Nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận và thử nghiệm ứng dụng gama pga

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN THU NHẬN VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG GAMA-PGA NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực Lớp Khóa : TS Nguyễn Như Ngọc : Lưu Thị Thơm : 60_CNSH : 2015 – 2020 Hà Nội, 2020 LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin cảm ơn sâu sắc đến cô TS NGUYỄN NHƯ NGỌC – Trường Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam, người tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành đề tài nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh Viện Cơng Nghệ Sinh Học Lâm Nghiệp - Trường Đại học Lâm Nghiệp bảo, tạo điều kiện giúp tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Thơng qua q trình thực đề ra, học hỏi nhiều điều rút cho nhiều kinh nghiệm quý báu để giúp ích cho cơng việc sau thân Vì kiến thức cịn hạn chế, q trình thực hiện, hồn thiện đề tài khơng tránh khỏi sai sót, kính mong nhận ý kiến đóng góp từ thầy, i DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate CFU/ml Colony forming unit D,L-PGA Axit D,L- Poly γ- glutamic D-PGA Axit D-Poly γ- glutamic K – γ-PGA Kali – γ-PGA L-PGA Axit L-Poly γ-glutamic NCBI Trung tâm thông tin công nghệ Sinh học quốc gia – Mỹ TCA Axit Tricarboxylic v/p Vịng/ phút γ-PGA Axit Poly γ- glutamic g/l Gram/lít ii MỞ ĐẦU Việc nghiên cứu tạo sản phẩm có nguồn gốc từ q trình lên men xu hướng mới, tiến tính an tồn, khả ứng dụng cao, ảnh hưởng đến môi trường sống Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm Việt Nam nay, việc lạm dụng phụ gia có nguồn gốc hóa học sử dụng bừa bãi, với việc nhiều loại hóa chất cơng nghiệp sử dụng chế biến thực phẩm Do đó, việc nghiên cứu loại phụ gia thực phẩm mới, phù hợp tiêu chuẩn an toàn, tổ chức nước quốc tế công nhận mối quan tâm lớn nhà khoa học nước giới Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) polymer sinh học tạo thành từ phân tử axit glutamic Với ưu polymer có khả phân hủy, không độc với người tự nhiên nên γ-PGA nghiên cứu ứng dụng nhiều lĩnh vực khác Trong công nghệ môi trường, γ-PGA sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ trình lắng; y dược, γ-PGA dùng chất mang, chất giữ ẩm Trong công nghiệp thực phẩm, γ-PGA sử dụng dạng phụ gia ổn định chất lượng sản phẩm, chất chống kết tinh, chất ổn định… Hiện nay, axit poly γ-glutamic sản xuất cách trùng hợp axit glutamic, thơng qua đường tổng hợp hóa học, đường lên men sử dụng chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic Để đáp ứng phần nhu cầu đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận thử nghiệm ứng dụng γ-PGA ” nhằm khai thác những điểm mạnh vi khuẩn Bacillus, để tạo sản phẩm lên men an toàn cho chế biến thực phẩm ngày CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu axit poly γ-glutamic Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) polymer tự nhiên, mang điện tích âm, có đơn phân axit L-glutamic hay axit D-glutamic chứa hai đơn phân liên kết với mối liên kết nhóm γ-carboxyl nhóm α-amino [25, 38] Khả tham gia phản ứng hóa học với nhóm α-NH2 nhóm α-COOH γ-COOH theo thứ tự giảm dần theo mạch Nhờ q trình polymer hóa, γ-PGA hình thành từ 10.000 phân tử axit glutamic γ-PGA hình thành với loại khác nhau, có D-γPGA, L-γ-PGA hai dạng đồng trùng hợp tạo D,L-γ-PGA gọi chung γ-PGA [38] Hình 1.1: Cấu trúc γ-PGA [4] Hiện nay, cần phải nghiên cứu nhiều chủng vi khuẩn để sản xuất γPGA có suất cao với tính chất khác Nhiều ứng dụng y tế (đặc biệt phân phối thuốc) khai thác α-PGA Vì γ-PGA thực chất khác với αPGA (nó khơng liên quan đến bước điều chỉnh hóa học khơng nhạy cảm với proteases) nên sử dụng tốt ứng dụng y học Phân tích sản xuất γ-PGA kiến thức enzyme gen liên quan đến sản xuất γPGA không giúp tăng suất, giảm chi phí sản xuất mà cịn giúp hiểu