Khảo sát khả năng đối kháng nấm phytophthora của vi khuẩn bacillus phân lập từ đất vườn

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA TÀI NGUYÊN MỘI TRƯỜNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NĂM HỌC 2015-2016 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA CỦA VI KHUẨN BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN TÊN SINH VIÊN: NGUYỄN THỊ HÒNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN: THS NGUYỄN ANH DŨNG Bình Dương, tháng năm 2016 UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HỊA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung - Tên đề tài: : Khảo sát khả đối kháng nấm Phytophthora vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn - Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hồng Đỗ Thị Cẩm Tuyên - Lớp: C14SH02 - Khoa: Tài nguyên Môi trường - Chuyên ngành đào tạo: Sư phạm Sinh học - Năm thứ: - Số năm đào tạo: - Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Anh Dũng Mục tiêu đề tài Tìm chủng vi khuẩn Bacillus có khả đối kháng mạnh với nấm Phytophthora Tính sáng tạo Sử dụng chất kháng sinh từ vi khuẩn Bacillus không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe người, vật nuôi, trồng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học, có khả kháng lại nấm Phytophthora trồng Kết nghiên cứu Qua trình phân lập từ đất vườn, làm thu 11 chủng Bacillus chọn chủng nấm Với thí nghiệm khảo sát khả đối kháng nấm Phytophthora vi khuẩn Bacillus Chúng tiến hành khảo sát chủng Bacillus với chủng nấm chọn, có chủng đối kháng mạnh - B1 AD = 9,75mm - B3 AD = 10,75mm - B5 AD = 11,75mm Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài Tìm chủng vi khuẩn có khả kháng nấm phytophthora , làm nguồn nguyên liệu sản xuất chế phẩm sinh học kháng lại nấm bệnh, góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài (ghi rõ họ tên tác giả, nhan đề yếu tố xuất có) nhận xét, đánh giá sở áp dụng kết nghiên cứu (nếu có) Ngày tháng năm 2016 Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) Nguyễn Thị Hồng Nhận xét người hướng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực 1_ • Ạ _ -> Ạ J Ạ • đề tài Nhóm nghiên cứu thực hiên đề tài tinh thần trách nhiệm cao, có nổ lực, nhiệt tình tìm tịi học hỏi, chủ động thường xuyên liên lạc trao đổi với GVHD để thực đề tài tiến độ Kết đề tài chủ yếu dựa vào vùng đất lấy nên chưa đưa chủng vi khuẩn có tinh kháng nấm cao Tuy nhiên, cách để sinh viên tiếp cận với thực tế phù hợp với trình độ sinh viên Ngày tháng năm 2015 Xác nhận lãnh đạo khoa Người hướng dẫn (Ký,họ tên) (Ký,họ tên) UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HỊA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập - Tự - Hạnh phúc Địa liên hệ: phường Phú Hịa, Thành phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương TIN0962746576 VỀ SINH VIÊN - THÔNG Điện thoại: CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH Email: kennyhong1801@gmail.com Q TRÌNH HỌCĐỀ TẬP THỰC HIỆN TÀI • Năm thứ Ngày tháng năm 2016 Sinh viên chịu trách nhiệm - Ngành học: Sư phạm Sinh học thực đề tài SƠ SINH - LƯỢC Khoa: VỀ Khoa học VIÊN Tự nhiên - Họ tên:quả Nguyễn Thịhọc Hồng - vàKết xếp loại tập: Trung bình (ký, họ tên) - Ngày, tháng, năm sinh: 18/05/1995 Ngày tháng .năm 2016 - nhận Nơicủa sinh:lãnh Bình Thuận Xác đạo Khoa - (ký, Lớp:họC14SH02 tên) - Chuyên