Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng của chủng xạ khuẩn 23 có khả năng đối kháng nấm fusarium oxysporum gây bệnh panama trên chuối

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƢỞNG CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN 23 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM GÂY BỆNH PANAMA TRÊN CHUỐI Giáo viên hƣớng dẫn : TRẦN THỊ HỒNG HẠNH Ngƣời thực : LÒ TRANG NHUNG Mã sinh viên : 637344 Lớp : K63CNSHD HÀ NỘI, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chƣa đƣợc sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận tốt nghiệp đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Lò Trang Nhung i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin trân trọng cảm ơn ban Giám đốc Học viện, khoa Công nghệ sinh học thầy, khoa tận tình giúp đỡ tơi suốt trình học tập, rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cán phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh quan tâm, giúp đỡ hƣớng dẫn tận tình q trình tơi thực khóa luận tốt nghiệp Bộ mơn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới đến Ths Trần Thị Hồng Hạnh tận tình hƣớng dẫn tơi q trình triển khai hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời đến tồn thể Phịng, Ban khoa Cơng nghệ sinh học Bộ môn Sinh học phân tử CNSH Ứng dụng tạo điều kiện thuận lợi cho hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân, bạn bè động viên, giúp đỡ suốt q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Lò Trang Nhung ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH v TÓM TẮT vi CHƢƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan chuối 2.1.1 Sơ lƣợc chuối 2.1.2 Vai trò ý nghĩa kinh tế chuối 2.1.3 Giá trị chuối 2.1.4 Một số loại bệnh chuối 2.2 Tổng quan nấm Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc) 10 2.2.1 Phân bố nấm Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc) 10 2.2.2 Phân loại đặc điểm nấm Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc) 11 2.2.3 Cơ chế tác động Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc) 12 2.3 Tổng quan xạ khuẩn 13 2.3.1 Giới thiệu chung phân bố xạ khuẩn 13 2.3.2 Phân loại xạ khuẩn 15 2.3.3 Tình hình nghiên cứu nƣớc nƣớc 15 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 19 3.1 Vật liệu, thời gian địa điểm nghiên cứu 19 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 19 iii 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất thí nghiệm 19 3.1.3 Môi trƣờng nuôi cấy 20 3.1.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 3.2 Nội dung nghiên cứu 21 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.3.1 Phƣơng pháp xác định sinh khối khô 21 3.3.2 Phƣơng pháp xác định mật độ xạ khuẩn (TCVN13045:2020) 21 3.3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng lên men 22 3.3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy 22 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng lên men 25 4.2 Ảnh hƣởng nồng độ pH 26 4.3 Ảnh hƣởng độ thơng khí 27 4.4 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 28 4.5 Ảnh hƣởng nguồn nitơ 28 4.6 Ảnh hƣởng nguồn carbon 29 4.7 Ảnh hƣởng tỷ lệ tiếp giống 31 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Kiến nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 39 iv DANH MỤC HÌNH Hình Bệnh Sigatoka chuối Hình 2 Bệnh thán thƣ chuối