chế hoạt động γ-PGA để ứng dụng rộng rãi 1.2 Cơ chế tổng hợp γ-PGA Nhiều nghiên cứu tiến hành để làm sáng tỏ đường trao đổi chất enzym có liên quan đến trình polymer hóa tạo γ-PGA nhằm tăng hiệu suất chuyển hóa vi khuẩn việc tác động vào enzym q trình tạo γ-PGA Đã có nhiều nghiên cứu công bố cho thấy tham gia enzym transglutaminase B subtilis NR-1 yếu tố xúc tác sinh tổng hợp γ-PGA chế đồng phân hóa L-glutamic sang D-glutamic nhờ enzym alanine recemase Các nghiên cứu phản ứng kéo dài chuỗi γpeptid xúc tác hệ enzym: glutamate dehydronase, glutamine synthetase, pyruvic acid aminotransferase, PGA synthetase [22] Tuy nhiên, B anthracis B subtilis khơng có chuyển hóa mà tạo γ-PGA Điều chứng tỏ chế tạo γ-PGA mà thực tế bước quy trình chuyển hóa tạo γ-PGA [12] Các nghiên cứu chủng B licheniformis 9945A có hệ enzym tổng hợp γ-PGA dạng tự glutamyl transamidase Hệ enzym xúc tác cho việc tạo loại γ-PGA chứa 60% axit L-glutamic trình tổng hợp địi hỏi phải có tham gia Mn2+ với vai trị co-factor [28] Việc chuyển hóa tạo γ-PGA cần sử dụng hệ enzym đa dạng tùy thuộc vào hệ vi sinh môi trường nuôi cấy Sơ đồ hình thành nên γ-PGA minh họa hình 1.2 sau: Hình 1.2: Con đường sinh tổng hợp γ-PGA [23] Con đường sinh tổng hợp γ-PGA nghiên cứu đưa từ năm 1982 Hara cộng vấn đề gây tranh cãi nhà khoa học, chủng vi khuẩn có cách chuyển hóa riêng [23] Tuy nhiên có số điểm chung nghiên cứu đường tổng hợp γ-PGA là: từ hợp chất polysaccharide sau chuyển hóa thành dạng đường glucose sacccarose vi khuẩn chuyển hóa qua q trình đường phân thành axit pyruvic Từ axit pyruvic nhờ chuyển hóa vi khuẩn qua chu trình TCA chuyển hóa thành axit α-ketoglutaric Với tham gia xúc tác NH4+ , phản ứng chuyển hóa axit α-ketoglutaric L-glutamine thành axit Lglutamic Nhờ axit α-ketoglutaric axit pyruvic mà axit L-glutamic chuyển hóa phần thành D-glutamic Giai đoạn polymer hóa nhờ xúc tác enzym PGA synthetase sản sinh vi khuẩn, phần tử L-glutamic Dglutamic liên kết với thành D,L-γ-PGA  Quá trình tổng hợp γ-PGA nhìn chung tổng kết qua bốn giai đoạn là: - Giai đoạn 1: Q trình racemic hóa γ-PGA: Do γ-PGA hỗn hợp gồm L D –glutamic D L glutamic, tùy thuộc vào chủng vi khuẩn tham gia Tuy nhiên, để có D-glutamic cần phải có q trình racemic hóa từ L-glutamic Vi khuẩn B subtilis, có đoạn mã gen liên quan đến hình thành enzyme có khả racemic hóa glr yrpC Trong glr enzym cytosolic có khả lựa chọn glutamic cao đặc biệt Lglutamic Quy trình racemic hóa L-glutamic thành D-glutamic xảy sau: Lglutamic enzym pyruvic aminotransferase xúc tác chuyển hóa thành L- alanine, sau L-alanine enzym alanine racemase xúc tác racemic hóa thành D-alanine Cũng nhờ xúc tác enzym pyruvic aminotransferase mà Dalanine chuyển hóa thành D-glutamic [22, 38] - Giai đoạn 2: Q trình polymer hóa γ-PGA: chế polymer hóa phân tử γ-PGA phụ thuộc vào phần tử ATP hình 1.3 Đầu tiên nhóm carboxyl cuối phân tử γ-PGA kết hợp với nhóm phosphoryl từ gamma phosphate ATP Tiếp theo, nhóm amino axit glutamic cơng thay vào phần tử phosphorylated nhóm carboxyl, kết hình thành liên kết amin làm kéo dài mạch γ-PGA [40] Hình 1.3: Phản ứng polymer hóa γ-PGA ATP [40] - Giai đoạn 3: Quá trình phân cắt γ-PGA (depolymer γ-PGA): hai enzym (endo-γ-glutamyl peptidase exo-γ-glutamyl peptidase chứng minh enzym phân cắt γ-PGA Trong thực tế chứng minh có phân cắt γPGA canh trường enzym ngoại bào vi khuẩn B subtilis NX2, nguyên nhân giảm khối lượng phân tử γ-PGA [46] Những enzym thể rõ pha cuối trình sinh tổng hợp - Giai đoạn 4: Quá trình điều tiết γ-PGA: Theo nhiều nghiên cứu trình sinh tổng hợp γ-PGA điều tiết gen ComPA, DegSU DegQ điều khiển mức độ phiên mã để thể đặc tính cảm ứng tối thiểu, thẩm thấu biến đổi pha 1.3 Tính chất γ-PGA Axit poly γ-glutamic bị phân hủy sinh học, không độc với môi trường, sinh vật người γ-PGA hòa tan tốt nước tạo liên kết bền vững với