ngành đào tạo: Sư phạm Sinh học - Khóa học: 2014 - 2017 - Khoa: Tài ngun Mơi trường Nguyễn Thị Hồng THUYẾT MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN Năm học 2015 - 2016 Tên đề tài: Khảo sát khả đối kháng nấm Phytophthora vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn Mã số: (do cán quản lý ghi) Loại hình nghiên cứu: • Cơ Ứng dụng • Triển khai Lĩnh vực nghiên cứu: • Khoa học Xã hội Nhân văn • Khoa học Kỹ thuật Cơng nghệ • Kinh tế Khoa học Tự nhiên • Khoa học Giáo dục Thời gian thực hiện: tháng Từ tháng năm 2015 đến tháng năm 2016 Đơn vị quản lý chuyên môn: Khoa: Tài Nguyên Môi Trường Bộ môn: Sinh học Ứng Dụng Giáo viên hướng dẫn: Họ tên: Nguyễn Anh Dũng Học vị: Thạc sĩ Đơn vị cơng tác (Khoa, Phịng): Khoa Tài Ngun Mơi Trường Địa nhà riêng: Điện thoại nhà riêng: Di động: 090 786 03 88 Nhóm sinh viên thực đề tài: Sinh viên chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Hồng kennyhong1801@,gmail.com SĐT: 0962 746 576 E-mail: Email: MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn Bacillus 1.1.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus 1.1.2 Khả đối kháng vi khuẩn Bacillus 1.2 Nấm Phytophthora 1.2.1 Vị trí phân loại 1.3 Tình hình bệnh hại trồng 1.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus công tác bảo vệ trồng 12 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 2.1 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 15 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.1.2 Hóa chất thiết bị 15 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 15 2.1.4 Môi trường nghiên cứu 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu: .17 2.2.1 Lấy mẫu 17 2.2.2 Phương pháp phân lập 18 2.2.3 Phương pháp khảo sát khả đối kháng vi khuẩn Bacillus với nấm Phytophthora 19 2.2.4 Phương pháp xử lý số liêu 19 2.2.5 Phương pháp nhuộm Gram 19 2.2.6 Thử nghiệm Catalase 21 2.2.7 Phương pháp giữ giống cấy chuyền .21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus 22 3.2 Phân lập nấm 24 3.3 Khảo sát khả đối kháng nấm vi khuẩn Bacillus 25 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .28 4.1 Kết luận 28 4.2 Kiến nghị 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO .29 PHỤ LỤC 32 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Nấm phytophthora xem tác nhân nguy hiểm hàng đầu cho nông nghiệp nước ta gây bệnh làm giảm suất trồng chí gây chết bệnh: bệnh tiêu sầu (bệnh chết nhanh) tiêu; bệnh thối rễ, thối thân, thối quả, xì mủ sầu riêng; loét sọc miệng cạo cao su [17].v.v Để phòng trừ tác hại nấm Phytophthora gây nhiều loại thuốc trừ nấm có nguồn gốc hóa học sử dụng[19][20] Tuy nhiên viêc sử dụng mơt cách bừa bãi loại thuốc hóa học dẫn đến tình trạng đề kháng thuốc nấm bênh mà cịn gây nhiễm mơi trường sức khỏe người Vi khuẩn Bacillus với khả cạnh tranh dinh dưỡng mạnh, tiết loại enzyme, đăc biêt khả sinh kháng sinh mạnh xem môt nhân tố sinh học hữu liiêu dùng để khống chế nấm Phytophthora [8][15][16] Xuất phát từ thực tế thực hiên đề tài “Khảo sát khả đối kháng nấm Phytophthora vi khuẩn Bacillus phân lâp từ đất vườn.” với mục đích tuyển chọn mơt số chủng vi khuẩn Bacillus với khả đối kháng mạnh, dùng làm chế phẩm khống chế nấm Phytophthora, từ đóng góp mơt phần viêc giảm thiểu ô nhiễm môi trường xây dựng nơng nghiêp an tồn Mục tiêu nghiên cứu Tìm chủng vi khuẩn