47 Hình 3.14 Tế bào bám giá thể xử lý EDTA / Axit citric (x7.000) 47 viii DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ I BÀI BÁO KHOA HỌC Đoàn Nguyên Vũ, Phạm Trần Hương Trinh, Nguyễn Thị Nhật Uyên, Tô Minh Quân, Phan Kim Ngọc, Trần Lê Bảo Hà, Nguyễn Thị Thư, Đặng Vũ Ngọc Mai, Hoàng Đào Bảo Trâm, Hoàng Tử Hùng, Trịnh Thị Trúc Ly (2011) Nuôi cấy tế bào gốc từ tủy người Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 9(3), 297-301 Kết khảo sát MTT tế bào tủy bề mặt giá thể - Giá trị OD dịch nuôi cấy tế bào thu nhận theo phương pháp MTT Mật độ quang OD Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 10 Nhóm Nhóm Đối chứng Giá thể ngà 0.048 0.095 0.022 0.031 0.081 0.023 0.127 0.197 0.123 0.185 0.125 0.199 0.272 0.287 0.239 0.283 0.279 0.28 0.176 0.236 0.172 0.209 0.153 0.257 0.014 0.075 0.017 0.031 0.016 0.047 Lần - Kết xử lý thống kê Nhóm Kết tóm tắt nhóm ngày Mean 0.0515 Standard Error 0.0295 Median 0.0515 Standard Deviation 0.0417193 Sample Variance 0.0017405 Range 0.059 Minimum 0.022 Maximum 0.081 Count Confidence level 0.068027 Coefficient of variation 81.00834969 Kết tóm tắt nhóm ngày Mean 0.125 Standard Error 0.004 Median 0.125 Standard Deviation 0.005656854 Sample Variance 3.2E-05 Range 0.008 Minimum 0.121 Maximum 0.129 Count Confidence level 0.009224 Coefficient of variation 4.5254834 Kết tóm tắt nhóm ngày Mean 0.259 Standard Error 0.02 Median 0.259 Standard Deviation 0.028284271 Sample Variance 0.0008 Range 0.04 Minimum 0.239 Maximum 0.279 Count Confidence level 0.04612 Coefficient of variation 10.92056805 Kết tóm tắt nhóm ngày Mean 0.1625 Standard Error 0.0095 Median 0.1625 Standard Deviation 0.013435029 Sample Variance 0.0001805 Range 0.019 Minimum 0.153 Maximum 0.172 Count Confidence level 0.021907 Coefficient of variation 8.267710057 Kết tóm tắt nhóm ngày 10 Mean 0.0165 Standard Error 0.0005 Median 0.0165 Standard Deviation 0.000707107 Sample Variance 5E-07 Range 0.001 Minimum 0.016 Maximum 0.017 Count Confidence level 0.001153 Coefficient of variation 4.285495644 F-Test Two-Sample for Variances Ngày Ngày Mean 0.0515 0.2385 Variance 0.001741 0.000113 Observations 2 df 1 F 15.47111 P(F