Các marker bề mặt trên mẫu tế bào thu được sau 3 lần cấy chuyền được phân tích bằng kỹ thuật flow cytometry trên hệ thống FACS. Các marker âm tính và dương tính được phân tích đồng thời trên cùng một mẫu tế bào.
Hình 3.11. Kết quả phân tích sự biểu hiện một số marker của tế bào tủy răng sau 3 lần cấy chuyền
42
Kết quả phân tích tế bào gốc trung mô ứng viên sau 3 lần cấy chuyền (Hình 3.11.) cho thấy, tế bào âm tính với 2 marker CD34 (0,42%), CD45 (0,08%)và dương tính với 4 marker CD13 (99,97%), CD44 (99,84%), CD90 (97,34%), CD166 (98,18%).
Từ các kết quả thu được, chúng tôi thấy rằng quần thể tế bào thu nhận từ tủy răng người đã có tính đồng nhất và độ ổn định ở thế hệ nuôi cấy thứ tư. Các tề bào biểu hiện dương tính với các marker bề mặt của tế bào gốc trung mô.
3.3.2. Kết quả đánh giá sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt đĩa nuôi
Các tế bào thế hệ thứ 3 được cấy chuyền sang đĩa 96 giếng với mật độ 3x104 tế bào/cm2.
Mật độ tế bào được xác định mỗi ngày bằng buồng đếm hồng cầu với tế bào được nhuộm trypan blue. Sử dụng buồng đếm hồng cầu để đếm trực tiếp số lượng tế bào và từ đó suy ra sự tăng trưởng, việc sử dụng trypan blue khi đếm tế bào sẽ làm tăng độ chính xác và dễ dàng tiến hành.
Đường cong tăng trưởng của tế bào sau lần cấy chuyền thứ ba được xây dựng dựa vào mật độ tế bào xác định được.
Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng của tế bào tủy răng người nuôi cấy ở lần cấy chuyền thứ 3
43
Đồ thị 3.1 cho thấy:
- Trong ngày đầu tiên, mật độ tế bào thấp hơn so với mật độ ban đầu (104 tế bào/cm2) đưa vào giếng nuôi. Tế bào phát triển rất chậm trong 24 giờ cấy chuyền. Trong thời gian này, tế bào chết nhiều hơn tế bào mới sinh ra, do một số tế bào chết do hoạt tính của trypsin, còn số còn lại sau khi xử lý bởi trypsin, các protein bám bị phá vỡ, tế bào cần có thời gian để tổng hợp các protein bám bị mất, do đó hoạt động phân bào kém.
- Trong 2 ngày tiếp theo, mật độ tế bào tăng nhưng không nhiều, không có sự khác biệt về mặt thống kê.
- Từ ngày 3 đến ngày 5, tế bào tăng sinh mạnh mẽ. Lúc này, tế bào đã được tổng hợp đầy đủ các yếu tố bám dính, đồng thời tế bào đã thích nghi với môi trường mới nên phân bào nhanh chóng. Mật độ tế bào thu được cao nhất ngày 6.
- Từ ngày 7 đến ngày 8, mật độ tế bào bắt đầu giảm và giảm mạnh ở ngày 7, do số lượng tế bào quá nhiều, dẫn đến sự kìm hãm tiếp xúc giữa các tế bào với nhau, cũng như diện tích bề mặt nuôi cấy bị giới hạn khi mật độ tế bào cao, dẫn đến hạn chế sự tăng sinh của tế bào.
- Từ ngày 9, tế bào tiếp tục giảm, có thể do tế bào không đủ không gian nên khả năng phân bào kém.
Như vậy, sau khi được cấy chuyền, tế bào tăng sinh mạnh từ ngày 2 đến ngày 6, đạt cao nhất vào ngày 6, sau đó giảm nhanh đến ngày 9. Điều này chứng tỏ tế bào đã tăng sinh và đạt mức tối đa vào ngày thứ 6.
Kết quả flow cytometry và đường cong tăng trưởng cho thấy các tế bào thu nhận từ tủy răng có khả năng bám dính trên bề mặt của dụng cụ nuôi cấy và tăng sinh mạnh mẽ. Hình thái của các tế bào này khá giống với hình thái của nguyên bào sợi người [30]. Các tế bào phân tích dương tính với các marker như CD13, CD90, CD44, CD166 và âm tính đồng thời với các marker như CD34, CD45. Kết quả của nghiên cứu này đã chứng minh rằng tế bào tủy răng có khả năng bám dính, tăng sinh và duy trì được đặc tính gốc trong điều kiện nuôi cấy in vitro.