Bacillus có khả đối kháng mạnh với nấm Phytophthora Đối tượng nghiên cứu - Nấm Phytophthora phân lập từ mẫu bệnh phẩm thực vật thu nhân Bình Dương - Vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn Phạm vi nghiên cứu - Khảo sát khả đối kháng vi khuẩn Bacillus với nấm Phytophthora thạch đĩa phịng thí nghiệm 1.1 Vi khuẩn Bacillus CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus Đặc điểm phân loại Theo khóa phân loại Bergey, chi Bacillus la chi lớn đa dạng, phân loại sau: - Giới Bacteria - Ngành Firmicutes - Lớp Bacilli - Bộ Bacillales - Họ Bacillaceae - Chi Bacillus Vi khuẩn Bacillus Ehrenberg mô tả lần năm 1835 Vibrio subtilis Năm 1872, Vibrio subtilis Cohn dặt lại tên Bacillus subtilis ( Gordon, 1981) Họ Bacillaceae chia làm chi gồm: Bacillus, sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfortomaculum, đặc trưng cho họ sinh nội bào tử [9],[12],[13] Đặc điểm hình thái Các vi khuẩn Bacillus nhóm trực khuẩn sinh bào tử sống hiếu khí tùy tiện điều kiện hiếu khí hoạt động mạch hơn.chúng phổ biến tự nhiên Một số lồi giống cịn thấy khoang miệng, đường ruột người động vật Tất lồi Bacillus có khả phân giải hợp chất hữu chứa nito, protein mạnh nhờ sinh proteaza ngoại bào Ngồi ra, chúng cịn có khả sinh amylaza làm loãng tinh bột, biến chất thành dễ hòa tan thủy phân thành dextrin loại đường hợp thành [11] Tế bào hình que, thẳng gần thẳng, kích thước 0,3 -2,2 ũ 1,2 - lim Các tế bào thường xếp thành cặp chuỗi, đầu tròn vuông Chúng vi khuẩn Gram dương, chúng thường di động nhờ roi Một tế bào hình thành nội bào tử, nội bào tử có hình oval hình trụ Bào tử có khả chịu nhiệt, acid Sự hình thành nội bào tử khơng bị ngăn cản tiếp xúc khơng khí Các loài thuộc chi Bacillus đặc trưng cho trực khuẩn sinh bào tử mà giữ nguyên hình que mang bào tử, B7 B8 Khuẩn lạc khô, mép Tế bào hình que, khơng liền, có đứng riêng lẽ nếp nhăn, Khuẩn lạc khô, màu thanhn chuỗi Tế bào hinh que, xám nhạt, có mép đứng riêng lẽ nhăn, mép lồi lõm thành chuỗi + + + + Qua kết nghiên cứu kết hợp với khóa phân loại Lương Đức Phẩm (2011) chúng tơi kết luận chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus 3.2 Phân lập nấm Thu mẫu vỏ cao su bị loét miêng cạo tiến hành phân lập nấm Phytophthora theo phương pháp mục 2.2.2 Kết phân lập môt chủng nấm với đăc điểm sau: - Khuẩn lạc nấm màu trắng, khơng hình thành bào tử trần - Khi quan sát kính hiển vi thấy sợi nấm khơng có vách ngăn, có túi hình chanh có núm So sánh với mô tả Nguyễn Văn AB Bá Cs (2005) chúng tơi kết luận Hình 3.1 Ảnh vi thể nấm chủng nấm thuôc chi Phytophthora Cũng Phytopthora theo Nguyễn Văn Bá Cs (2005) A Hùng (Túi tinh) tiếp hợp với túi hình chanh có núm túi túi dơng bào tử bên có chứa B Túi động bào tử hình chanh có dơng bào tử Khi túi vỡ núm giải phóng đơng bào tử phát tán theo dòng nước Bên cạnh quan sát vi thể kĩ chủng Phytophthora chủng đồng tản có nghĩa có hùng (túi tinh) noãn sào (trứng) nằm tản Hùng sau thụ tinh với noãn sào phát triển thành túi đông bào tử 3.3 Khảo sát khả đối kháng nấm vi khuẩn Bacillus Từ chủng vi khuẩn phân lập mục 3.1 chủng nấm Chúng tiến hành đối kháng môi trường PGA, thu kết sau: Bảng 3.2 Khảo sát khả đối kháng chủng Bacillus NT AD B1 TB 10 12 10 AD B2 AD B3 10 10 8 10 10 13 AD B4 AD B5 13 13 11 10 AD B6 AD B7 10 10 10,75 11,75 9,75 8,25 7,5 8,5 NT: Nghiệm thức