Khảo sát khả năng sinh enzyme celulase của nấm trichoderma phân lập từ đất vườn tài bình dương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN •• KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP •• CHUN NGÀNH : SƯ PHẠM SINH HỌC •• KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH ENZYME CELULASE CỦA NẤM TRICHODERMA PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN TẠI BÌNH DƯƠNG CAO TRƯƠNG ÁI NỮ Bình Dương, tháng 5, năm 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN •• KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CAO ĐẲNG •• NIÊN KHĨA 2011 - 2014 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH ENZYME CELULASE CỦA NẤM TRICHODERMA PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN TẠI BÌNH DƯƠNG Ngành: SINH HỌC Chuyên ngành: SƯ PHẠM SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN ANH DŨNG Sinh viên thực hiện: CAO TRƯƠNG ÁI NỮ MSSV: 111C840051 Lớp: C11SH02 Bình Dương, tháng 5, năm 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Những số liệu, kết khóa luận hồn tồn trung thực chưa công bố cơng trình khác Sinh viên Cao Trương Ái Nữ LỜI CẢM ƠN Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Anh Dũng - Người hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm quý báu suốt q trình thực khóa luận Em xin bày tỏ lịng biết ơn đến q thầy môn Sinh khoa Khoa Học Tự Nhiên thầy phụ trách phịng thí nghiệm nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt khóa luận Cảm ơn bạn khóa đóng góp nhiều ý kiến, động viên suốt thời gian qua Con xin chân thành kính tỏ lịng biết ơn đến gia đình động viên, an ủi chỗ dựa tinh thần vật chất tạo điều kiện thuận lợi để hồn thành khóa luận Sinh viên Cao Trương Ái Nữ LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU Tên bảng biểu Trang DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt CMCase Ý nghĩa : Carbomexymethyl cellulase CMC : Carboxymethyl cellulose CBH : Cellobiohydrolase hay Exoglucanase CBHI : Exoglucanase I : Exoglucanase II CBH II EG : Endoglucanase EGI : Endoglucanase I EGII : Endoglucanase II KHV : Kính hiển vi KL : Khuẩn lạc MT : Môi trường PTN : Phịng thí nghiệm PGA VSV : Potato glucose agar : Vi sinh vật TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Bình Dương, Ngày tháng năm 2014 BẢN NHẬN XÉT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP (Của giảng viên hướng dẫn) Tên đề tài: Nghiên cứu khả sinh enzyme cellulase nấm Trichoderma phân lập từ đất vườn Bình Dương Sinh viên thực hiện: Cao Trương Ái Nữ Lớp: C11SH02 Mã số SV: 111C840051 Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Anh Dũng Đơn vị: Khoa KHTN NỘI DUNG NHẬN XÉT Tinh thần, thái độ sinh viên suốt q trình làm khóa luận - Sinh viên có tinh thần cầu thị, ham học hỏi siêng trình thực đề tài Khả đọc khai thác tài liệu tham khảo - Sinh viên có khả đọc, tra cứu vận dụng tốt tài liệu tham khảo từ nhiều nguồn khác Kỹ viết trình bày báo cáo - Kỹ viết trình bày báo cáo hợp lý Có lí luận, so sánh, tham chiếu kết kết khác Kết đạt - Kết đạt đề tài mang tính khoa học cao Đánh giá chung kết luận - Đề tài tốt đủ khối lượng khóa luận tốt nghiệp sinh viên Người hướng dẫn Nguyễn Anh Dũng TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT HỘI ĐỒNG CHẤM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NĂM 2013 PHIẾU NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: Nghiên cứu khả sinh enzyme cellulase nấm Trichoderma phân lập từ đất vườn Bình Dương Họ tên SV thực hiện: Cao Trương Ái Nữ Mã SV: 111C840051 Lớp: C11SH02 Họ tên giảng viênphản biện: ThS Trần Ngọc Hùng Đơn vị công tác: Khoa Khoa học Tự nhiên NỘI DUNG NHẬN XÉT Đánh giá chung (Mức độ thực so với đề cương giao) Thực đầy đủ nội dung đề tài với kết tốt Đánh giá chi tiết (Mục tiêu, nội dung, kết quả, khả ứng dụng thực tế; Bố cục hình thức trình bày, ) Enzyme cellulase có nhiều ứng dụng thực tế nên việc tìm kiếm nguồn sinh tổng hợp cellulase có hoạt tính cao ln ln cần thiết Trong đề tài, tác giả tìm kiếm nguồn sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma phân lập Bình Dương nhằm phân hủy nhanh rơm rạ, phế phụ liệu nông nghiệp, phục vụ sản xuất phân hữu vi sinh Trong chủng Trichoderma phân lập từ nguồn khác nhau, tác giả chọn chủng Tr3 có khả sinh tổng hợp cellulase tốt nhất, xác định số điều kiện thích hợp cho khả sinh tổng hợp cellulase chủng nhiệt độ, độ ẩm, thời gian Đề tài phân lập chủng Trichoderma khu vực Bình Dương có khả sinh tổng hợp cellulase mạnh, làm nguyên liệu cho ứng dụng Kết đề tài cung cấp chủng Trichoderma để sản xuất chế phẩm ủ hoai phế phụ liệu nông Tr3 độ ẩm khác môi trường nuôi cấy Kết cho thấy chủng Tr3 hoạt động khoảng độ ẩm rộng từ 40% 70% Tuy nhiên độ ẩm thích hợp cho chủng Tr3 hoạt động 50% đường kính vịng phân giải D - d = 20,7 mm vào thời điểm ngày Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu cơng bố trước Trần Thị Thanh Thuần cs (2009) khảo sát độ ẩm tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase Trichoderma kết cho thấy độ ẩm tối ưu cho Trichoderma sinh tổng hợp enzyme cellulase 50% 3.2.2.2 Ảnh hưởng pH lên khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 Để khảo sát ảnh hưởng pH lên khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 Chúng tơi tiến hành theo phương pháp trình bày mục 2.2.3.1, phần c với độ ẩm 50% thời gian nuôi cấy 120 Kết trình bày bảng 3.6 hình 3.4 Bảng 3.6 Ảnh hưởng pH lên khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 STT pH D - d (mm, TB) 18,0 ± 19,70 ± 1,53 10,0 ± 2,00 3,30 ± 1,53 4,30 ± 1,53 Hình 3.4 Biểu đồ so sánh khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 pH khác môi trường nuôi cấy Kết cho thấy khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 hoạt động mạnh pH = pH = Tuy nhiên, pH thích hợp cho khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 pH = (19,7mm) vào thời điểm ngày Ở pH = 6, 7, 8, khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 đạt trung bình (pH= đạt 10mm) yếu (pH = đạt 2,7mm) Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu cơng bố trước Nguyễn Trần Nhật Minh (2010) nghiên cứu quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trichoderma hoạt động mạnh khoảng pH từ - đạt tối ưu pH = 3.2.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 Để khảo sát ảnh hưởng nhiệt lên khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 Chúng tơi tiến hành theo phương pháp trình bày mục 2.2.3.1, phần d với độ ẩm 50%, pH = thời gian nuôi cấy 120 Kết trình bày bảng 3.7 hình 3.5 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 ST T Nhiệt độ D - d (mm, TB) 250C 19,3 ± 1,15 300C 17,3 ± 1,15 4Õ°C 11,3 ± 0,58 500C 0,3 ± 0,58 Hình 3.5 Biểu đồ so sánh khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 nhiệt độ khác Qua bảng số liệu biểu đồ cho thấy chủng Tr3 sinh enzyme cellulase khoảng độ từ 250C - 400C Tr3 hoạt động mạnh nhiệt độ 250C - 300C khả sinh enzyme cellulase đạt cao nhiệt độ 25oC Ở nhiệt độ 500C khả sinh enzyme khơng có nhiệt độ cao khiến chủng Tr3 phát triển Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu cơng bố trước Trần Thị Minh Định cs (2007) khảo sát đặc điểm số nấm sợi có nấm Trichoderma, kết cho thấy nấm Trichoderma sinh trưởng mạnh nhiệt độ từ 250C - 300C KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Kết luận Đã phân lập chủng nấm Trichoderma spp từ đất tổng số 58 chủng nấm sợi phân lập từ địa điểm Tân Uyên, Bến Cát, Bình Dương chiếm 13,79% Đã khảo sát khả sinh enzyme cellulase chủng Trichoderma spp phân lập cho kết quả: chủng có khả sinh enzyme cellulase có hoạt tính mạnh Tr3 (D - d > 25mm); chủng có hoạt tính trung bình Tr1, Tr2, Tr4 (15 < D - d > 20) chủng có hoạt tính yếu (D - d < 9) Từ kết khảo sát trên, chọn chủng nấm Trichoderma sp có kí hiệu Tr3 cho nghiên cứu Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3: + Thời gian ni cấy thích hợp 120 + Độ ẩm mơi trường ni cấy thích hợp 50% + pH mơi trường thích hợp + Nhiệt độ thích hợp 25oC Khuyến nghị Tiếp tục nghiên cứu sâu khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 Mặc dù