nước, khả giữ nước xem tính chất trội γ-PGA Nó phân tách với thành phần trung tính khác nhờ sắc kí giấy γ-PGA khác biệt với protein cấu trúc tính chất liên kết γ-peptid Thường liên kết α-peptid bị phân cắt protease liên kết γ-peptid γ-PGA bị phân cắt sinh học enzym γ-GTP [38] Axit poly γ-glutamic kết hợp với số ion kim loại để tạo nên loại muối dạng phức với ion: Na+ , K+ , Mg2+, Ca2+, NH4+ có ứng dụng rộng rãi ngành y tế, mơi trường, mỹ phẩm [32] Kích thước khối lượng axit poly γ-glutamic đa dạng, phụ thuộc vào cấu trúc dạng liên kết với chất khác canh trường vi sinh vật Khối lượng trung bình phân tử γ-PGA từ vài kilo dalton đến hàng triệu kilo dalton Nhìn chung, phân tử D,L-γ-PGA thường có khối lượng lớn nhiều so với D-γ-PGA hay L-γ-PGA dạng neo giữ thường có kích thước nhỏ dạng tự [18] Tùy vào điều kiện mơi trường hình thành khác mà γ-PGA có dạng hình thể là: cấu trúc xoắn anpha, thẳng beta, xoắn cuộn liên tục ngẫu nhiên, cuộn ngẫu nhiên, bao phủ thành khối điều kiện mơi trường hình thành khác Đối với dạng D-PGA L-PGA riêng rẽ, chúng có khả tan ethanol, chúng hỗn hợp đẳng mol bị kết tủa ethanol Axit poly γ-glutamic có độ nhớt cao nồng độ thấp người ta sử dụng phương pháp đo độ nhớt để xác định γ-PGA [28] 1.4 Phân loại γ-PGA Có thể phân loại γ-PGA dựa vào cấu trúc phương thức tồn canh trường vi sinh vật 1.4.1 Theo cấu trúc Dựa cấu trúc, γ-PGA phân làm loại sau:  Loại 1: Axit poly γ-D-glutamic (D-γ-PGA): chứa đơn phân axit D-glutamic loại polymer chứng minh tạo chủng vi khuẩn B anthracis chủng vi khuẩn tìm thấy vật chủ bị bệnh than [9, 17]  Loại 2: Axit poly γ- L-glutamic (L-γ-PGA): polymer chứa đơn phân axit L- glutamic loại sản xuất chủ yếu từ vi khuẩn Natrialba aegyptiacia loài ưa mặn, γ-PGA sinh vi khuẩn nhằm để chống lại nước vi khuẩn điều kiện môi trường nước biển L-γ-PGA tìm thấy nhiều động vật có xúc tu (sứa biển, san hơ) thành phần chất dính Hydra L-γ-PGA kết hợp với cation Ca²+ , Mg2+ K+ giúp vi khuẩn sinh vật khác điều hòa áp suất thẩm thấu bên tế bào [10]  Loại 3: Axit poly γ-D,L- glutamic (DL-γ-PGA): polymer phân tử chứa axit L-glutamic axit D-glutamic, DL-γ-PGA sản xuất chủ yếu từ Bacillus chia thành nhóm:  Cần bổ sung axit L-glutamic vào mơi trường nuôi cấy để tổng hợp γPGA  Không cần bổ sung axit L-glutamic vào môi trường nuôi cấy để tổng hợp γ-PGA Tỷ lệ đồng phân D/L DL-γ-PGA thường phụ thuộc vào tỷ lệ Mn2+ môi trường phát triển vi khuẩn tùy thuộc vào loài vi khuẩn [10] Đồng phân axit poly γ-glutamic hình thành D L-Glutamic tùy thuộc vào chủng giống vi sinh vật tạo 1.4.2 Theo phương thức tồn canh trường vi sinh vật Dựa vào phương thức canh trường vi sinh vật, có dạng sau: - Dạng 1: Axit poly γ-glutamic dạng neo giữ: Chủ yếu có vi khuẩn B anthracis loài vi khuẩn γ-PGA hợp chất có tác dụng kháng thực khuẩn thể, ngăn cản chúng công vào bên tế bào Dạng neo giữ thường tìm thấy dạng nội bào, tiết dạng sợi liên kết vi khuẩn mơi trường ngồi gặp điều kiện bất lợi Do việc sử dụng γ-PGA từ dạng neo giữ nghiên cứu [25] - Dạng 2: Axit poly γ-glutamic dạng tự tiết trực tiếp vào môi trường nuôi cấy: Dạng chủ yếu tìm thấy lồi lành tính chi Bacillus mà điển hình B subtilis Lồi vi khuẩn điển hình cho γ-PGA dạng tự B subtilis, γ-PGA chủ yếu tạo độ nhầy bao quanh tế bào vi khuẩn có vai trị cung cấp chất dinh dưỡng cho chúng trường hợp môi trường thiếu dinh dưỡng, giai đoạn suy vong vi khuẩn [40] 1.5 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA Nhiều công trình nghiên cứu chứng minh axit poly γ-glutamic sản sinh chủng vi khuẩn thuộc loài: B subtilis, B licheniformis, B thuringensis, B cereus, B pumilus, B amyloliquefaciens, B mojavensis, B atrophaeus, B megaterium, Staphylococcus epidermidis, Natrialba aegyptiaca, Lysinibacillus sphaericus Fusobacterium nucleatum số chủng vi khuẩn ứng dụng rộng rãi ngành công nghiệp đời sống [18, 