44
3.4. Kết quả khảo sát sự tăng sinh của tế bào gốc tủy răng trên bề mặt giá thể ngà
Nhằm khảo sát khả năng bám, tăng sinh của tế bào gốc tủy răng trên bề mặt giá thể ngà, phương pháp MTT đã được sử dụng.
Hình 3.12. Giá thể ngà sau khi ủ hóa chất MTT: a) Giá thể không có tế bào, (b) Giá thể có tế bào
Quan sát hình 3.12. ta thấy:
- Giá thể ngà răng nuôi tế bào sau khi ủ với dung dịch MTT thì trên bề mặt xuất hiện tinh thể formazan màu tím.
- Tinh thể formazan do dung dịch MTT chuyển hóa thành dưới tác dụng của enzym sucinate dehydrogenase, một loại enzym reductase trong ti thể của tế bào sống. Điều này chứng tỏ có tế bào bám trên bề mặt ngà. Số lượng tế bào càng lớn sẽ tạo ra một lượng formazan càng lớn, do đó làm tăng mật độ quang (OD).
Phương pháp này giúp ta đánh giá được số tế bào còn sống hoặc khả năng tăng trưởng của tế bào ở thời điểm khảo sát.
45
Đồ thị 3.2. Biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang (OD) với các mốc thời gian nuôi cấy
Phương pháp MTT là phương pháp so màu nhạy, có tính định lượng, đáng tin cậy để xác định sự sống, tăng sinh của tế bào. Trong thử nghiệm MTT, mật độ quang của dịch nuôi cấy tế bào tỉ lệ với số lượng tế bào trên giá thể.
Kết quả từ đồ thị 3.2 cho thấy: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Mật độ quang cả 2 nhóm ở ngày thứ 2 xấp xỉ nhau, do tế bào đang hồi phục sau cấy chuyền, do đó hoạt động phân bào kém, tốc độ tăng trưởng chậm.
- Từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 6, tế bào tăng dần, có sự khác biệt về mặt thống kê ở cả 2 nhóm. Chứng tỏ từ ngày 4 đến ngày 6 là thời điểm tế bào được kích thích tăng sinh rất mạnh; tế bào đều tăng sinh đạt ngưỡng vào ngày 6; đến ngày 8, giá trị OD giảm nhiều so với ngày 6 và giảm mạnh vào ngày 10. Có thể do sau khi tăng sinh mạnh, đạt ngưỡng vào ngày 6, tế bào bước vào giai đoạn tăng sinh ổn định nên tốc độ tăng sinh ngày càng giảm và vào pha suy tàn vào ngày 8.
46
Điều này phù hợp về thời gian tăng trưởng của tề bào tuỷ răng người thu được từ kết quả thí nghiệm ở mục 3.3.2, tế bào tăng trưởng cao nhất ở ngày thứ 6 và giảm mạnh đến ngày thứ 9.
So sánh kết quả đo giá trị OD giữa hai nhóm 1
- Ở ngày 4, mật độ quang nhóm 1 (nhóm đối chứng) cao hơn 1,32 lần so với nhóm 2 (nhóm tế bào được nuôi trên giá thể ngà đã được xử lý), nhưng đến ngày 6, nhóm 2 tăng lên 1,08 lần so với nhóm 1, điều này có thể do những ngày đầu, tuy tế bào ở cả 2 nhóm đều phân chia kém nhưng ở nhóm 1 được nuôi trên giếng nên diện tích tiếp xúc lớn, tế bào bám và lan rộng hơn nên đạt mật độ cao hơn.
- Từ ngày 4 đến ngày 6, tốc độ tăng sinh của nhóm 2 cách biệt khá lớn so với nhóm 1. Sau ngày 6, giá trị OD ở nhóm 2 cao hơn nhóm 1 vào các mốc thời gian khảo sát. Điều này chứng tỏ tế bào đã tăng sinh nhanh khi được nuôi trên giá thể ngà được xử lý EDTA/axit citric. Đối với tế bào nhóm 1, sau ngày 6 giá trị OD giảm mạnh là do khi mật độ tế bào tăng sẽ dẫn đến kìm hãm tiếp xúc và sự cạnh tranh môi trường sống diễn ra làm cho các tế bào sẽ giảm ở các ngày tiếp theo.