Hình Bệnh Panama chuối 10 Hình Các dạng bào tử nấm Fusarium oxysporum 12 Hình Biểu đồ ảnh hƣởng môi trƣờng lên men đến sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 23 25 Hình Biểu đồ ảnh hƣởng nồng độ pH đến khả sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 23 sau ngày nuôi cấy 26 Hình Ảnh hƣởng độ thơng khí đến sinh trƣởng xạ khuẩn 23 sau ngày nuôi cấy 27 Hình 4 Biểu đồ ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh trƣởng xạ khuẩn 23 28 Hình Biểu đồ ảnh hƣởng nguồn Nito đến sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 23 sau ngày nuôi cấy 29 Hình Ảnh hƣởng nguồn carbon đến sinh trƣờng phát triển chủng xạ 23 sau ngày nuôi cấy 30 Hình Ảnh hƣởng tỷ lệ tiếp giống đến sinh trƣởng xạ khuẩn 23 sau ngày nuôi cấy 31 v TÓM TẮT Chủng xạ khuẩn 23 đƣợc làm lƣu giữ phịng thí nghiệm, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học đƣợc hoạt hóa nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh trƣởng chủng Sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 23 đƣợc xác định dựa theo phƣơng pháp đo sinh khối mật độ xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn 23 có khả sinh trƣởng tốt môi trƣờng (MT3) tốc độ lắc 200 vòng/ phút nhiệt độ 30oC với lƣợng sinh khối khô đạt đƣợc 2,406 mg/ml mật độ xạ khuẩn 6,6.108 CFU/ml MT3 thích hợp tăng sinh khối xạ khuẩn 23 Chủng xạ khuẩn 23 có khả sinh trƣởng dải pH – pH Sinh khối xạ khuẩn cao pH với khối lƣợng sinh khối khô 2,701 mg/ml mật độ xạ khuẩn đạt 1,243.109 CFU/ml Xạ khuẩn 23 sinh trƣởng tốt với thể tích mơi trƣờng 25% thể tích bình ni, tỷ lệ tiếp giống 6%, thời gian nuôi cấy 132 giờ, nguồn carbon tinh bột nguồn cung cấp nitơ từ cao nấm men cho khối lƣợng sinh khối cao thí nghiệm ảnh hƣởng điều liện nuôi cấy đến chủng xạ khuẩn 23 vi CHƢƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Chuối loại ngắn ngày, nhiều cơng dụng tốn diện tích nên chuối đƣợc trồng phổ biến khắp nơi đất nƣớc ta dần trở thành mặt hàng có tiềm xuất quan trọng năm gần Theo Tổng cục thống kê năm 2021 Việt Nam có 155,3 nghìn trồng chuối với sản lƣợng quý I/2021 đạt 653,4 nghìn Nhiều trang trại trồng chuối tiêu quy mô vài chục đến hàng trăm đƣợc hình thành Hƣng Yên, Lào Cai, Đồng Nai… Cũng nhƣ nhiều nƣớc trồng chuối, Việt Nam phải đối mặt với bệnh héo vàng chuối (bệnh héo rũ panama) Trong vài năm gần bệnh héo rũ Panama (Fusarium oxysporum f.sp cubense) gây hại nhiều địa phƣơng, bệnh làm cho chuối héo vàng, suất giảm vƣờn chuối lụi dần sau 2-3 năm Để kiểm soát, khống chế lây nhiễm nguồn bệnh trồng ngƣời dân thƣờng sử dụng loại thuốc hóa học, cách nhanh hiệu để kìm hãm kiểm sốt mầm bệnh Năm 2020, việc sử dụng thuốc trừ sâu toàn cầu đƣợc ƣớc tính tăng lên đến 3,5 triệu (Anket Sharma et al., 2019) Thuốc trừ sâu đƣợc áp dụng để tăng suất trồng Tuy nhiên, theo thời gian thuốc trừ sâu tích lũy nƣớc, đất, khơng khí phận thực vật nhƣ ảnh hƣởng đến quần thể sinh vật Việc sử dụng rộng rãi thuốc trừ sâu làm ô nhiễm đất nƣớc, tồn đọng trồng cuối xâm nhập vào chuỗi thức ăn, gây mối đe dọa cho ngƣời Vì vậy, kiểm sốt sinh học bệnh thực vật đƣợc biết đến hiệu an tồn với mơi trƣờng so với việc sử dụng thuốc diệt nấm tổng hợp Hầu hết xạ khuẩn thuộc giống Atinomyces có khả hình thành chất kháng sinh, đặc điểm quan trọng xạ khuẩn Trong số 8.000 kháng sinh giới 