44] 3.3.7 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống Lượng giống cấp cho trình lên men yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sinh tổng hợp, mật độ giống cấp yêu cầu lớn 106 CFU/ml Nghiên cứu khảo sát với tỷ lệ cấp giống chủng B subtilis T4 1%, 5%, 10%, 15% môi trường E thay cao nấm men NH4NO3 nồng độ 15 g/l, nuôi tĩnh nhiệt độ 40oC, pH=7, thời gian thu mẫu 120 giờ, Hàm lượng γ-PGA (g/l) đo 24 giờ/lần Kết thể hình 3.10: 1% 5% 10% 15% Tỷ lệ cấp giống (%) Hình 3.10: Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến trình sinh tổng hợp γ-PGA Lượng giống cấp với tỷ lệ 5% cho lượng γ-PGA lớn 7,219 g/l, hai tỷ lệ cấp giống 1% với 15% lượng γ-PGA nhỏ dao động 4,8 g/l Tỷ lệ cấp giống cao hay ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp, q vi khuẩn cần có thời gian sinh trưởng phát triển, cao dẫn tới trình cạnh tranh nguồn sinh dưỡng giai đoạn sinh trưởng, gây cân canh trường dẫn tới hình thành sản phẩm phụ, thay đổi pH, ảnh hưởng đến hiệu suất sinh γ-PGA Vì tỷ lệ cấp giống 5% lựa chọn làm thông số cho nghiên cứu 3.3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ L-Glutamic 50 Để khảo sát ảnh hưởng nồng độ L-Glutamic đến suất tạo γ-PGA tiến hành làm mẫu thí nghiệm với nồng độ L-Glutamic từ 10 g/l đến 35 g/l để đưa nồng độ thích hợp cho q trình nghiên cứu Kết thu thể hình 3.11: Hàm lượng γ-PGA (g/l) 10 15 20 25 30 35 Nồng độ L-glutamic (g/l) Hình 3.11: Ảnh hưởng nồng độ L-glutamic đến tổng hợp γ-PGA Kết nghiên cứu cho thấy hàm lượng γ-PGA đạt lớn 7,503 g/l nồng độ 30 g/l γ-PGA thấp 5,03 g/l nồng độ 10 g/l Khi B subtilis T4 sử dụng môi trường đặc hiệu, L-glutamic muối axit glutamic, muối axit hữu nên khả ảnh hưởng đến sinh trưởng đến Bacillus khác so với NaCl Vì nồng độ axit L-glutamic 30 g/l số liệu cho nghiên cứu 3.4 Điều kiện thu nhận γ-PGA Quá trình thu nhận γ-PGA sử dụng để nghiên cứu dựa nghiên cứu khoa học nước Tiến hành thu nhận dựa vào phương pháp: Mẫu sử dụng nước để thu hồi, sau kết tủa γ-PGA cồn lần lọc thẩm tách [22] Sau thu nhận kết bảng 3.5: 51 Bảng 3.5: Kết thu nhận γ-PGA Chủng Thời gian Kết thu nhận γ-PGA (g/l) T4 96 20,51 Từ kết cho thấy chủng B subtilis T4 sinh tổng hợp γ-PGA cao: tiền chất L-glutamat 30 g/l, axit citric 15 g/l, NH4NO3 15 g/l, tỷ lệ cấp giống 5%, nuôi tĩnh nhiệt độ 40oC, pH = sau thời gian 96 thu nhận γ-PGA có nồng độ 20,51 g/l Hình 3.12: Thu nhận γ-PGA từ chủng Bacillus T4 Tuy chưa thể kết luận có γ-PGA thành phần dịch nhớt, để chứng minh dịch nhớt có γ-PGA, tiến hành kết tủa phần dịch nhớt thủy phân kết tủa HCl 6N, dịch sau thủy phân đem thẩm tách loại muối Tiến hành chạy sắc ký mỏng dịch sau thẩm tích với mẫu chuẩn Lglutamic chất hiển thị màu ninhydrin thu kết hình 3.13: 52 Hình 3.13: Kết chạy sắc kí mỏng chạy thủy phân Chú thích: L-glutamic: Chất chuẩn 1, 2: Vị trí tra mẫu dịch thủy phân Hình 3.13: Cho thấy dịch nhớt sau thủy phân HCl 6M chủng B subtilis T4 xuất vết vị trí tương đương với vết axit glutamic chuẩn Điều chứng tỏ dịch nhớt canh trường lên men có chứa γ-PGA 53 3.5 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn Khả sinh enzym ngoại bào vi khuẩn đánh giá dựa mức độ phân giải chất, theo hiệu số đường kính vịng thủy phân Thử hoạt tính enzym tạo thành nguồn chất : hoạt tính cellulose sử dụng chất bổ sung môi trường carboxyl methyl cellulose (CMC), hoạt tính protease casein, hoạt tính amylase tinh bột tan, hoạt tính photphatase Ca3PO4 Sau 24 nuôi cấy thu kết đánh giá khả sinh tổng hợp số enzym ngoại bào chủng vi khuẩn T4 CP10 bảng 3.7: Bảng 3.8: Kết tổng hợp enzyme ngoại bào vi khuẩn Enzyme Đường kính vịng phân giải (D – d, mm) CP7 Protease 19±0,007 Cellulose 25±0,002 Amylase 25±0,005 Phosphatase 30,5±0,009 Ghi : D: Đường kính vịng phân giải (mm) T4 23±0,001 32±0,004 27±0,003 55±0,006 d: Đường kính khuẩn lạc (mm) Kết nghiên cứu bảng 3.8 cho thấy