Giá thể ngà xử lý bề mặt bằng dung dịch EDTA / Axit citric loại sạch hoàn toàn lớp mùn ngà, để lộ ra các ống ngà và khuôn nền ngoại bào gồm các collagen dạng sợi nên giúp tế bào tăng sinh tốt.
3.5. Khả năng bám của tế bào gốc tuỷ răng trên giá thể
Kết quả chụp SEM giá thể ngà xử lý bề mặt có chứa tế bào gốc tủy răng sau một thời gian nuôi cấy, được trình bày ở hình 3.13 và hình 3.14.
47
Hình 3.13. Tế bào bám trên giá thể xử lý bằng EDTA / Axit citric (x600)
Hình 3.14. Tế bào bám trên giá thể xử lý bằng EDTA / Axit citric (x7.000)
Quan sát hình 3.13, hình 3.14, ta nhận thấy có sự hiện diện và bám dính của tế bào gốc tủy răng trên giá thể xử lý bằng dung dịch EDTA / Axit citric.
48
KẾT LUẬN
- Đã thu nhận và xử lý được ngà răng người bằng phương pháp cơ học kết hợp phương pháp hóa học sử dụng EDTA và axit citric.
- Đã thu nhận và nuôi cấy thành công tế bào từ mảnh mô tủy răng người. Quần thể tế bào thu nhận được có khả năng bám dính trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy, tăng sinh mạnh và có biểu hiện với một số marker đặc trưng tế bào gốc trung mô
- Giá thể ngà đã xử lý có khả năng hỗ trợ sự bám dính tế bào gốc tủy răng người trên bề mặt và tăng sinh mạnh, đạt ngưỡng vào ngày nuôi cấy thứ 6 trong điều kiện nuôi cấy in vitro.
KIẾN NGHỊ
Để tiếp tục phát triển đề tài và hướng tới việc ứng dụng các kết quả nghiên cứu đạt được, một số kiến nghị được đưa ra như sau:
- Đánh giá thành phần giá thể ngà răng đã xử lý nhằm tăng khả năng hỗ trợ của giá thể ngà trong nuôi cấy tế bào gốc tủy răng và hình thành phức hợp ngà – tủy.
- Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào tủy răng và giá thể ngà để đạt mật độ tế bào cao hơn trong thời gian ngắn.
- Đánh giá tính tương hợp sinh học của mảnh ghép giá thể ngà răng chứa tế bào gốc tủy răng trên mô hình động vật và các thử nghiệm lâm sàng.
ix
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tham khảo tiếng Việt
[1] Trần Lê Bảo Hà (2004), Thiết kế và đánh giá màng Gelatin-Aginate trong điều trị tổn thương bỏng, luận văn thạc sỹ sinh học, trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên TPHCM.
[2] Hoàng Tử Hùng (2001), Mô phôi răng miệng, Nhà xuất bản Y học, thành phố Hồ Chí Minh, 119-188.
[3] Hoàng Tử Hùng (2003), Giải phẫu răng, Nhà xuất bản Y học, thành phố Hồ Chí Minh, 20-38. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[4] Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2006), Công nghệ Sinh học trên Người và Động vật, Nhà xuất bản Giáo dục, thành phố Hồ Chí Minh, 101-114, 171-207, 695-753.
II. Tài liệu tham khảo tiếng Anh
[5] A. Tonomura (2010), Differential Effect of Scaffold Shape on Dentin regeneration, Annals of Biomedical Engineering, 38, 1664 -1671.
[6] A. Khademi, M. Feizianfard (2004), The Effect of EDTA and Citric Acid on Smear Layer Removal of Mesial Canals of First Mandibular Molars, A Scanning Electron Microscopic Study, Journal of Research in Medical Sciences, 2, 80-88. [7] A. Ohazama, S.A.C. Modino, I. Miletich and P. T. Sharpe (2004), Stem Cell
Based Tissue Engineering of Murine Teeth, Journal of Dental Research, 83, 518–522.
[8] Abigail S. Tucker and Paul T. Sharpe (2004), The Cutting Edge of Mammalian Development: How the Embryo Makes Teeth, Nature Reviews Genetics, 5, 499–508.
[9] Brendan A.C. Harley, Hyung-Do Kim, Muhammad H. Zaman, Ioannis V. Yannas, Douglas A. Lauffenburger, and Lorna J. Gibson. (2008), Micro- architecture of three-dimensional scaffolds influences cell migration behavior via junction interactions, Journal of Biophysics.
x
[10] C. Mauth, A.Huwig, U. Graf-Hausner and J-F.Roulet (2007), Restorative Applications for Dental Pulp Therapy, Topics in Tissue Engineering, 3, 1-32. [11] C.H. Chu et al. (2011), Dentin hypersensitivity and its management, Featured
in General Dentistry, 115-122.
