Năm 2011, Trần Lê Bảo Hà và cộng sự tiến hành nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào gốc tủy răng áp dụng trong kỹ nghệ mô. Kết quả cho thấy đã phân lập và nuôi cấy thành công tế bào gốc từ mô tuỷ răng người [54].
19
2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu vật
- Răng cối và răng tiền cối được thu từ:
Khoa Nội Nha, Bệnh viện Răng Hàm Mặt Thành phố Hồ Chí Minh.
Khoa Răng Hàm Mặt, Trường Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh - Tiêu chuẩn chọn mẫu:
Được sự đồng ý của người hiến tặng (bệnh nhân).
Bệnh nhân nhổ răng phải được thực hiện các xét nghiệm máu (thời gian đông máu, công thức máu); răng không bị sâu, không bị viêm nha chu và răng phải còn nguyên vẹn.
Bệnh nhân có răng mọc lệch hay ngầm cần nhổ hoặc có chỉ định nhổ.
Răng được nhổ theo yêu cầu của chỉnh hình.
Bệnh nhân có răng dư gây biến chứng. - Tiêu chuẩn loại trừ:
Bệnh nhân không đồng ý cho mẫu.
Răng mọc lệch hay ngầm phức tạp phải nhổ bằng phương pháp chia cắt răng.
Răng bị tổn thương cấu trúc ảnh hưởng đến tủy trong khi nhổ.
20 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị Bảng 2.1. Danh sách các dụng cụ sử dụng STT Tên STT Tên 1 Bercher (50ml, 100ml, 250ml) 15 Gạc vô trùng 2 Erlen (50ml, 100ml) 16 Bông gòn 3 Bình Duran (50ml, 100ml) 17 Giấy nhôm 4 Màng lọc vô trùng 0,22µm 18 Giấy thấm 5 Đĩa 35mm 19 Parafilm 6 Đĩa 96 giếng 20 Lọ thu mẫu
7 Bình Roux 25cm2 21 Buồng đếm hồng cầu
8 Bình định mức (50 ml, 100 ml) 22 Lame, lamelle 9 Đĩa Petri 23 Lưỡi dao phẫu thuật 10 Cá từ 24 Kéo, kiềm cắt mẫu 11 Eppendorf 1,5ml 25 Kẹp cong, kẹp thẳng 12 Đầu tip (100µl, 1000µl) 26 Ống bóp
13 Micropipette 100µl, 1000µl 27 Ống falcon 15ml 14 Pipette 1ml, 10ml
21
Bảng 2.2 Danh sách các thiết bị sử dụng
STT Tên Hãng
1 Tủ nuôi cấy mô và tế bào Sanyo 2 Kính hiển vi đảo ngược Narishage 3 Nồi hấp khử trùng Daihan 4 Máy ly tâm Hettich 5 Máy khuấy từ Stuart 6 Máy đo OD Sanyo
7 Tủ lạnh chứa hóa chất Sanyo, Toshiba 8 Cân điện tử A & D
2.1.3. Hóa chất Dung dịch PBS 1X Dung dịch PBS 1X
Dung dịch PBS 10X thương mại (Sigma) 10 ml Nước cất 90 ml Bảo quản ở nhiệt độ 40C
Dung dịch PBS Kháng sinh
Dung dịch PBS 1X 900 ml Antibiotic-antimycotic (Sigma) 01 ml Bảo quản ở nhiệt độ 40C.
Dung dịch tách tế bào: Trypsin/EDTA 0,25 %
Trypsin thương mại (Sigma) 0,25 g EDTA thương mại (Sigma) 0,093 g PBS 1X đủ 100 ml Bảo quản ở nhiệt độ 40C.