AD(mm): khoảng cách vơ khuẩn TB: Trung bình 10 8,75 Từ chủng chọn chủng có khả đối kháng mạnh AD B8 10 9 10 9,5 Hình 3.3 Khả đối kháng chủng B5 nấm Phytophthora Hình 3.5 Phytophthora ( đối chứng) 27 28 Với chủng Bacillus phân lập hầu hết chủng có khả đối kháng với nấm Phytophthora Trong có chủng Bacillus có khả đối kháng mạnh với nấm Phytophthora tạo khoảng cách vô khuẩn cao Ba chủng B1,B3,B5 Chủng Bacillus B1 khoảng cách vô khuẩn tạo 9,75mm, chủng Bacillus B3 khoảng cách vô khuẩn tạo 10,75mm, chủng Bacillus B5 khoảng cách vô khuẩn tạo 11,75mm Khi so sánh kết với nghiên cứu Wan Gyu Kim cộng (2007), nhóm tác giả tuyển chọn chủng Bacillus M34 M47 có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Phytophthora capsici, khoảng cách vô khuẩn mà chủng M34 M47 tạo với nấm bệnh 14,8mm 14,9mm Đoàn Lê Minh Hiền (2013) tác giả tuyển chọn chủng Bacillus B14 B34 có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Phytophthora palmiora với khoảng cách vô khuẩn tạo lần lược 10,6mm 11,7mm Khoảng cách vô khuẩn mà chủng Bacillus B1,B2 B5 tạo với nấm Phytophthora nhỏ khoảng cách vô khuẩn mà chủng Bacillus M34 M47 tạo với nấm Phytophthora capsici nghiêm cứu Wan Gyu Kim cộng (2007) Tuy nhiên, chủng Bacillus B1,B3,B5 mà chúng em tìm có khoảng cách vơ khuẩn gần với chủng Bacillus B14 B34 nghiên cứu Đoàn Lê Minh Hiền (2013) CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình phân lập từ đất vườn, làm thu 11 chủng Bacillus chọn chủng nấm Với thí nghiệm khảo sát khả đối kháng nấm Phytophthora vi khuẩn Bacillus Chúng tiến hành khảo sát chủng Bacillus với chủng nấm chọn, có chủng đối kháng mạnh - B1 AD = 9,75mm - B3 AD = 10,75mm - B5 AD = 11,75mm Có thể thấy vi khuẩn Bacillus có khả đối kháng chủng nấm bệnh nấm Phytophthora gây 4.2 Kiến nghị - Nghiên cứu tiếp số chủng có khả đối kháng với nấm - Tiếp tục định danh đến lồi - Ni cấy dịch lấy dịch chống bệnh loét sọc miệng cạo cao su Nguyễn Lân Dũng, Phạm TÀI ThịLIỆU Trân THAM Châu, Nguyễn KHẢOThanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn TiếngMượu, Viêt PhạmVăn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học (tập 3), Xuân NXB Khoa học Kĩ Thuật, Hà Nội Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000), Nấm mốc phương pháp phòng chống, NXB Khoa học Kĩ Thuật, trang 69-111 Đoàn Lê Minh Hiền (2013).Tuyển chọn chủng Bacillus spp Có khả kháng nấm Fusarium sp Và Phytophthora Palmivora gây bệnh bắp(Zea maysl.), Luận văn tốt nghiệp, Trường ĐH Sư Phạm TP.HCM,tr.4-tr.18 Đinh Vũ Thắng (2006), Bước đầu tạo tiêu (Diper nigrum) in vitro kháng nấm Phytophthorasp., Luận văn tốt nghiệp, Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM, tr.9 Nguyễn Đức Lượng cs, Thí Nghiệm Vi Sinh Vật Học, Thí Nghiệm Cơng Nghệ Sinh học Tập 2,2006, NXB ĐHQG TP Hồ Chí Minh Nguyễn Hồng Trí, Phan Ngun Hồng (1995), “ Rừng ngập mặn Việt Nam, người HST phát triển bền vững ”, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 189-204 Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh (2006), Định danh nấm Phytophthora spp kĩ thuật sinh học phân tử, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đh Nông Lâm TP.HCM, tr.3-tr.5, tr.7tr.9 Nguyễn Lý Nhơn, Nguyễn Như Nhứt (2008), “Tiềm ứng dụng Bacillus subtilis để kiềm soát nấm bệnh Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani Phytophthora capsici”, Báo cáo