2.2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp
- Cơ sở khoa học
Miệng là môi trường dễ nhiễm nấm, vi khuẩn, vi rút,… . Do đó, việc thu nhận răng từ bệnh nhân, thu nhận mô tủy và bảo quản được ở tình trạng vô trùng cho đến khi thực hiện thí nghiệm là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong nuôi cấy tế bào.
Sau khi được thu nhận, ba quần thể tế bào chủ yếu gồm: tế bào hồng cầu, tế bào bạch cầu và tế bào tủy (trong đó có quần thể tế bào gốc trung mô ứng viên). Các tế bào hồng cầu và bạch cầu trưởng thành là những tế bào không có khả năng bám dính trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy. Ngoài các tế bào bạch cầu non có khả năng bám dính còn có quần thể tế bào tủy răng. Do đó, việc chọn lọc tế bào gốc trung mô được tiến hành trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt cho phép tế bào gốc trung mô ứng viên sống sót và tăng sinh.
27
- Phương pháp thực hiện
Sau khi nhổ, răng được loại bỏ tối đa các phần mô mềm (như bao răng, dây chằng nha chu) bằng dụng cụ vô trùng. Các mẫu răng này sẽ được bảo quản trong lọ có chứa dung dịch D′MEM bổ sung 300UI/ml penicillin, 300μg/ml streptomycin, 0,75μg/ml amphotericin B (fungizone®). Sau đó, khử trùng bằng Betadine trong 10 phút và rửa lại bằng PBS.
Tủy răng được lấy ra trong điều kiện vô khuẩn và sang chấn tối thiểu. Sau đó, mẫu tủy được cắt thành những mảnh nhỏ (1x 2 x 1 mm) bằng lưỡi dao phẫu thuật và được chuyển vào đĩa 35mm; sau đó, thêm 2 ml môi trường D′MEM/F12 bổ sung 10% FBS (Fetal bovine serum), 2mM L-glutamin, 100U/ml penicillin, 100µg/ml streptomycin. Các mảnh mô được nuôi cấy ở 370C, 5% CO2. Môi trường được thay hai ngày một lần.
2.2.3.2. Phương pháp cấy chuyền tế bào tủy răng
- Cơ sở khoa học
Khi mật độ tế bào trong bình nuôi đạt khoảng 70 – 80%, tiến hành cấy chuyền nhằm cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho tế bào tăng sinh và phát triển đạt hiệu quả cao.
- Phương pháp thực hiện
Khi tế bào đạt 75 – 80% bề mặt đĩa nuôi thì tiến hành cấy chuyền. Khi đó, hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ, rửa bề mặt đĩa nuôi 2 – 3 lần với PBS. Sau đó, cho 1ml trypsin/EDTA vào đĩa nuôi, ủ ở 370C trong 2 phút. Khi toàn bộ tế bào đã tách khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy và có dạng hình tròn thì thêm vào đĩa nuôi 1ml môi trường để bất hoạt trypsin/EDTA.
Chuyển toàn bộ dịch tế bào trên vào bình Roux 25cm2, tiến hành thêm 3ml môi trường vào Roux và tiếp tục nuôi ở 370C, 5% CO2.
Trong toàn bộ các nghiên cứu sau, các tế bào ở thế hệ P4 được lựa chọn để thực hiện.
28
2.2.4. Đánh giá tế bào tủy răng thu được
2.2.4.1. Phương pháp xác định kiểu hình miễn dịch
- Cơ sở khoa học
Flow cytometry là phương pháp định lượng và phân tích đa đặc điểm của đơn vật thể, thông thường là tế bào khi chúng chảy thành dòng xuyên qua một chùm ánh sáng. Các tính chất được định lượng bao gồm kích thước, tính chất hạt hoặc mức độ phức tạp bên trong và mật độ phát huỳnh quang. Các đặc điểm này được xác định bởi hệ thống: quang học – điện tử, nhằm ghi nhận sự phát quang của tế bào. Các tín hiệu phát quang này được cảm nhận bằng máy dò, chuyển đến máy tính xử lí và cung cấp thông tin.
Tế bào P4 được phân tích marker đặc trưng cho tế bào gốc trung mô dựa theo quy trình chuẩn bị tế bào cho phân tích Flow cytometry theo hướng dẫn của BD Bioscience.
- Phương pháp thực hiện
Phương pháp flow cytometry được tiến hành khi tế bào P4 đạt độ phủ kín khoảng 80-90% để xác định sự biểu hiện của các marker tế bào gốc trung mô trên bề mặt tế bào.