nhiệt độ thích hợp cho khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 25oC Tuy nhiên khoảng nhiệt độ 30 - 40oC chủng Tr3 có khả sinh enzyme cellulase Chính dùng chủng Tr3 kết hợp với chủng vi sinh ưa nhiệt khác để phục vụ cho việc chế tạo phân bón vi sinh từ rác thải phế phẩm nông nghiệp Tiếp tục phát triển đề tài theo hướng nuôi cấy thu enzyme cellulase phương pháp tủa thu enzyme thô thử nghiệm việc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Kim Cúc (2001), “Đánh giá hoạt tính CMCaza số chủng vi sinh vật phân hủy cellulose” Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng tác giả (1979), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập 2,3, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Trần Thị Minh Định, Trần Thanh Thủy (2007), Khảo sát đặc điểm số chủng nấm sợi có kháng sinh chống sinh vật gây bệnh, Tạp chí khoa học Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh Bùi Xuân Đồng (1986), Nấm mốc Bạn thù, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Mai Thị Hằng, Nguyễn Văn Diễn (2005), “Nghiên cứu nấm túi dừa nước rừng ngập mặn Cần Giờ” Mai Thị Hằng (2001), Kết nghiên cứu tính đa dạng vai trị nhóm nấm sợi phân lập từ số rừng ngập mặn hai tỉnh Nam Định Thái Bình, Tổ CNSH VS, Khoa Sinh - KTNN, Đại học Sư phạm Hà Nội Trần Thu Hà Phạm Thị Thanh Hoài (2012), Khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm bệnh hại trồng Sclerotium rolfsii điều kiện Invitro, tạp chí khoa học ĐH Huế 10 Nguyễn Vĩnh Hà, Mai Thị Hằng (2002), Khả diệt côn trùng số nấm sợi vùng rừng ngập mặn Giao Thủy, Tổ CNSH - VS Khoa Sinh - KTNN, Đại học Sư phạm Hà Nội 11 Đinh Minh Hiệp (2010), Nghiên cứu Chitinase P-glucanase từ vi nấm Trichoderma sp khả kiểm soát sinh học số nấm gây bệnh thực vật, Đề tài luận án, Viện KH&CN Việt Nam 12 Nguyễn Thị Kiều Hoa (2002), Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase Trichoderma reesei, Khóa luận Cử nhân Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh 13 Phạm Thành Hổ (2005), Nhập môn công nghệ sinh học, NXB Giáo dục 14 Nguyễn Đức Lượng tác giả (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh 15 Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn (2001), Thực tập vi sinh học thực phẩm, NXB Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh 16 Đặng Vũ Hồng Miên (1998), Bảng phân loại loài nấm mốc thường gặp 17 Nguyễn Trần Nhật Minh (2010), Khảo sát quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trichoderma reesei, Khóa luận tốt nghiệp khoa sinh học, Trường Đại học KHTN Tp Hồ Chí Minh 18 Lê Thị Hồng Nga (2005), Nghiên cứu tổng hợp cảm ứng Pectinase cellulose số chủng nấm mốc, Luận văn Thạc sĩ khoa học Sinh học, Trường Đại học KHTN Tp Hồ Chí Minh 19 Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1987), Vi sinh tổng hợp, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 20 Trần Thạnh Phong (2004), Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Trichoderma reesei Aspergillus niger môi trường lên men bán rắn, Luận văn Thạc sĩ khoa học Sinh học, Trường Đại học KHTN Tp Hồ Chí Minh 21 Nguyễn Ngọc Phúc, 2005.Bước đầu nghiên cứu diện nấm Trichoderma spp yếu tố đất, luận văn tốt nghiệp trường ĐH Nông Lâm 22 Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng Đà Nẵng 23 Trần Thị Thanh (2003), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục 24 Nguyễn Xuân Thành (chủ biên) (2005), Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp,NXB Giáo dục 25 Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng (2009), Nghiên cứu enzyme cellulase pectinase từ chủng Trichoderma viride aspergillus niger nhằm xử lý nhanh vỏ cà phê, Tạp chí phát triển KH&CN 26 Lê Thị Thanh Thủy, Phạm Văn Toản (2001), Bước đầu nghiên cứu khả sử dụng vi sinh vật phân giải cellulose chuyển hóa nhanh rơm rạ làm phân bón 27 Hồ Sĩ Tráng (2004), Cơ sở hóa học gỗ cellulose tập 1, 2, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 28 Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), Enzyme vi sinh vật tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 29 Lê Đức Tuấn, Trần Thị Kiều Oanh, Cát Văn Thành, Nguyễn Đình Quý (2002), Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ, NXB Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh 30 Nguyễn Thị Nhã Vy (2009), Nghiên cứu khả sinh hoạt chất vi sinh vật gây bệnh cho trồng chủng nấm sợi phân lập từ rừng Đà Lạt, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh Tiếng Anh 31 Alexander N Glazer, Hiroshi Nikaido (1995), Microbial Biotechnolagy, Fundamentals of Applied Microbiology, W.H.Freeman and Company, NewYork 32 Clipson N., Landy E., Otte M., 2001 European register of marine species: a checklist of the marine species in Europe and a bibliography of guides to their identification Collection Patrimoines Naturels 33 Domsch K H., Gams W., Traute-Hedi Anderson, 1980: Compendium of soil fungi 34 Gary J Samuels, 9-2005 Trichoderma: Systematic, the Sexual State, and Ecology United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705 Acepted for publication 35 Harman, G E 2000 The myths and dogmas of biocontrol Changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum 36 Klein D, Eveleigh DE 1998 Ecology of Trichoderma In: Kubicek CP, Harman GE, eds Trichoderma and Gliocladium Basic biology, taxonomy and genetics 37 Papavizas G C, 1985 Trichoderma and Gliocladium 38 Robert A Samson at al, 2004, Introduction Food - Borne Fungi, CBS, Institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences 39 Samuels GJ 1996 Trichoderma: a review of biology and systematics of the genus Mycol Res 40 Tronsmo, A., and Dennis, C 1978 Effect of temperature on antagonistic properties of Trichoderma spp Từ Internet 41 http://vietsciences.org 42 http://bioprocess.pnl.gov/ 43 http://www.nea.gov.vn/html/phổbiếnkiếnthức/GIS/DatabaseGIS/ngapmanCanGio.h tm 44 http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-buoc-dau-khao-sat-moi-lien-he-giua-su-hien- dientrichoderma-va-cac-yeu-to-cua-dat-1877/ 45 http://www.binhduong.gov.vn/vn/status_pages.php?id=5612&idcat=15&idcat2=0 46 http://www.hiast.edu.vn/dbt/attachments/article/147/Bai%20giang%20Cong%20ng he %20enzyme.pdf PHỤ LỤC Bảng Khả sinh enzyme cellulase chủng Trichoderma spp MT4 STT Ký hiệu chủng Tr1 Tr2 Tr3 Tr4 Tr5 Lần 15 16 24 16 D - d (mm) Lần Lần 14 16 15 15.5 26 25 15 17 10 Bảng 2: Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 D - d (mm) Số lần lặp lại 24 48 72 96 120 144 168 13 17 15 10 11 16 18 10 12 12 15 17 17 14 15 17 14 10 12 16 Bảng 3: Ảnh hưởng độ ẩm đến khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 STT Độ ẩm (%) 40 50 60 70 D - d (mm) Lần Lần Lần 19 17 17 20 21 21 8 7 Bảng 4: Ảnh hưởng pH đến khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 STT pH Lần 18 20 10 5 D - d (mm) Lần Lần 18 18 21 18 Bảng 5: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 STT Nhiệt độ ( C) 25 30 40 50 Lần 18 16 11 D - d (mm) Lần Lần 20 20 18 18 12 11 0 Tr3 Tr2 Tr5 Hình Khả sinh enzyme cellulase chủng Trichoderma 24 48 72 96 120 144 168 Hình 2: Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 40% 50% Hình 3: Ảnh hưởng độ ẩm đến khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 ngày 70% pH = pH = pH = pH = pH = Hình 4: Ảnh hưởng pH đến khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 ngày 50 C Hình 5: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh enzyme cellulase chủng Tr3 ngày 56 ... luận “Nghiên cứu khả sinh enzyme cellulase nấm Trichoderma phân lập từ đất vườn Bình Dương? ?? Mục tiêu đề tài Xác định khả sinh enzyme cellulase nấm Trichoderma phân lập từ đất vườn điều kiện ảnh... VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm Trichoderma có khả sinh enzyme cellulase từ đất vườn Bình Dương 3.1.1 Phân lập chủng nấm Trichoderma từ đất vườn Bình Dương Theo tài liệu nghiên... dung nghiên cứu - Phân lập nấm Trichoderma từ đất vườn - Khảo sát khả sinh enzyme cellulase nấm Trichoderma phân lập từ đất vườn Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài 13 4.1 Việt