Khoa học, Trường Đại Học Cần Thơ Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đh Sư phạm TP.HCM, tr.3-tr.10 10 Lê Tấn Lợi (2011), “Ảnh hưởng dạng lập địa tần số ngập triều lên tính chất lí hóa học đất khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ”, Tạp chí khoa học, Trường ĐH Cần Thơ, 7tr 11 Lương Đức Phẩm (2011), Sản xuất sử dụng chế phẩm sinh học nông nghiệp, NXB Giáo dục Việt Nam 12 Lương Đức Phẩm (2007), chế phẩm sinh hocdungf chăn nuôi nuôi trồng thủy sản, NXB Nơng Nghiệp, tr.143-tr.147 13 Trần Thị Bích Qun (2012), nghiên cứu tuyển chọn số chủng Bacillus làm probiotic chăn nuôi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP.HCM, tr.13-tr.20, tr.37, tr.48 Tiếng Anh 14 A.D.Agate C.V Subramania M Vannucci (1988), Mangrove microbiology, UNDP/UNESCO Regional Project RAS/86/1988, pp 9-18 15 Islam M.R., Yong Tea Jeong, Yong Se Lee, Chi Hyun Song (2010), “Isolation anh identification of antifungal compound from Bacillus subtilis C9 inhibiting the growth of plant pathogenicfungi”, Mycobiologi, 40 (1), p 61 16 Wan Gyn Rim, Hang Yeon Woen, Sang Yeob Lee (2007), In vitro Antagonistic Effect of Bacilli Isolates againts Four Soiborne Plant Pathogenic Fungi”, PlantPathologi Journal, 24(1), pp 52-56 17 Hai Kuan Wang, Rui Feng Xiao, Wei Qi (2012), “Antifungal Activity of Bacillus coagulans TQ33, Isolated from Skimmed Milk Powder, Againsnt Botrytis cinerea” Original Scientific,pp.2-3 Tài liêu từ internet 18 Bệnh tiêu sầu tiêu, http://tailieuvn.com.vn/qui-trinh-xu-ly-phong-va-tribenh- do-nam-phytopthora-gay-hai-tren-cay-tieu-bang-thuoc-agri-fos-400.html (13h, 17/09/1015) 19 http://tailieuvn.com.vn/tai-qui-trinh-xu-ly-phong-va-tri-benh-do-nam-phytopthora- gay-hai-tren-cay-sau-rieng-bang-thuoc-agri-fos-400.htm (13h, 17/09/2015) 20 http://kythuatnhanong.com/phong-nam-benh-phytopthora-cho-cacao-trong-mua-mua/ (13h, 17/09/2015) 21 Nguy ễn Thị Trần Thụy (2009), Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn sinh ptotease kiềm http://www.zbook.vn/ebook/nghien-cuu-tuyen-chon- chung-vikhuan-bacillus-phan-lap-tu-dat-vuon-sinh-protease-kiem-44653/ (20h, 18/09/2015) 22 Lê Xuân Phương, Thí nghiêm vi sinh vật học, https://www.lhu.edu.vn/Data/News/388/files/ThinghiemVisinh_lazk0.pdf (10h, 18/09/2015) 23 Lê Huy Hồng (2015), Quy trình thử nghiêm http://www.visinhyhoc.net/qui-trinh-thu-nghiem-catalase/ (14h30, 18/09/2015) Catalase, PHỤ LỤC (■ăngỊỂôi kháng CủB với nam'.RỊylơpAlAơrt a Hình 3.7 K chủng B4 đối ới nấm Hình 10 Khả đối kháng 34 -I o -nn-nrr /ÍAi bhổ-nrr nm Hình 3.12 Hình thái tíubà($của éhủnhgtlBíÌ tế bào chủng B2 Hình 3.11 Hình thái tế bào chủng B1 H ình 3.13 Hình tháHtếbàomĩhủngiB-ìế bào chủng B! 35 36 ... Phytophthora Đối tượng nghiên cứu - Nấm Phytophthora phân lập từ mẫu bệnh phẩm thực vật thu nhân Bình Dương - Vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn Phạm vi nghiên cứu - Khảo sát khả đối kháng vi khuẩn Bacillus. .. trình phân lập từ đất vườn, làm thu 11 chủng Bacillus chọn chủng nấm Với thí nghiệm khảo sát khả đối kháng nấm Phytophthora vi khuẩn Bacillus Chúng tiến hành khảo sát chủng Bacillus với chủng nấm. .. có khả kháng lại nấm Phytophthora trồng Kết nghiên cứu Qua trình phân lập từ đất vườn, làm thu 11 chủng Bacillus chọn chủng nấm Với thí nghiệm khảo sát khả đối kháng nấm Phytophthora vi khuẩn Bacillus