Các tế bào P4 được thu nhận bằng trypsin/EDTA 0,25%, điều chỉnh mật độ tế bào đạt 106 tế bào/ml. Huyền phù tế bào trong 1 ml Facs Flow và nhuộm với 10µl kháng thể trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (CD34-FITC, CD45-FITC, CD13-PE, CD44-PE, CD90- FITC, CD166-PE, BD Sciences, San Jose, CA). Làm lạnh mẫu trong 15 phút ở 40C. Tiến hành đánh giá marker tế bào bằng máy FACS Calibur sử dụng phần mềm Cell Quest Pro.
2.2.4.2. Khảo sát sự tăng trưởng của tế bào thu được từ mảnh mô
- Cơ sở khoa học
Đường cong tăng trưởng được thiết lập để phân tích các đặc điểm tăng trưởng của kiểu tế bào hay dòng tế bào. Sử dụng buồng đếm hồng cầu để đếm trực tiếp số lượng tế bào và từ đó suy ra sự tăng trưởng. Ngoài ra, việc sử dụng trypan blue khi đếm tế bào sẽ làm tăng độ chính xác và dễ dàng tiến hành .
29
- Phương pháp thực hiện
Cấy chuyền tế bào P3 sang đĩa 96 giếng với mật độ 3x104 tế bào/ml cho mỗi giếng, nuôi trong môi trường D′MEM/F12 bổ sung 10% FBS, 2mM L-glutamin, 100U/ml penicillin, 100µg/ml streptomycin ở 370C, 5% CO2 và thay môi trường hai ngày một lần.
Mỗi ngày đếm số tế bào ở 3 giếng ngẫu nhiên, mỗi giếng đếm 3 lần và đếm trong 11 ngày.
- Xử lí số liệu
Các số liệu sau khi thu nhận được xử lý bằng chương trình Excel 2003, tính toán thống kê sai số chuẩn và độ khác biệt có ý nghĩa nhỏ nhất (Least Significant Different – LSD) ở mức xác suất p=95% bằng phương pháp phân tích phương sai (Analysis of Variance – ANOVA) theo chương trình Statgraphic 7.0, 1997 của trường đại học Michigan (Mỹ)..
2.2.5. Khảo sát sự bám dính và tăng sinh của tế bào tủy răng trên giá thể ngà đã xử lý đã xử lý
2.2.5.1. Phương pháp đưa tế bào lên giá thể - Phương pháp tách tế bào - Phương pháp tách tế bào
Khi các tế bào P3 đạt 75 – 80% bề mặt bình nuôi, tiến hành thu nhận tế bào. Khi đó, hút bỏ môi trường cũ, rửa lại với PBS từ 2 – 3 lần. Sau đó, thêm 2 ml trypsin/EDTA vào Roux, ủ 370C trong 2 phút. Khi các tế bào có hình tròn và nổi lên trên bề mặt dung dịch, thêm môi trường nuôi vào Roux để bất hoạt trypsin (1:1). Tiến hành ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó, loại bỏ dịch nổi, tái huyền phù cặn tế bào với 1 ml môi trường và xác định mật độ tế bào.
- Phương pháp đưa tế bào tủy răng người lên giá thể ngà
Agar hòa tan với nước cất ở nồng độ 1% và được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, agar được giữ ở máy ổn nhiệt 700C. Tiến hành cho agar 1% vào 15 giếng của đĩa 96 giếng (50 µl /giếng); sau 30 phút, cố định giá thể ngà vào agar. Khi đó, đưa tế bào lên giá thể (mật độ 3x104 tế bào / ngà), thêm 100 µl môi trường vào mỗi giếng. Sau mỗi hai ngày thay môi trường một lần.
30
2.2.5.2. Phương pháp MTT - Cơ sở khoa học - Cơ sở khoa học
Dung dịch MTT là một loại tetrazole có màu vàng. MTT (tên đầy đủ là [3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]) được chuyển hóa thành tinh thể formazan màu tím trong tế bào sống dưới tác dụng của enzym sucinate dehydrogenase, một loại enzym reductase trong ti thể. Số lượng tế bào càng lớn sẽ tạo ra một lượng formazan càng lớn, do đó làm tăng mật độ quang. Phương pháp này giúp ta đánh giá được số tế bào còn sống hoặc khả năng tăng trưởng của tế bào ở thời điểm khảo sát.
Phương pháp MTT cho kết quả tương đối chính xác, đơn giản, an toàn hơn phương pháp đo độ hấp thu phóng xạ, đặc hiệu cho khả năng biến dưỡng ở tế bào sống, có khả năng đo được số lượng mẫu lớn, đặc biệt là có khả năng đo được cả những mẫu có cấu trúc 3 chiều.
