- Cơ sở khoa học
Kính hiển vi điện tử quét là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.
- Phương pháp thực hiện
Xử lý mẫu giá thể và tiến hành nuôi tế bào tuỷ răng người lên bề mặt ngà, cố định giá thể trên trong dung dịch formalin 10% đệm phosphate, bảo quản trong điều kiện lạnh bằng đá gel. Sau đó mẫu sẽ được chuyển đến phòng thí nghiệm Hiển vi điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tể Trung ương để chụp SEM.
32
3.1. Thu nhận và xử lý giá thể từ mô ngà răng người 3.1.1. Thu nhận các mẫu ngà từ thân răng người
Từ một mẫu răng thu nhận được một hoặc hai mẫu ngà, có kích thước 1 x 2 x 1 mm.
Tổng số mẫu răng cắt: 9 mẫu.
Tổng số mẫu ngà thu được: 18 mẫu, trong đó, có 15 mẫu ngà thích hợp để làm thí nghiệm.
Dựa vào kết quả trên, để thu nhận được giá thể ngà tốt nên dùng các mẫu răng: răng cối lớn, răng khôn và răng phải còn nguyên vẹn.
Hình 3.1. Mẫu ngà thu nhận để làm thí nghiệm sau khi xử lý
3.1.2. Đánh giá kết quả xử lí bề mặt của giá thể ngà răng
Sau khi mẫu ngà được cắt và tạo hình từ mẫu răng, tiến hành xử lý bề mặt ngà bằng những dung dịch hóa học. Các chất hóa học có trong các dung dịch ấy sẽ có tác động đến bề mặt ngà và có thể làm loại bỏ được lớp mùn ngà (smear - lớp giữa tủy và ngà răng).
Các giá thể ngà răng sau khi xử lý đã được đánh giá hiệu quả bằng kính hiển vi điện tử quét. Kết quả được trình bày ở hình 3.2 và hình 3.3.
33
Hình 3.2. Mẫu chứng bề mặt ngà chưa xử lý
Hình 3.3. Bề mặt ngà xử lý bằng EDTA / Axit Citric
Qua kết quả chụp SEM ta nhận thấy:
- Ở mẫu đối chứng, lớp mùn ngà được quan sát thấy khá rõ. Vì không có tác động hóa học cũng như vật lý lên bề mặt ngà nên không loại bỏ được lớp mùn ngà.
- Bề mặt ngà được xử lý để lộ ra các ống ngà trên bề mặt có mật độ dày với kích thước các lỗ ngà khá đồng nhất. Chứng tỏ giá thể đã loại được lớp mùn ngà. Trước khi xử lý bằng dung dịch EDTA / Axit Citric, bề mặt ngà được xử lý cơ học.
Lỗ ngà
34
Chính tác động cơ học này đã làm tăng khả năng loại bỏ được lớp mùn ngà một cách hiệu quả.
- Bề mặt ngà tạo ra có cấu trúc xốp và kích thước lỗ bên trong giá thể dao động từ 2-3 μm, điều này phù hợp với công trình nghiên cứu trước đây: đặc tính của ngà răng là một mô có độ đàn hồi cao, tương đối xốp và có tính thấm; đường kính bề mặt ngà răng người trung bình 2,94 μm [38].
Sousa Neto và cộng sự cho thấy sự cần thiết phải loại bỏ lớp mùn của ngà răng để bề mặt giá thể có độ bám dính cao hơn. Trong nghiên cứu in vitro, Orstavik và Haapasalo đã chỉ ra tầm quan trọng của việc loại bỏ lớp mùn và sự hiện diện của ống ngà răng nhằm giảm thời gian cần thiết để đạt được hiệu quả khử trùng của thuốc intracanal. Bystrom và Sundqvist cũng nhận thấy rằng sự hiện diện của một lớp mùn ngà có thể ngăn chặn hoặc trì hoãn đáng kể sự xâm nhập của các tác nhân kháng khuẩn như irrigants intracanal và thuốc vào các ống ngà. Kouvas và cộng sự, Kennedy và cộng sự báo cáo rằng lớp mùn ngà là một yếu tố tiêu cực trong việc bịt kín ống chân răng [32].