22
Dung dịch EDTA 17%
EDTA thương mại (Sigma) 17g Nước cất 100 ml Chuẩn về pH 8
Bảo quản ở nhiệt độ phòng
Dung dịch Axit citric 19%
Axit citric thương mại (Sigma) 19g Nước cất 100 ml Bảo quản ở nhiệt độ phòng
Dung dịch khử trùng
Povidine Iod 10% (Betadine) bảo quản trong tủ lạnh 40C
Dung dịch NaOCl 5,25% (Sodium Hypochlorite) bảo quản ở nhiệt độ phòng
Dung dịch bảo quản mẫu răng
D′MEM bổ sung 300UI/ml penicillin, 300μg/ml streptomycin, 0,75μg/ml amphotericin B (fungizone®)
Bảo quản ở nhiệt độ 40C
Môi trường nuôi cấy mảnh mô
D′MEM/F12
10% FBS (Fetal bovine serum – Huyết thanh bào thai bò) 2mM L-glutamin
100U/ml penicillin, 100µg/ml streptomycin Bảo quản ở nhiệt độ 40C
Hóa chất chạy Flow cytometry
Sheath Fluid (BD Bioscience, San Jose, CA) 2 l FACSflow (BD Bioscience, San Jose, CA) 2 l
Kháng thể phân tích Tế bào gốc trung mô: anti-CD13-PE, anti-CD166-PE, anti- CD34-FITC, anti-CD44-PE, anti-CD45-FITC, anti-CD90-FITC, fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated goat anti-mouse IgG (BD Biosciences).
23
Dung dịch MTT (3-[4,5-dimethylthiazoyl]-2-5-diphenyltetrazolium bomide)
Dung dich MTT (thương mại) 05mg
Nước cất 01ml
Bảo quản ở nhiệt độ 40C
Dung dịch DMSO/ethanol (thương mại) Cồn 700
Thuốc nhuộm Trypan Blue (thương mại) Formalin 4% đệm phosphate (thương mại)
24
2.2. Phương pháp
2.2.1. Sơ đồ quy trình thí nghiệm tổng quát
Xử lý bề mặt ngà
Khảo sát sự bám dính và tăng sinh Đưa tế bào lên giá thể
Nuôi tế bào thu từ tủy
Cấy chuyền Mẫu răng Thu tủy răng
Cắt thành những mẫu ngà có kích thước 1 x 2 x 1mm Xác định tế bào gốc tủy răng Chụp SEM Phương pháp MTT
25 Vị trí cắt dọc mẫu răng Vị trí thu mẫu ngà răng
2.2.2. Tạo giá thể từ ngà răng người
- Cơ sở khoa học
Lớp mùn ngà là lớp giữa cấu trúc ngà - tủy, gồm có các nguyên bào ngà, các sợi collagen và các protein bề mặt. Do đó, ngà răng sau khi được thu nhận, để đảm bảo cho giá thể giảm tính kháng nguyên và tế bào có thể bám, tăng sinh trên bề mặt ngà thì cần tiến hành xử lý loại bỏ lớp mùn ngà trên bề mặt.
- Thu nhận các mẫu ngà từ thân ngà răng người
Sau khi nhổ, răng được loại bỏ tối đa các phần mô mềm như bao răng, dây chằng nha chu và ngâm cồn 700 trong 30 giây.
Tiêu chuẩn để chọn mẫu ngà cho thí nghiệm
Buồng tủy của răng rộng và có kích thước tương đối bằng nhau.
Cắt phần thân ngà răng theo kích thước mẫu 1 x 2 x 1mm.
Bề mặt ngà sạch, không bị hư hại
Mẫu răng được cắt dọc theo bề rộng nhất để thu ngà.
26
- Xử lý bề mặt ngà
Mẫu ngà thu nhận được sau khi tạo hình sẽ được tiến hành xử lý bề mặt. Bề mặt ngà được chà bằng phần nhám ở đầu của mũi máy cắt. Sau đó, tiến hành xử lý với dung dịch EDTA / Axit citric: ngâm các mẫu ngà trong dung dịch EDTA 17% trong 10 phút và dung dịch axit citric 19% trong 1 phút.
- Phương pháp khử trùng
Sau khi xử lý bề mặt, các mẫu ngà sẽ lần lượt được khử trùng bằng Povidine Iod 10% (Betadine) và NaOCl 5,25%, mỗi hóa chất trong 30 phút và trong điều kiện vô trùng.