hình thành enzym ngoại bào chủng vi khuẩn CP7 T4 phần lớn giống nhau, nhiên chủng CP7 đường kính vịng phân giải nhỏ chủng T4, vào tiêu chí đánh giá độ tương đồng vi khuẩn T4 cao chủng CP7 Do việc sử dụng chủng T4 vào trình sinh tổng hợp γ-PGA cho mục đích chế biến thực phẩm, y học,… cần phải nghiên cứu sâu (tính chất an tồn, nguồn gốc vi sinh vật tổng hợp) Chủng B subtilis T4 lựa chọn sử dụng chủng giống cho trình nghiên cứu Thử nghiệm ứng dụng γ-PGA Trái nguồn cung cấp đường, khoáng, vitamin cho nhu cầu dinh dưỡng người, thành phần quan trọng hệ thống thực phẩm nguyên liệu quan trọng ngành công nghiệp thực phẩm Ngoài việc sử dụng trực tiếp, trái chế biến thành nhiều dạng sản phẩm khác như: 54 mứt, đóng hộp, sấy khơ, nước quả…Ngồi Indonesia, Thái Lan Philippine, Việt Nam nước có diện tích ăn lớn khu vực Đơng Nam Á có vùng sinh thái khác nên chủng loại ăn đa dạng Việc giữ cho trái tươi ngon, lâu hư vơ quan trọng Vì tơi thử nghiệm ứng dụng γ-PGA trái Hình 3.14: Hình ảnh sử dụng γ-PGA trái ngày thứ Sau ngày thấy rõ khác biệt hai đối chứng thí nghiệm γ-PGA làm tăng yếu tố giữ ẩm tự nhiên, điều chỉnh độ cân pH ổn định, tăng khả giữ nước trái Hình 3.15: Hình ảnh sử dụng γ-PGA trái ngày thứ ba Từ hình 3.17 ta thấy tổng thể theo mức độ thay đổi màu sắc chung cho thấy thay đổi màu sắc theo thời gian cho thấy biến đổi nhiều mẫu γPGA, mẫu chuối mẫu xoài xu hướng biến đổi màu sắc mẫu trái 55 màu nhạt đi, mẫu sử dụng γ-PGA mẫu đối chứng màu sắc sản phẩm không thay đổi nhiều, nhiên có xu hướng sẫm màu, chuyển sang màu đen, giảm tính cảm quan sản phẩm γ-PGA ứng dụng bảo quản nơng sản CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua q trình thực đề tài, tơi rút thu kết sau: - Trong 21 chủng, tuyển chọn chủng Bacillus subtilis T4 có khả sinh tổng hợp γ-PGA cao 21 chủng - Đã xác định điều kiện tối ưa chủng Bacillus subtilis T4 sinh tổng hợp γ-PGA cao: tiền chất L-glutamic 30 g/l, axit citric 15 g/l, NH4NO3 15 g/l, tỷ lệ cấp giống 5%, nuôi tĩnh nhiệt độ 40oC, pH = sau thời gian 96 thu nhận γ-PGA có nồng độ 20,51 g/l - γ-PGA bảo quản trái 4.2 Kiến nghị Vì hạn chế mặt thời gian, nên đề tài chưa triển khai thêm nhiều nội dung Để tăng hiệu ứng dụng tề tài này, đề nghị tiếp tục nghiên cứu thêm số nội dung sau: - Nghiên cứu tạo γ-PGA từ phụ phẩm nhà máy chế biến thực phẩm - Nghiên cứu sản xuất túi đựng sinh học tự phân hủy từ γ-PGA 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Phạm Hữu Lý; Đỗ Thị Bích Thanh Lê Đức Giang (2007), "Nghiên cứu số polyme bị phân hủy sinh học sở L-axit Glutamic", Tạp chí khoa học công nghệ 45(1), pp 47-54 Phạm Hữu Lý; Đỗ Thị Bích Thanh Lê Đức Giang (2009), "Tổng hợp poly L glutamic axit làm chất mang thuốc chống ung thư nhả chậm paclitaxel", Tạp chí Hóa học 5, pp 188-191 Trần Liên Hà (2010), Nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức từ đậu tương, Thành phố Hà Nội Sở Khoa học Công nghệ Tài liệu tiếng Anh Adetoro O; Aditya B; Irorere V; Hill D.; Williams V and Iza R (2015), "Poly- gamma-glutamic acid production, properties and applications", Microbiology 161 Akagi T; Kaneko T; Kida T and Akashi), " M (2005Preparation and characterization of biodegradable nanoparticles based on polyγ-glutamic acid with l-phenylalanine as a protein carrier", Journal of Controlled Release 108(2–3), pp 226-236 Akishige K and Haruki T (1995), "Determination of γ-Polyglutamic Using Cetyltrimethylammonium Bromide", Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi 42(11), pp 878-886 Ashiuchi M (2010), "Occurrence and Biosynthetic Mechanism of PolyGamma- Glutamic Acid", Amino-Acid Homopolymers Occurring in Nature 15, pp 77-93 Ashiuchi M (2010), "Occurrence and Biosynthetic Mechanism of PolyGammaGlutamic Acid", Amino-Acid Homopolymers Occurring in Nature 15, pp 77-93 Ashiuchi M and Misono H (2002), "Biochemistry and molecular