Các nhà nghiên cứu rất quan tâm đến việc loại bỏ các lớp mùn trước khi thâm nhập vào rãnh nhỏ ngà răng [32]. Trong điều trị nội nha, EDTA thường được sử dụng để loại bỏ các mảnh vụn hữu cơ và vô cơ được tạo ra trong điều trị tủy, do khả năng hòa tan hàm lượng khoáng trong ngà răng [6]. Ngoài ra, trong in vitro, có nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng EDTA trong việc loại bỏ lớp mùn ngà, đồng thời làm lỏng lẻo cấu trúc ngà sẽ giúp giải phóng các yếu tố kích tạo. Các yếu tố này sẽ kích thích sự biệt hóa của tế bào gốc tủy răng được nuôi cấy trên giá thể ngà thành nguyên bào ngà.
Axit Citric là một axit hữu cơ thuộc loại yếu. Trong lĩnh vực thí nghiệm thì nó đóng vai trò như là một chất tẩy rửa, an toàn đối với môi trường và đồng thời là tác nhân chống oxy hóa. Ở nhiệt độ phòng, axit citric là chất kết tinh màu trắng, có khả năng hòa tan trong nước, làm sạch bề mặt ngà.
35
Tác động của việc ngâm các mẫu ngà trong PBS từ 5 – 7 ngày giúp loại bỏ các bụi bẩn trong quá trình tạo hình giá thể và các hóa chất xử lý, khử trùng; không gây ảnh hưởng đến sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt ngà.
Vậy qui trình thu nhận và xử lý giá thể ngà đã được xác lập:
Đây là qui trình đã được công bố bởi George T.-J. Huang và cộng sự (2005), có ưu điểm là sử dụng những hóa chất được dùng trong điều trị nội nha. Tuy nhiên, qui trình do chúng tôi xác lập có sự khác biệt với qui trình của George T.-J. Huang ở (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu răng
Loại bỏ mô mềm, dây chằng nha chu
Ngâm EDTA 17% trong 10 phút
Ngâm NaOCl 5,25% trong 30 phút
Rửa bằng PBS
Giá thể ngà răng đã xử lý Ngâm axit citric 19% trong 1 phút
Ngâm Povidine iod 10% trong 30 phút Cắt dọc mẫu theo bề rộng nhất để thu ngà.
36
việc đã sử dụng bề mặt nhám của máy cắt răng để tạo lực tác động cơ học mạnh và đều khắp bề mặt ngà nên cho kết quả tốt trong việc thu nhận và xử lý giá thể ngà so với công trình nghiên cứu khác đã được công bố.
3.2. Kết quả nuôi cấy tế bào gốc từ tủy răng người
3.2.1. Kết quả nhuộm Hematoxylin – Eosin (H&E) mô tủy răng
Nhằm xác định sự hiện diện của tế bào trong mô tủy răng sau khi tách ra khỏi mô cứng (men, ngà), chúng tôi đã nhuộm H&E.
Kết quả được trình bày ở hình 3.4 và 3.5.
Hình 3.4. Mô tủy răng sau khi nhuộm H&E (100X)
Hình 3.5. Mô tủy răng sau khi nhuộm H&E (200X)
37
Kết quả nhuộm H&E mô tủy răng cho thấy:
- Mật độ tế bào trong tủy răng là khá dày đặc. Tế bào có nhiều hình dạng nhưng chiếm đa số là các tế bào có hình thoi kéo dài. Các tế bào này có thể là tế bào gốc trung mô hay nguyên bào sợi.
- Thành phần ngoại bào trong mô tủy có dạng sợi, sắp xếp dày đặc và đều đặn. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho rằng tủy răng là một mô giàu thành phần lưới sợi và chủ yếu là sợi collagen.
- Dựa vào những phân tích kết quả nhuộm mô học tủy răng cho thấy tủy răng sau khi thu nhận chứa nhiều tế bào và khuôn nền ngoại bào có mật độ cao. Do đó, có thể tồn tại nhiều loại tế bào khác nhau khi tủy răng được nuôi cấy.
3.2.2. Kết quả nuôi cấy sơ cấp
Mô tuỷ sau khi lấy ra khỏi răng có dạng sệt, màu đỏ. Môi trường bảo quản đã giúp tủy giữ được trạng thái nguyên vẹn tốt, tỉ lệ nhiểm thấp hơn khi tiến hành bảo quản bằng các môi trường đã được nghiên cứu trước đây. Khi đó, mô tuỷ sẽ được xử lý theo phương pháp tiến hành nuôi cấy mảnh mô.
Kết quả ban đầu cho thấy có nhiều tế bào rời rạc và hầu hết các tế bào đều có hình dạng tròn, chứng tỏ tế bào chưa bám xuống đĩa nuôi và mật độ tế bào còn rất thấp.