Hình 2.3. Nguyên tắc phương pháp MTT [3]
- Phương pháp thực hiện
Tiến hành khảo sát MTT qua các mốc thời gian 2, 4, 6, 8, 10 ngày trên 2 nhóm:
Nhóm 1: nhóm đối chứng – tế bào P4 được nuôi trên giếng không có giá thể ngà răng.
Nhóm 2: tế bào P4 được nuôi trên giá thể ngà đã được xử lý.
Ở các mốc thời gian, mỗi nhóm chọn ba giếng, cho vào mỗi giếng 200 µl môi trường D′MEM/F12 bổ sung 10% FBS và 20µl dung dịch MTT 5mg/ml, trộn
tetrazole
Enzym reductase của ti thể
31
đều dung dịch, ủ 4 giờ trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Sau đó, hút bỏ toàn bộ môi trường và cho 220 µl DMSO/ethanol, ủ 4 giờ trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Tiếp theo, hút toàn bộ dung dịch trong ba giếng vào ống eppendorf và cho thêm 780 µl DMSO. Khi đó, sử dụng dung dịch DMSO/ethanol chỉnh mật độ quang máy đo OD về 0. Chuyển dung dịch cần đo OD vào cuvet, tiến hành đo OD lặp lại 3 lần và ghi nhận kết quả.
- Xử lí số liệu
Số liệu sau khi thu nhận được xử lý bằng chương trình Excel 2003, tính toán giá trị trung bình, thống kê sai số chuẩn và độ tin cậy ở mức xác suất p=95% bằng phương pháp t-test so sánh thống kê 2 mẫu dị phương sai (t-test: Two-sample Assuming Unequal Variances).
2.2.5.3. Phương pháp SEM
- Cơ sở khoa học
Kính hiển vi điện tử quét là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.
- Phương pháp thực hiện
Xử lý mẫu giá thể và tiến hành nuôi tế bào tuỷ răng người lên bề mặt ngà, cố định giá thể trên trong dung dịch formalin 10% đệm phosphate, bảo quản trong điều kiện lạnh bằng đá gel. Sau đó mẫu sẽ được chuyển đến phòng thí nghiệm Hiển vi điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tể Trung ương để chụp SEM.
32
3.1. Thu nhận và xử lý giá thể từ mô ngà răng người 3.1.1. Thu nhận các mẫu ngà từ thân răng người
Từ một mẫu răng thu nhận được một hoặc hai mẫu ngà, có kích thước 1 x 2 x 1 mm.
Tổng số mẫu răng cắt: 9 mẫu.
Tổng số mẫu ngà thu được: 18 mẫu, trong đó, có 15 mẫu ngà thích hợp để làm thí nghiệm.
Dựa vào kết quả trên, để thu nhận được giá thể ngà tốt nên dùng các mẫu răng: răng cối lớn, răng khôn và răng phải còn nguyên vẹn.
Hình 3.1. Mẫu ngà thu nhận để làm thí nghiệm sau khi xử lý
3.1.2. Đánh giá kết quả xử lí bề mặt của giá thể ngà răng
Sau khi mẫu ngà được cắt và tạo hình từ mẫu răng, tiến hành xử lý bề mặt ngà bằng những dung dịch hóa học. Các chất hóa học có trong các dung dịch ấy sẽ có tác động đến bề mặt ngà và có thể làm loại bỏ được lớp mùn ngà (smear - lớp giữa tủy và ngà răng).
Các giá thể ngà răng sau khi xử lý đã được đánh giá hiệu quả bằng kính hiển vi điện tử quét. Kết quả được trình bày ở hình 3.2 và hình 3.3.
33
Hình 3.2. Mẫu chứng bề mặt ngà chưa xử lý
Hình 3.3. Bề mặt ngà xử lý bằng EDTA / Axit Citric
Qua kết quả chụp SEM ta nhận thấy:
- Ở mẫu đối chứng, lớp mùn ngà được quan sát thấy khá rõ. Vì không có tác động hóa học cũng như vật lý lên bề mặt ngà nên không loại bỏ được lớp mùn ngà.
- Bề mặt ngà được xử lý để lộ ra các ống ngà trên bề mặt có mật độ dày với kích thước các lỗ ngà khá đồng nhất. Chứng tỏ giá thể đã loại được lớp mùn ngà. Trước khi xử lý bằng dung dịch EDTA / Axit Citric, bề mặt ngà được xử lý cơ học.
Lỗ ngà
34
Chính tác động cơ học này đã làm tăng khả năng loại bỏ được lớp mùn ngà một cách hiệu quả.