genetics of poly- γ-glutamate synthesis", Applied Microbiology and Biotechnology 59(1), pp 9-14 10 Ashiuchi M.; Nakamura H.; Yamamoto T.; Kamei T.; Soda K.; Park C.; Sung M H.; Yagi T and Misono H (2003), "Poly-γ-glutamate depolymerase of Bacillus subtilis production, simple purification and substrate selectivity", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 23(2– 6), pp 249-255 11 Ashiuchi M.; Nawa C.; Kamei T.; Song J J.; Hong S P.; Sung M H.; Soda K.; Yagi T and Misono H (2001), "Physiological and biochemical characteristics of poly γ-glutamate synthetase complex of Bacillus subtilis", European Journal of Biochemistry 268(20), pp 5321-5328 12 Ashiuchi M.; Shimanouchi K.; Horiuchi T.; Kamei T and Misono H (2006), "Genetically Engineered Poly-gamma- glutamate Producer from Bacillus subtilis ISW1214", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 70(7), pp 1794-1797 13 Bajaj I B and Singhal R S (2010), "Effect of aeration and agitation on synthesis of poly γ-glutamic acid in batch cultures of Bacillus licheniformis NCIM 2324", Biotechnology and Bioprocess Engineering 15(4), pp 635-640 14 Bajaj I B and Singhal R S (2011), "Poly gamma glutamic acid – An emerging biopolymer of commercial interest", Bioresource Technology 102(10), pp 5551- 5561 15 Bhattacharyya D.; Hestekin J A.; Brushaber P.; Cullen L.; Bachas L G and Sikdar S K (1998), "Novel poly-glutamic acid functionalized microfiltration membranes for sorption of heavy metals at high capacity", Journal of Membrane Science 141(1), pp 121-135 16 Bhavik M and Argyrios M (2010), "A novel method for the selective recovery and purification of γ polyglutamic acid from Bacillus licheniformis fermetation broth", Biotechnol 26(3) 17 Bhunia B.; Mukhopadhy D G.; Mandal T and Dey A (2012), "Improved production, characterizationand flocculation properties of poly (γ)glutamic acid produced from Bacillus subtilis", Journal of Biochemical Technology 3(4) 18 Boris R.B (2002), "Biosynthesis of amino acids of the glutamate and aspartate families, alanine, and polyamines In Bacillus subtilis and its Closest Relatives", American Society for Microbiology., pp 203–231 19 Bovarnick M (1942), "The formation of extracellular D-Glutamic acid polypeptide by Bacillus subtilis", J Biol.Chem 145, pp 415-421 20 Candela T and Fouet, A (2005), "Bacillus anthracis CapD, belonging to the γ- glutamyltranspeptidase family, is required for the covalent anchoring of capsule to peptidoglycan", Molecular Microbiology 57(3), pp 717-726 21 Candela T and Fouet A (2006), "Poly-gamma-glutamate in bacteria", Molecular Microbiology 60(5), pp 1091-1098 22 Cheng C.; Asada Y and Aida T (1989), "Production of gamma;Polyglutamic Acid by Bacillus licheniformis A35 under Denitrifying Conditions", Agricultural and Biological Chemistry 53(9), pp 23692375 23 Chunhachart O.; Hanayama T.; Hidesaki M.; Tanimoto H and Tahara Y (2006), "Structure of the Hydrolyzed Product (F-2) Released from Poly gamma glutamic Acid by -Glutamyl Hydrolase YwtD of Bacillus subtilis", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 70(9), pp 2289-2291 24 Chunhachart O; Itoh T; Sukchotiratana M; Tanimoto H and Tahara Y (2006), "Characterization of gamma-Glutamyl Hydrolase Produced by Bacillus sp Isolated from Thai Thua-nao", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 70(11), pp 2779-2782 25 Cromwick A.M; Birrer G.A and Gross R.A (1996) "Effects of pH and aeration on γ-poly(glutamic acid) formation by Bacillus licheniformis in controlled batch fermentor cultures", Biotechnology and Bioengineering 50(2), pp 222-227 26 Goto A and Kunioka M (1992), "Biosynthesis and Hydrolysis of Poly(γglutamic acid) from Bacillus subtilis IF03335", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 56(7), pp 1031-1035 27 Hara T.; Fujio Y and Ueda (1982), "Polyglutamate