- Đánh giá kết quả xử lí bề mặt của giá thể ngà răng
Các giá thể ngà răng sẽ được cố định trong dung dịch formalin 10% đệm phosphate, bảo quản trong điều kiện lạnh bằng đá gel. Sau đó, mẫu sẽ được chuyển đến phòng thí nghiệm Công nghệ Nano, Đại học Quốc gia TP.HCM để chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).
2.2.3. Qui trình nuôi cấy tế bào tủy răng người 2.2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp 2.2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp
- Cơ sở khoa học
Miệng là môi trường dễ nhiễm nấm, vi khuẩn, vi rút,… . Do đó, việc thu nhận răng từ bệnh nhân, thu nhận mô tủy và bảo quản được ở tình trạng vô trùng cho đến khi thực hiện thí nghiệm là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong nuôi cấy tế bào.
Sau khi được thu nhận, ba quần thể tế bào chủ yếu gồm: tế bào hồng cầu, tế bào bạch cầu và tế bào tủy (trong đó có quần thể tế bào gốc trung mô ứng viên). Các tế bào hồng cầu và bạch cầu trưởng thành là những tế bào không có khả năng bám dính trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy. Ngoài các tế bào bạch cầu non có khả năng bám dính còn có quần thể tế bào tủy răng. Do đó, việc chọn lọc tế bào gốc trung mô được tiến hành trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt cho phép tế bào gốc trung mô ứng viên sống sót và tăng sinh.
27
- Phương pháp thực hiện
Sau khi nhổ, răng được loại bỏ tối đa các phần mô mềm (như bao răng, dây chằng nha chu) bằng dụng cụ vô trùng. Các mẫu răng này sẽ được bảo quản trong lọ có chứa dung dịch D′MEM bổ sung 300UI/ml penicillin, 300μg/ml streptomycin, 0,75μg/ml amphotericin B (fungizone®). Sau đó, khử trùng bằng Betadine trong 10 phút và rửa lại bằng PBS.
Tủy răng được lấy ra trong điều kiện vô khuẩn và sang chấn tối thiểu. Sau đó, mẫu tủy được cắt thành những mảnh nhỏ (1x 2 x 1 mm) bằng lưỡi dao phẫu thuật và được chuyển vào đĩa 35mm; sau đó, thêm 2 ml môi trường D′MEM/F12 bổ sung 10% FBS (Fetal bovine serum), 2mM L-glutamin, 100U/ml penicillin, 100µg/ml streptomycin. Các mảnh mô được nuôi cấy ở 370C, 5% CO2. Môi trường được thay hai ngày một lần.
2.2.3.2. Phương pháp cấy chuyền tế bào tủy răng
- Cơ sở khoa học
Khi mật độ tế bào trong bình nuôi đạt khoảng 70 – 80%, tiến hành cấy chuyền nhằm cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho tế bào tăng sinh và phát triển đạt hiệu quả cao.
- Phương pháp thực hiện
Khi tế bào đạt 75 – 80% bề mặt đĩa nuôi thì tiến hành cấy chuyền. Khi đó, hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ, rửa bề mặt đĩa nuôi 2 – 3 lần với PBS. Sau đó, cho 1ml trypsin/EDTA vào đĩa nuôi, ủ ở 370C trong 2 phút. Khi toàn bộ tế bào đã tách khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy và có dạng hình tròn thì thêm vào đĩa nuôi 1ml môi trường để bất hoạt trypsin/EDTA.
Chuyển toàn bộ dịch tế bào trên vào bình Roux 25cm2, tiến hành thêm 3ml môi trường vào Roux và tiếp tục nuôi ở 370C, 5% CO2.
Trong toàn bộ các nghiên cứu sau, các tế bào ở thế hệ P4 được lựa chọn để thực hiện.