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn So với thuốc hóa học, dùng chất kháng sinh bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp không gây nhiễm mơi trƣờng, cịn có khả ức chế vi sinh vật kháng thuốc hóa học Chất kháng sinh dịch lên men chủng sinh kháng sinh dùng xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh bên ngồi bên hạt, diệt bệnh phận nằm đất khử trùng đất Các chủng Streptomyces liên tục đƣợc khám phá để tìm thuốc kháng vi sinh vật gây bệnh Việc đánh giá ảnh hƣởng liên quan đến sinh khối xạ khuẩn cần đƣợc quan tâm trọng Sản xuất tác nhân kiểm soát sinh học bƣớc việc phát triển thành công sản phẩm kiểm soát sinh học để ứng dụng thƣơng mại Sản xuất chế phẩm cần xác định đƣợc ảnh hƣởng thành phần mơi trƣờng tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy đến sinh trƣởng chủng xạ khuẩn Tối ƣu hóa sản xuất chế phẩm bao gồm hai bƣớc: xác định thành phần môi trƣờng tối ƣu hóa điều kiện tăng trƣởng Để giải q trình sản xuất tác nhân kiểm sốt sinh học để có đƣợc số lƣợng tế bào cao chất chuyển hóa thứ cấp đƣợc tổng hợp hai, phƣơng thức hoạt động phải đƣợc biết đến Các bƣớc thƣờng đƣợc thực quy mơ phịng thí nghiệm thấp với bình Erlenmeyer để có hội để kiểm tra số lƣợng cao thành phần nồng độ, phát triển điều kiện đƣợc tối ƣu hóa lị phản ứng sinh học phịng thí nghiệm Cuối cùng, sản xuất nhân rộng đƣợc tiến hành lò phản ứng sinh học nhà máy thí điểm Nếu kết nhà máy thí điểm thành cơng, việc mở rộng quy trình sang điều kiện thƣơng mại khơng khó (Neus Teixidó et al., 2022) Nhận thấy tính cấp thiết đó, tơi tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 23 có khả kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh Panama chuối” 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Khảo sát ảnh hƣởng số yếu tố đến sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 23 có khả kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh Panama Chuối 1.2.2 Yêu cầu Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến khả sinh trƣởng xạ khuẩn 23 Đánh giá ảnh hƣởng số điều kiện nuôi cấy đến khả sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 23 17 Prusky, D.; Plumbley, R.A.(1992) Quiescent infections of Colletotrichum in tropical and subtropical fruits Colletotrichum: biology, pathology and control, Bailey, J.A.Jeger, M.J (eds.).- Wallingford (United Kingdom): CAB International, 1992.- ISBN 0-85198-756-7 289-307 18 Reddy N G., Ramakrishna D.P.N & Rajagopal S.V (2011) Optimization of culture conditions of Streptomyces rochei (MTCC 10109) for the production of antimicrobial metabolites Egyptian Journal of Biology, 13: 21-29 19 Sharma A., Kumar V., Shahzad B., Tanveer M., Sidhu G P S., Handa N., Kohli S K., Yadav P., Bali A S., Parihar R D., Dar O I., Singh K., Jasroti S., Bakshi P., Ramakrishna M., KumarS., Bhardwaj R., Thukral A K (2019) Worldwide pesticide usage and its impacts on ecosystem SN Applied Sciences 1(11):1446 20 Thakur D., Bora T.C , Bordoloi G.N., Mazumdar S.