38
Sau 24 giờ nuôi cấy, tế bào bắt đầu bám trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy. Trong khi đó, tế bào hồng cầu trưởng thành và tế bào chết không có khả năng bám dính trên bề mặt nuôi cấy và trôi lơ lửng trong dịch huyền phù.
Từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4: có rải rác các tế bào bám nhưng hình dạng chưa trải dài. Môi trường nuôi cấy được thay mới nhằm loại bỏ tế bào nổi, đồng thời cung cấp thêm dinh dưỡng cho sự phát triển của các tế bào bám dính.
Vào ngày nuôi cấy thứ 5, bắt đầu thấy xuất hiện các tế bào trải, lúc này các protein bám dính đã được tổng hợp đầy đủ cho sự bám của tế bào vào bề mặt đĩa nuôi, hình dạng của tế bào được dàn trải rộng. Các tế bào có rất nhiều hình dạng khác nhau như dạng hình thoi, dạng kéo dài, dạng hình sao, dạng giống tế bào nội mô… và bắt đầu phân bào mạnh.
Hình 3.7. Quần thể tế bào sau 5ngày nuôi cấy.
Sau 7 ngày nuôi cấy, các tế bào trải đều trên bề mặt nuôi cấy, hầu hết các tế bào có dạng hình thoi giống các nguyên bào sợi và bắt đầu tăng sinh. Đây là hình dạng bám dính đặc trưng của tề bào gốc trung mô. Ngoài ra, còn sự tồn tại một số dòng tế bào có khả năng bám dính nhưng không trải dài.
Trong những ngày nuôi cấy sau đó, các dạng tế bào dần dần thu hẹp lại; dạng tế bào chiếm ưu thế là dạng tế bào trải rộng, nhân lớn hình oval và có nhiều đuôi bào tương. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
39
Đến ngày thứ 15, tế bào tiếp tục trải rộng trên bề mặt nuôi cấy và tăng sinh mạnh về số lượng, hầu hết các tế bào đều ở dạng giống nhau, chỉ còn vài tế bào dạng hình sao. Ngày thứ 19, các tế bào bắt đầu hợp dòng, trải thành một lớp đơn phủ kín bề mặt nuôi cấy.
Hình 3.8. Quần thể tế bào sau 14 ngày nuôi cấy
Sau 21 ngày nuôi cấy, mật độ tế bào chiếm 80-90% diện tích bề mặt nuôi cấy. Lúc này, tế bào sẽ được tiến hành cấy chuyền.
40
Kết quả này phù hợp với một số công trình đã công bố trước đây: đối với mô tủy được nuôi cấy theo phương pháp nuôi mảnh mô, tế bào ở phần rìa của mảnh mô sẽ bám vào bề mặt đĩa nuôi vào khoảng tuần thứ hai hay thứ ba. Ban đầu, các tế bào có rất nhiều dạng và kích cỡ khác nhau rất khó phân biệt, có thể gồm nguyên bào ngà, nguyên bào sợi, tế bào gốc trung mô, các loại bạch cầu, do mô tủy là một mô liên kết lỏng lẻo chứa tế bào, khuôn gian bào dạng oxytalan (dạng kháng acid), lưới và các sợi collagen; tủy là một mô giàu mạch máu và thần kinh. Do đó, có sự tồn tại nhiều loại tế bào khác nhau khi tủy răng được nuôi cấy. Trong những ngày nuôi cấy sau, dạng tế bào giống nguyên bào sợi chiếm ưu thế. Sau 1 tháng tế bào đạt đủ mật độ để cấy chuyền [10], [20].
3.2.3. Kết quả cấy chuyền tế bào
Khi các tế bào đạt 70 - 85% độ phủ kín bề mặt đĩa nuôi, tiến hành cấy chuyền thu nhận tế bào P1.
Tế bào bắt đầu bám trên bề mặt bình Roux sau 24 giờ tách cấy chuyền. Tế bào lúc này có hình dạng trải rộng giống nguyên bào sợi, nhân lớn hình oval; tế bào chất nhiều, có đuôi bào tương.
Tốc độ tăng sinh của tế bào khi được nuôi cấy thứ cấp cao hơn so với tế bào khi được nuôi cấy sơ cấp. Sau 5-7 ngày có thể cấy chuyền.
Hình 3.10. Quần thể tế bào sau 4 ngày (a) và sau 15 ngày (b) cấy chuyền
41
3.3. Kết quả đánh giá tế bào thu được từ tủy răng
3.3.1. Sự biểu hiện một số marker của tế bào gốc trung mô
Các marker bề mặt trên mẫu tế bào thu được sau 3 lần cấy chuyền được phân tích bằng kỹ thuật flow cytometry trên hệ thống FACS. Các marker âm tính và dương tính được phân tích đồng thời trên cùng một mẫu tế bào.