- Bề mặt ngà tạo ra có cấu trúc xốp và kích thước lỗ bên trong giá thể dao động từ 2-3 μm, điều này phù hợp với công trình nghiên cứu trước đây: đặc tính của ngà răng là một mô có độ đàn hồi cao, tương đối xốp và có tính thấm; đường kính bề mặt ngà răng người trung bình 2,94 μm [38].
Sousa Neto và cộng sự cho thấy sự cần thiết phải loại bỏ lớp mùn của ngà răng để bề mặt giá thể có độ bám dính cao hơn. Trong nghiên cứu in vitro, Orstavik và Haapasalo đã chỉ ra tầm quan trọng của việc loại bỏ lớp mùn và sự hiện diện của ống ngà răng nhằm giảm thời gian cần thiết để đạt được hiệu quả khử trùng của thuốc intracanal. Bystrom và Sundqvist cũng nhận thấy rằng sự hiện diện của một lớp mùn ngà có thể ngăn chặn hoặc trì hoãn đáng kể sự xâm nhập của các tác nhân kháng khuẩn như irrigants intracanal và thuốc vào các ống ngà. Kouvas và cộng sự, Kennedy và cộng sự báo cáo rằng lớp mùn ngà là một yếu tố tiêu cực trong việc bịt kín ống chân răng [32].
Các nhà nghiên cứu rất quan tâm đến việc loại bỏ các lớp mùn trước khi thâm nhập vào rãnh nhỏ ngà răng [32]. Trong điều trị nội nha, EDTA thường được sử dụng để loại bỏ các mảnh vụn hữu cơ và vô cơ được tạo ra trong điều trị tủy, do khả năng hòa tan hàm lượng khoáng trong ngà răng [6]. Ngoài ra, trong in vitro, có nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng EDTA trong việc loại bỏ lớp mùn ngà, đồng thời làm lỏng lẻo cấu trúc ngà sẽ giúp giải phóng các yếu tố kích tạo. Các yếu tố này sẽ kích thích sự biệt hóa của tế bào gốc tủy răng được nuôi cấy trên giá thể ngà thành nguyên bào ngà.
Axit Citric là một axit hữu cơ thuộc loại yếu. Trong lĩnh vực thí nghiệm thì nó đóng vai trò như là một chất tẩy rửa, an toàn đối với môi trường và đồng thời là tác nhân chống oxy hóa. Ở nhiệt độ phòng, axit citric là chất kết tinh màu trắng, có khả năng hòa tan trong nước, làm sạch bề mặt ngà.
35
Tác động của việc ngâm các mẫu ngà trong PBS từ 5 – 7 ngày giúp loại bỏ các bụi bẩn trong quá trình tạo hình giá thể và các hóa chất xử lý, khử trùng; không gây ảnh hưởng đến sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt ngà.
Vậy qui trình thu nhận và xử lý giá thể ngà đã được xác lập:
Đây là qui trình đã được công bố bởi George T.-J. Huang và cộng sự (2005), có ưu điểm là sử dụng những hóa chất được dùng trong điều trị nội nha. Tuy nhiên, qui trình do chúng tôi xác lập có sự khác biệt với qui trình của George T.-J. Huang ở
Mẫu răng
Loại bỏ mô mềm, dây chằng nha chu
Ngâm EDTA 17% trong 10 phút
Ngâm NaOCl 5,25% trong 30 phút
Rửa bằng PBS
Giá thể ngà răng đã xử lý Ngâm axit citric 19% trong 1 phút
Ngâm Povidine iod 10% trong 30 phút Cắt dọc mẫu theo bề rộng nhất để thu ngà.
36
việc đã sử dụng bề mặt nhám của máy cắt răng để tạo lực tác động cơ học mạnh và đều khắp bề mặt ngà nên cho kết quả tốt trong việc thu nhận và xử lý giá thể ngà so với công trình nghiên cứu khác đã được công bố.
3.2. Kết quả nuôi cấy tế bào gốc từ tủy răng người
3.2.1. Kết quả nhuộm Hematoxylin – Eosin (H&E) mô tủy răng
Nhằm xác định sự hiện diện của tế bào trong mô tủy răng sau khi tách ra khỏi mô cứng (men, ngà), chúng tôi đã nhuộm H&E.
Kết quả được trình bày ở hình 3.4 và 3.5.
Hình 3.4. Mô tủy răng sau khi nhuộm H&E (100X)
Hình 3.5. Mô tủy răng sau khi nhuộm H&E (200X)
37
Kết quả nhuộm H&E mô tủy răng cho thấy:
- Mật độ tế bào trong tủy răng là khá dày đặc. Tế bào có nhiều hình dạng nhưng chiếm đa số là các tế bào có hình thoi kéo dài. Các tế bào này có thể là tế bào