[12] C.S. Young et al. (2002), Tissue Engineering of Complex Tooth Structures on Biodegradable Polymer Scaffolds, Journal of Dental Research, 81, 695.
[13] Cheryl T. Gomillion, Karen J.L. Burg (2006), Stem cells and adipose tissue engineering, Biomaterials, 27, 6052–6063.
[14] Chun SY, Lee HJ, Choi YA, Kim KM, Baek SH, Park HS (2011), Analysis of the soluble human tooth proteome and its ability to induce dentin/tooth regeneration. Tissue Engineering Part A, 17, 181-91.
[15] Conan S. Young, Shinichi Terada, Joseph P. Vacanti, Masaki Honda, John D. Bartlett and Pamela C. Yelick (2002), Tissue Engineering of Complex Tooth Structures on Biodegradable Polymer Scaffolds, Journal of Dental Research, 81, 695–700.
[16] DA Wahl and JT Czernuszka (2006), Collagen – Hydroxyapatite composites for hard tissue repair, European cells and materials, 11, 43-56.
[17] Duailibi MT, Duailibi SE, Young CS, Bartlett JD, Vacanti JP, Yelick PC (2004), Bioengineered teeth from cultured rat tooth bud cells, Journal of Dental Research, 83, 523-8.
[18] Eric L.Gotlieb et al. (2008), An Ultrastructural Investigation of Tissue – Engineered Pulp Constructs Implanted Within Endodontically Treated Teeth, The Journal of the American dental association, 457 – 465.
[19] G.Bluteau et al. (2008), Stem Cells For Tooth Engineering, European Cells and Materials, 16, 1-9.
[20] George T.-J.Hang et al. (2006), In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods ang culturing enviroment, Cell and Tissue Research.
xi
[21] Ghada A. Karien (2009), Dental Pulp Stem Cells, a New Era in Tissue Engineering, Smile Dental Journal, 4.
[22] Gottfried Schmalz, Helmut Schweikl, Manfred Eibl (1994), Growth kinetics of fibroblasts on bovine dentin, Journal of Endodontics, 20, 453-456.
[23] Hatefi A., Amsden B. (2002), Biodegradable injectable in situ forming drug delivery systems, Journal of Controlled Release, 80, 9-28.
[24] Jakub Suchanek et al. (2007), Human dental pulp stem cell-isolation and long term cultivation, Acta Medica, 50, 195-201.
[25] James C. Mc Kenzie, Robert M. Klein (2000), Basic concepts in cell biology and histology, McGraw Hill International Edition, 325-331.
[26] Jinhua Yuet al. (2006), Differentiation of dental pulp stem cell into Regular- Shaped Dentin-Pulp Complex Induced by Tooth Germ Cell Conditioned Medium, Tissue Engineering, 12, 3097-3105.
[27] Junjie Wu, Fang Jin et al. (2008), Dentin non – collagenous proteins (dNCPs) can stimulate dental follicle cells to differentiate into cementoblast lineages,
Biology of the Cell, 291 – 302.
[28] K.U.Zaman, T.Sugaya, H.Kato (1999), Effect of recombinant human platelet- derived growth factor-BB and bone morphogenetic protein-2 application to demineralized dentin on early periodontal ligament cell response, Journal of Periodontal Research, 34, 244 – 250.
[29] Kuo TF, Huang AT, Chang HH, Lin FH, Chen ST, Chen RS (2008), Regeneration of dentin-pulp complex with cementum and periodontal ligament formation using dental bud cells in gelatin-chondroitin-hyaluronan tri-copolymer scaffold in swine, Journal of Biomedical Materials Research Part A, 86A, 1062- 8. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[30] Lee, O.K., Kuo, T.K., Lee, S.L., Chen, T.H. (2004), Isolation of multi-potent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood, Blood, 103,1669-75.
[31] Liu J, Jin T, Chang S, Ritchie HH, Smith AJ, Clarkson BH (2007), Matrix and TGF-beta-Related gene expression during human dental pulp stem cell
xii
(DPSC) mineralization, In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal, 43, 120-8.