28
2.2.4. Đánh giá tế bào tủy răng thu được
2.2.4.1. Phương pháp xác định kiểu hình miễn dịch
- Cơ sở khoa học
Flow cytometry là phương pháp định lượng và phân tích đa đặc điểm của đơn vật thể, thông thường là tế bào khi chúng chảy thành dòng xuyên qua một chùm ánh sáng. Các tính chất được định lượng bao gồm kích thước, tính chất hạt hoặc mức độ phức tạp bên trong và mật độ phát huỳnh quang. Các đặc điểm này được xác định bởi hệ thống: quang học – điện tử, nhằm ghi nhận sự phát quang của tế bào. Các tín hiệu phát quang này được cảm nhận bằng máy dò, chuyển đến máy tính xử lí và cung cấp thông tin.
Tế bào P4 được phân tích marker đặc trưng cho tế bào gốc trung mô dựa theo quy trình chuẩn bị tế bào cho phân tích Flow cytometry theo hướng dẫn của BD Bioscience.
- Phương pháp thực hiện
Phương pháp flow cytometry được tiến hành khi tế bào P4 đạt độ phủ kín khoảng 80-90% để xác định sự biểu hiện của các marker tế bào gốc trung mô trên bề mặt tế bào.
Các tế bào P4 được thu nhận bằng trypsin/EDTA 0,25%, điều chỉnh mật độ tế bào đạt 106 tế bào/ml. Huyền phù tế bào trong 1 ml Facs Flow và nhuộm với 10µl kháng thể trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (CD34-FITC, CD45-FITC, CD13-PE, CD44-PE, CD90- FITC, CD166-PE, BD Sciences, San Jose, CA). Làm lạnh mẫu trong 15 phút ở 40C. Tiến hành đánh giá marker tế bào bằng máy FACS Calibur sử dụng phần mềm Cell Quest Pro.
2.2.4.2. Khảo sát sự tăng trưởng của tế bào thu được từ mảnh mô
- Cơ sở khoa học
Đường cong tăng trưởng được thiết lập để phân tích các đặc điểm tăng trưởng của kiểu tế bào hay dòng tế bào. Sử dụng buồng đếm hồng cầu để đếm trực tiếp số lượng tế bào và từ đó suy ra sự tăng trưởng. Ngoài ra, việc sử dụng trypan blue khi đếm tế bào sẽ làm tăng độ chính xác và dễ dàng tiến hành .
29
- Phương pháp thực hiện
Cấy chuyền tế bào P3 sang đĩa 96 giếng với mật độ 3x104 tế bào/ml cho mỗi giếng, nuôi trong môi trường D′MEM/F12 bổ sung 10% FBS, 2mM L-glutamin, 100U/ml penicillin, 100µg/ml streptomycin ở 370C, 5% CO2 và thay môi trường hai ngày một lần.
Mỗi ngày đếm số tế bào ở 3 giếng ngẫu nhiên, mỗi giếng đếm 3 lần và đếm trong 11 ngày.
- Xử lí số liệu
Các số liệu sau khi thu nhận được xử lý bằng chương trình Excel 2003, tính toán thống kê sai số chuẩn và độ khác biệt có ý nghĩa nhỏ nhất (Least Significant Different – LSD) ở mức xác suất p=95% bằng phương pháp phân tích phương sai (Analysis of Variance – ANOVA) theo chương trình Statgraphic 7.0, 1997 của trường đại học Michigan (Mỹ)..
2.2.5. Khảo sát sự bám dính và tăng sinh của tế bào tủy răng trên giá thể ngà đã xử lý đã xử lý
2.2.5.1. Phương pháp đưa tế bào lên giá thể - Phương pháp tách tế bào - Phương pháp tách tế bào
Khi các tế bào P3 đạt 75 – 80% bề mặt bình nuôi, tiến hành thu nhận tế bào. Khi đó, hút bỏ môi trường cũ, rửa lại với PBS từ 2 – 3 lần. Sau đó, thêm 2 ml trypsin/EDTA vào Roux, ủ 370C trong 2 phút. Khi các tế bào có hình tròn và nổi lên trên bề mặt dung dịch, thêm môi trường nuôi vào Roux để bất hoạt trypsin (1:1). Tiến hành ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó, loại bỏ dịch nổi, tái huyền phù cặn tế bào với 1 ml môi trường và xác định mật độ tế bào.