(2009) Influence of nutrition and culturing conditions for optimum growth and antimicrobial metabolite production by Streptomyces sp 201 Journal de Mycologie Médicale 19, 161-167 21 Teixidó N., Usall J., Torres R (2022) Insight into a Successful Development of Biocontrol Agents: Production, Formulation, Packaging, and Shelf Life as Key Aspects Horticulturae, 8, 305 22 Shan Y., Liac F., Lianac Q., Xieac L., Zhua H., Lia T., Zhang J., Duana X., Jiang Y (2022) Role of apyrase-mediated eATP signal in chilling injury of postharvest banana fruit during storage Postharvest Biology and Technology, volume 187 23 Stover, R.H and Simonds, N.W (1987) Bananas 3rd Edition, Longman, London, 468 p 24 Wang X., Huang L., Kang Z., Buchenauer H and Gao X (2010) Optimization of the Fermentation Process of Actinomycete Strain Hhs.015T J Biomed Biotechnol 2010; 2010: 141876 25 Zhang L., Zhang H., Huang Y, Peng J., Xie J and Wang W (2021) Isolation and Evaluation of Rhizosphere Actinomycetes With Potential Application for Biocontrolling Fusarium Wilt of Banana Caused by 37 Fusarium oxysporum f sp cubense Tropical Race Frontiers in Microbiology Tài liệu trực tuyến Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2021) Ban hành quy trình phịng, chống bệnh héo vàng chuối Truy câp từ https://www.ppd.gov.vn/FileUpload/Documents/BVTV/21.03.09_quy%20tri nh%20phong%20chong%20heo%20vang%20chuoi_0001.pdf ngày 03/01/2022 Chi cục Trồng trọt Bảo vệ thực vật Vĩnh Long (2021) Quy trình quản lý tổng hợp bệnh héo vàng chuối Truy cập từ http://ccttbvtv.vinhlong.gov.vn/Info.aspx?id=22420211638337 ngày 04/01/2022 FAO (2021) Banana Statistical Compendium 2020 Rome FAO (2021) Banana market review – Preliminary results 2020 Rome FAO (2022) Banana market review: Preliminary results 2021 Rome Thanh Tâm (2021) Cây chuối mang tỷ USD, tận dụng tốt phần Tạp chí Kinh tế nơng thơn Truy cập từ https://kinhtenongthon.vn/caychuoi-co-the-mang-ve-ty-usd-neu-tan-dung-tot-moi-phanpost43938.html#:~:text=C%E1%BB%A5%20th%E1%BB%83%2C%20tron g%205%20th%C3%A1ng,Trung%20Qu%E1%BB%91c%20%C4%91%E1 %BA%A1t%20339.673%20t%E1%BA%A5n ngày 23/01/2022 Sở Nông nghiệp Phát triển nơng thơn tinh Bình Dƣơng (2021) Quy trình phịng chống bệnh héo váng chuối Truy cập từ http://ccttbvtvbinhduong.gov.vn/tin-tuc/quy-trinh-phong-chong-benh-heovang-la-chuoi-209.html ngày 23/01/2022 38 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả sinh trƣởng chủng XK23 39 Phụ lục 2: Bảng số liệu ảnh hƣởng môi trƣờng đến sinh trƣởng chủng xạ 23 Gause ISP2 Sinh khối xạ khuẩn (mg/ml) 1.19 1.46 Mật độ xạ khuẩn (CFUx108/ml) 2.525 3.63 ISP4 2.217 4.92 MT1 1.361 2.775 MT3 2.406 6.6 MT7 0.923 1.625 Môi trƣờng 40 Phụ luc 3: Ảnh hƣởng pH đến khả sinh trƣởng chủng XK23 41 Phụ lục 4: Bảng số liệu ảnh hƣởng nồng độ pH đến sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 23 pH3 pH4 Sinh khối xạ khuẩn (mg/ml) 0.056 0.08 Mật độ xạ khuẩn (CFUx108/ml) 0.025 0.055 pH5 0.862 2.5 pH6 2.357 11.63 pH7 2.701 12.43 pH8 1.79 8.4 pH9 0.974 4.75 Nồng độ pH 42 Phụ lục 5: Ảnh hƣởng thể tích đến khả sinh trƣờng chủng XK23 43 44 Phụ luc 6: Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh trƣờng chủng XK23 45 Phụ lục 7: Bảng số liệu ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 23 Sinh khối xạ khuẩn (mg/ml) 1.084 2.704 Mật độ xạ khuẩn (CFUx108/ml) 3.6 10.03 Cao thịt 1.702 7.17 Peptone 0.74 3.15 NH4NO3 0 Nguồn nitơ Đậu tƣơng Cao nấm men 46 Phụ lục 8: Ảnh hƣởng nguồn carbon đến sảnh hƣởng XK23 47 Phụ lục 9: Ảnh hƣởng thời gian đến khả sinh trƣởng XK23 48 49 Phụ lục 10: Ảnh hƣởng tỷ lệ tiếp giống đến sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 23 50 51