[32] Manoel et al. (2002), Evaluation of the Effect of EDTA, EGTA and CDTA on Dentin Adhesiveness and Microleakage with Different Root Canal Sealers,
Brazilian Dental Journal, 13(2): 123-128.
[33] Marcy Wong et al. (2004), Alginates in Tissue Engineering, Biopolymer Methods in Tissue Engineering, 238, 77-87.
[34] Marshall Jr GW, Marshall SJ, Kinney JH, Balooch M (1997), The dentin substrate: structure and properties related to bonding, Journal of Dentistry, 25, 441-58.
[35] Misako Nakashima and Akifumi Akamine (2005), The Application of Tissue Engineering to Regeneration of Pulp and Dentin in Endodontics, Journal of Endodontics, 31, 711-718.
[36] Misako Nakashima1 & A Hari Reddi (2003), The application of bone morphogenetic proteins to dental tissue engineering, Nature biotechnology, 21. [37] Monica T. Duailibi, Silvio E. Duailibi, Conan S. Young, John D. Bartlett,
Joseph P. Vacanti and Pamela C. Yelick (2004), Bioengineered Teeth from Cultured Rat Tooth Bud Cells, Journal of Dental Research, 83, 523–528.
[38] Murilo Baena LOPES et al. (2009), Comparative Study of Tubular Diameter and Quantity for Human and Bovine Dentin at Different Depths, Brazilian Dental Journal, 20(4), 279-283.
[39] Nadir Babay et al. (2001), SEM study on the effect of two different demineralization methods with saturated tetrecyline hydrochloride on diseased root surfaces, The Journal of contemporary dental practice, 2.
[40] Park, Hye-Sim Cho, Tae-Geon Kwon, Sin-Nam Jang, Sang-Han Lee, Chang- Hyeon An, Hong-In Shin, Jae-Young Kim, Je-Yoel Cho (2009), Proteomics analysis of human dentin reveals distinct protein expression profiles, Journal of Proteome Research, 8, 1338-46.
xiii
[41] Peter E. Murray et al. (2007), Regenerative Endodontics: A Review of Current Status ang a Call for Action, Journal of Endodontics, 33, 377-390.
[42] Rania M. El-Backly et al. (2008), Regeneration of dentin/pulp-like tissue using a dental pulp stem cell/poly(lactic-co-glycolic) acid scaffold construct in New Zealand white rabbits, Astralian Endodontics Journal, 34, 52-67.
[43] Robert S. Langer and Joseph P. Vacanti (1999), Tissue Engineering: The Challenges Ahead, Scientific American, 280, 86–89.
[44] Rodney F. Boyer (1993), Modern experimental Biochemistry, The Benjamin/Cummings Publising Company, 90-95.
[45] Rui Li et al. (2011), Human treated dentin matrix as a natural scaffold for complete human dentin tissue regeneration, Biomaterials, 1-14.
[46] S.L. Edwards, W. Mitchell, J.B. Matthews, E. Ingham, S.J. Russell (2004), Design of nonwoven scaffold structures for tissue engineering of the anterior cruciate ligament, Autex Research Journal.
[47] Schwartz Z, Lohmann CH et al. (2000), Osteoblast proliferation and differentiation on dentin slices are modulated by pretreatment of the surface with tetracycline or osteoclasts, Journal of Periodontal, 586 – 597.
[48] Shulamit Levenberg, Ngan F. Huang, Erin Lavik, Arlin B. Rogers, Joseph Itskovitz-Eldor, and Robert Langer (2003), Differentiation of human embryonic stem cells on three-dimensional polymer scaffolds, The National Academy of Sciences,100 (22), 12741-12746.
[49] Shunji Kumabe et al. (2006), Human dental pulp stem cell culture and cell Transplantation with an alginate scaffold, Okajimas Folia Anatomica Japonica, 84, 147-156.
[50] Sofia S.A. Oliveira, Megan K.Pugach et al. (2003), The influence of the dentin smear layer on adhesion: a self – etching primer vs. a total – etch system,
xiv
[51] Suchanek W, Yoshimura M (1998), Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants,
Journal of Materials Research, 13(1), 94-117.
[52] Thomas D.Larson et al (2005), The Clinical Significance and Management of Microleakage, Northwest Dentistry, 84.
[53] Tina Mygind, Maik Stiehler, Anette Baatrup, Haisheng Li, Xuenong Zou, Allan Flyvbjerg, Moustapha Kassem and Cody Bünger (February 2007), Mesenchymal stem cell ingrowth and differentiation on coralline hydroxyapatite (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});