production by bacillus subtilis (natto)", J Appl Biochem 3, pp 112-120 28 Hiroyuki T (2010), "Food Applications of Poly-Gamma-Glutamic Acid", Amino- Acid Homopolymers Occurring in Nature 15, pp 155-168 29 Ho G H.; Ho T I.; Hsieh K H.; Su Y C ; Lin P Y ; Yang J ; Yang K H and Yang S C (2006), "γ-Polyglutamic Acid Produced by Bacillus Subtilis (Natto): Structural Characteristics, Chemical Properties and Biological Functionalities", Journal of the Chinese Chemical Society 53(6), pp 1363-1384 30 House W and Riley D (1962), The biosynthesis of homopolymeric peptides, Biosynthesis Vol academic press, New York and London, 389-412 31 Hsieh C.W; Lin W.C; Hin W.C; Huang Y.P; Lai C H and Ko W C (2009), "Improvement of the stability of nattokinase using γ-polyglutamic acid as a coating material for microencapsulation", LWT - Food Science and Technology 42(1), pp 144-149 32 Huang Ji.; Du Y.; Xu G.; Zhang H.; Zhu F.; Huang L and Xu Z (2011), "High yield and cost-effective production of poly(γ-glutamic acid) with Bacillus subtilis", Engineering in Life Sciences 11(3), pp 291-297 33 Ivanovíc G and Erdos (1937), "Ein Beitrag zum Wesen der Kapselsubtanz des Milzbrandbazillus", Immunitatsforsch 90, pp 5-19 34 John F H.; Peter H.A.S.; Staley J.T and Williams S.T (1994), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Ninth ed, ed 9th, LWW, 754 35 Jung D Y.; Jung S.; Yun J S.; Kim J N.; Wee Y J.; Jang H G and Ryu H.W (2005), "Influences of cultural medium component on the production of poly(γ- glutamic acid) by Bacillus sp RKY3", Biotechnology and Bioprocess Engineering 10(4), pp 289-295 36 Kambourova M.; Tangney M and Priest F G (2001), "Regulation of Polyglutamic Acid Synthesis by Glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis", Applied and Environmental Microbiology 67(2), pp 1004-1007 37 Kedia G.; Hill H; Hill R and Radecka I (2010), "Production of poly-γglutamic acid by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis with different growth media ", J Nanosci Nanotechnol 10, pp 1-9 38 King E.C; Blacker A.J and Bugg T.D.H (2000), "Enzymatic Breakdown of Poly- γ-d-glutamic Acid in Bacillus licheniformis: Identification of a Polyglutamyl γ- Hydrolase Enzyme", Biomacromolecules 1(1), pp 75-83 39 Leonard C G ; Mattheis D K ; Mattheis M J and Housewright R D (1964), "Transformation to Prototrophy and Polyglutamic Acid Synthesis in Bacillus licheniformis", Journal of Bacteriology 88(1), pp 220-225 40 Luana P; Moraes N and Ranulfo M (2013), "The Existing Studies on Biosynthesis of Poly(ɣ -glutamic acid) by Fermentation", Food and Public Health 3(1), pp 28- 36 41 Manocha B., Margaritis A A Novel Method for the Selective Recovery and Purification gamma-Polyglutamic Acid from Bacillus licheniformis Fermentation Broth 2010 Biochemical 734-736 42 Mitsui N; Murasawa H and Sekiguchi J (2011), "Disruption of the cell wall lytic enzyme CwlO affects the amount and molecular size of polygamma-glutamic acid produced by Bacillus subtilis (natto)", The Journal of General and Applied Microbiology 57(1), pp 35-43 43 Park C; Choi J C and Choi Y.H (2005), "Synthesis of super-highmolecular- weight poly-γ-glutamic acid by Bacillus subtilis subsp chungkookjang", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 35(4-6), pp 128-133 44 Radu J E F.; Novak L.; Hartmann J.; Beheshti N.; Kjøniksen A L.; Nyström B and Borbély J (2008), "Structural and dynamical characterization of poly- gamma-glutamic acid-based cross-linked nanoparticles", Colloid and Polymer Science 286(4), pp 365-376 45 Sawamura S (1913), "On Bacillus Natto", J Coll Agric Tokyo 5(189191) 46 Shi F; Xu Z and Cen P (2006), "Efficient production of poly-γ-glutamic acid by bacillus subtilis ZJU-7", Applied Biochemistry and Biotechnology 133(3), pp 271-281 47 Shih I L and Van Y T (2001), "The