- Phương pháp đưa tế bào tủy răng người lên giá thể ngà
Agar hòa tan với nước cất ở nồng độ 1% và được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, agar được giữ ở máy ổn nhiệt 700C. Tiến hành cho agar 1% vào 15 giếng của đĩa 96 giếng (50 µl /giếng); sau 30 phút, cố định giá thể ngà vào agar. Khi đó, đưa tế bào lên giá thể (mật độ 3x104 tế bào / ngà), thêm 100 µl môi trường vào mỗi giếng. Sau mỗi hai ngày thay môi trường một lần.
30
2.2.5.2. Phương pháp MTT - Cơ sở khoa học - Cơ sở khoa học
Dung dịch MTT là một loại tetrazole có màu vàng. MTT (tên đầy đủ là [3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]) được chuyển hóa thành tinh thể formazan màu tím trong tế bào sống dưới tác dụng của enzym sucinate dehydrogenase, một loại enzym reductase trong ti thể. Số lượng tế bào càng lớn sẽ tạo ra một lượng formazan càng lớn, do đó làm tăng mật độ quang. Phương pháp này giúp ta đánh giá được số tế bào còn sống hoặc khả năng tăng trưởng của tế bào ở thời điểm khảo sát.
Phương pháp MTT cho kết quả tương đối chính xác, đơn giản, an toàn hơn phương pháp đo độ hấp thu phóng xạ, đặc hiệu cho khả năng biến dưỡng ở tế bào sống, có khả năng đo được số lượng mẫu lớn, đặc biệt là có khả năng đo được cả những mẫu có cấu trúc 3 chiều.
Hình 2.3. Nguyên tắc phương pháp MTT [3]
- Phương pháp thực hiện
Tiến hành khảo sát MTT qua các mốc thời gian 2, 4, 6, 8, 10 ngày trên 2 nhóm:
Nhóm 1: nhóm đối chứng – tế bào P4 được nuôi trên giếng không có giá thể ngà răng.
Nhóm 2: tế bào P4 được nuôi trên giá thể ngà đã được xử lý.
Ở các mốc thời gian, mỗi nhóm chọn ba giếng, cho vào mỗi giếng 200 µl môi trường D′MEM/F12 bổ sung 10% FBS và 20µl dung dịch MTT 5mg/ml, trộn
tetrazole
Enzym reductase của ti thể
31
đều dung dịch, ủ 4 giờ trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Sau đó, hút bỏ toàn bộ môi trường và cho 220 µl DMSO/ethanol, ủ 4 giờ trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Tiếp theo, hút toàn bộ dung dịch trong ba giếng vào ống eppendorf và cho thêm 780 µl DMSO. Khi đó, sử dụng dung dịch DMSO/ethanol chỉnh mật độ quang máy đo OD về 0. Chuyển dung dịch cần đo OD vào cuvet, tiến hành đo OD lặp lại 3 lần và ghi nhận kết quả.
- Xử lí số liệu
Số liệu sau khi thu nhận được xử lý bằng chương trình Excel 2003, tính toán giá trị trung bình, thống kê sai số chuẩn và độ tin cậy ở mức xác suất p=95% bằng phương pháp t-test so sánh thống kê 2 mẫu dị phương sai (t-test: Two-sample Assuming Unequal Variances).
2.2.5.3. Phương pháp SEM
- Cơ sở khoa học
Kính hiển vi điện tử quét là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.
- Phương pháp thực hiện
Xử lý mẫu giá thể và tiến hành nuôi tế bào tuỷ răng người lên bề mặt ngà, cố định giá thể trên trong dung dịch formalin 10% đệm phosphate, bảo quản trong điều kiện lạnh bằng đá gel. Sau đó mẫu sẽ được chuyển đến phòng thí nghiệm Hiển vi điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tể Trung ương để chụp SEM.