Hình 3.11. Kết quả phân tích sự biểu hiện một số marker của tế bào tủy răng sau 3 lần cấy chuyền
42
Kết quả phân tích tế bào gốc trung mô ứng viên sau 3 lần cấy chuyền (Hình 3.11.) cho thấy, tế bào âm tính với 2 marker CD34 (0,42%), CD45 (0,08%)và dương tính với 4 marker CD13 (99,97%), CD44 (99,84%), CD90 (97,34%), CD166 (98,18%).
Từ các kết quả thu được, chúng tôi thấy rằng quần thể tế bào thu nhận từ tủy răng người đã có tính đồng nhất và độ ổn định ở thế hệ nuôi cấy thứ tư. Các tề bào biểu hiện dương tính với các marker bề mặt của tế bào gốc trung mô.
3.3.2. Kết quả đánh giá sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt đĩa nuôi
Các tế bào thế hệ thứ 3 được cấy chuyền sang đĩa 96 giếng với mật độ 3x104 tế bào/cm2.
Mật độ tế bào được xác định mỗi ngày bằng buồng đếm hồng cầu với tế bào được nhuộm trypan blue. Sử dụng buồng đếm hồng cầu để đếm trực tiếp số lượng tế bào và từ đó suy ra sự tăng trưởng, việc sử dụng trypan blue khi đếm tế bào sẽ làm tăng độ chính xác và dễ dàng tiến hành.
Đường cong tăng trưởng của tế bào sau lần cấy chuyền thứ ba được xây dựng dựa vào mật độ tế bào xác định được.
Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng của tế bào tủy răng người nuôi cấy ở lần cấy chuyền thứ 3
43
Đồ thị 3.1 cho thấy:
- Trong ngày đầu tiên, mật độ tế bào thấp hơn so với mật độ ban đầu (104 tế bào/cm2) đưa vào giếng nuôi. Tế bào phát triển rất chậm trong 24 giờ cấy chuyền. Trong thời gian này, tế bào chết nhiều hơn tế bào mới sinh ra, do một số tế bào chết do hoạt tính của trypsin, còn số còn lại sau khi xử lý bởi trypsin, các protein bám bị phá vỡ, tế bào cần có thời gian để tổng hợp các protein bám bị mất, do đó hoạt động phân bào kém.
- Trong 2 ngày tiếp theo, mật độ tế bào tăng nhưng không nhiều, không có sự khác biệt về mặt thống kê.
- Từ ngày 3 đến ngày 5, tế bào tăng sinh mạnh mẽ. Lúc này, tế bào đã được tổng hợp đầy đủ các yếu tố bám dính, đồng thời tế bào đã thích nghi với môi trường mới nên phân bào nhanh chóng. Mật độ tế bào thu được cao nhất ngày 6.
- Từ ngày 7 đến ngày 8, mật độ tế bào bắt đầu giảm và giảm mạnh ở ngày 7, do số lượng tế bào quá nhiều, dẫn đến sự kìm hãm tiếp xúc giữa các tế bào với nhau, cũng như diện tích bề mặt nuôi cấy bị giới hạn khi mật độ tế bào cao, dẫn đến hạn chế sự tăng sinh của tế bào. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Từ ngày 9, tế bào tiếp tục giảm, có thể do tế bào không đủ không gian nên khả năng phân bào kém.
Như vậy, sau khi được cấy chuyền, tế bào tăng sinh mạnh từ ngày 2 đến ngày 6, đạt cao nhất vào ngày 6, sau đó giảm nhanh đến ngày 9. Điều này chứng tỏ tế bào đã tăng sinh và đạt mức tối đa vào ngày thứ 6.
Kết quả flow cytometry và đường cong tăng trưởng cho thấy các tế bào thu nhận từ tủy răng có khả năng bám dính trên bề mặt của dụng cụ nuôi cấy và tăng sinh mạnh mẽ. Hình thái của các tế bào này khá giống với hình thái của nguyên bào sợi người [30]. Các tế bào phân tích dương tính với các marker như CD13, CD90, CD44, CD166 và âm tính đồng thời với các marker như CD34, CD45. Kết quả của nghiên cứu này đã chứng minh rằng tế bào tủy răng có khả năng bám dính, tăng sinh và duy trì được đặc tính gốc trong điều kiện nuôi cấy in vitro.
44
3.4. Kết quả khảo sát sự tăng sinh của tế bào gốc tủy răng trên bề mặt giá thể