production of poly-(gammaglutamic acid) from microorganisms and its various applications", Bioresource Technology 79(3), pp 207-25 48 Shih I L.; Chen L D and Wu J Y (2010), "Levan production using Bacillus subtilis natto cells immobilized on alginate", Carbohydrate Polymers 82(1), pp 111-117 49 Shih I L.; Van Y T and Chang Y N (2002), "Application of statistical experimental methods to optimize production of poly(γ-glutamic acid) by Bacillus licheniformis CCRC 12826", Enzyme and Microbial Technology 31(3), pp 213- 220 50 Sung M H.; Park C.; Kim C J.; Poo H.; Soda K and Ashiuchi M (2005), "Natural and edible biopolymer poly-γ-glutamic acid: synthesis, production, and applications", The Chemical Record 5(6), pp 352-366 51 Toshio H and Seinosuke U (1982), "Regulation of Polyglutamate Production in Bacillus subtilis (natto): Transformation of High PGA Productivity", Agricultural and Biological Chemistry 46(9), pp 22752281 52 Troy F.A (1973), "Chemistry and biosynthesis of poly γ D glutamyl capsule in Bacillus licheniformis", J Biol Chem 248, pp 305 - 316 53 Vedan I (2006), Gamma-poly-glutamic acid, Vedan Taiwan 54 Wang L L.; Wu Y X.; Xu R W.; Wu G Y and Yang W T (2008), "Synthesis and Characterization of Poly L-Glutamic Acid-Co-L-Aspartic Acid", Chinese Journal of Polymer Science 26(04), pp 381-391 55 Weng T M and Chen M T (2010), "Changes of Protein in Natto (a fermented soybean food) Affected by Fermenting Time", Food Science and Technology Research 16(6), pp 537-542 56 Wu Q; Xu H; Liang J and Yao J (2010), "Contribution of Glycerol on Production of Poly(γ-Glutamic Acid) in Bacillus subtilis NX-2", Applied Biochemistry and Biotechnology 160(2), pp 386-392 57 Wu Q; Xu H; Xu L and Ouyang P (2006), "Biosynthesis of poly(γglutamic acid) in Bacillus subtilis NX-2: Regulation of stereochemical composition of poly(γ- glutamic acid)", Process Biochemistry 41(7), pp 1650-1655 58 Yang L C; Wu J B; Ho G H; Yang S C; Huang Y P and Lin W C (2008), "Effects of Poly-γ-glutamic Acid on Calcium Absorption in Rats", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 72(12), pp 3084-3090 59 Yoon S H.; Jin H D.; Sang Y L and Ho N C (2000), "Production of poly-γ- glutamic acid by fed-batch culture of Bacillus licheniformis", Biotechnology Letters 22(7), pp 585-588 60 Yoshihito I.; Takeshi T.; Tetsuo O and Yoshihiro A (1996), "Glutamic Acid Independent Production of Poly(γ-glutamic acid) by Bacillus subtilis TAM-4", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 60(8), pp 12391242 61 Yung S S and Wen C S (2010), "Improving The Emulsion Stability of Sponge Cake by The Addition of γ-Polyglutamic Acid", Journal of Marine Science and Technology 18(6), pp 895-900 62 Zeng W.; Chen G.; Zhang Y.; Wu K and Liang Z (2012), "Studies on the UV spectrum of poly(γ-glutamic acid) based on development of a simple quantitative method", International Macromolecules 51(1–2), pp 83-90 Journal of Biological OD490 nm PHỤ LỤC 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 y = 0.0571x + 0.1729 R² = 0.9858 OD490 10 15 γ-PGA (µg/ml) Hình PL1: Đường chuẩn xác định hàm lượng γ-PGA Bảng PL 3: Kết thu nhận γ-PGA Chủng Kết thu nhận γ-PGA (g/l) Thời gian T4 96 20,51±0,03 Bảng PL4: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh γ-PGA Nhiệt độ 20 30 35 40 45 24 48 72 96 120 1.396 1.592 1.702 1.971 1.423 1.479 1.783 3.189 4.092 3.513 1.603 2.816 3.718 4.713 4.238 2.723 3.943 5.073 6.362 5.732 1.61 2.67 3.702 4.928 4.302 Bảng PL5: Ảnh hưởng pH đến khả sinh γ-PGA pH 24 48 72 96 120 2,059±0,003 2,442±0,006 3,947±0,002 4,551±0,001 4,035±0,001 2,271±0,002 2,775±0,007 4,209±0,007 5,141±0,009 4,242±0,011 2,749±0,007 4,862±0,012 5,485±0,009 6,891±0,012 6,018±0,010 2,069±0,004 2,46±0,007 3,948±0,002 5,378±0,008 3,977±0,010 1,999±0,001 2,28±0,007 2,856±0,009 3,582±0,002 3,035±0,000