KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AFLATOXIN CỦA Bacillus subtilis PHÂN LẬP TỪ ĐẤT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AFLATOXIN CỦA Bacillus subtilis PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : VÕ THIÊN THI HẠ Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng 7/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AFLATOXIN CỦA Bacillus subtilis PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI VÕ THIÊN THI HẠ Tháng 7/2011 ii LỜI CẢM ƠN Con xin khắc ghi công lao sinh thành dưỡng dục cha mẹ Con cám ơn gia đình ln động viên chỗ dựa tinh thần cho gặp khó khăn Chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, quý thầy cô dạy bảo truyền đạt cho em kiến thức quý báu suốt thời gian học trường PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài TS Lê Anh Phụng, ThS Trương Đình Bảo, ThS Nguyễn Ngọc Thanh Xuân nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành tốt khóa luận Cám ơn bạn Khánh Linh, Oanh, Ngọc, Tường thực tập phòng vi sinh nhiệt tình giúp đỡ suốt thời gian làm đề tài phòng Cuối em xin cám ơn người bạn giúp đỡ, an ủi chia sẻ em gặp khó khăn i TĨM TẮT Aflatoxin loại độc tố nấm mốc quan trọng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người vật nuôi đặc biệt gây tổn hại nghiêm trọng tới tế bào gan Việc ức chế phát triển nấm mốc sản sinh aflatoxin điều cần thiết để hạn chế nhiễm nấm mốc thức ăn tổn thất kinh tế chăn nuôi gia súc Một lồi vi sinh vật có khả ức chế phát triển nấm mốc sản sinh aflatoxin vi khuẩn Bacillus subtilis nên thực đề tài “Khảo sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng Bacillus subtilis phân lập từ đất” phòng Thí nghiệm vi sinh Khoa Chăn Ni Thú Y trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM từ tháng năm 2011 đến tháng năm 2011 Và chúng tơi có kết luận sau: Sau ngày nuôi cấy chung Aspergillus flavus Bacillus subtilis môi trường thạch nước cốt dừa, quan sát đèn UV nhận thấy số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả ức chế sinh trưởng sản sinh aflatoxin nấm mốc Aspergillus flavus chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis số có khả ức chế mạnh Sau nuôi cấy vi khuẩn mơi trường có khơng có aflatoxin với nồng độ khác ngày kết phân tích thống kê (p > 0,05) hàm lượng aflatoxin số lượng vi khuẩn khơng có mối tương tác với ii SUMMARY Aflatoxin is a dangerous toxic from fungi which damages greatly to liver of the human and animals Therefore it is imperative to inhibit the growth of bacteria and reduce the concentration of aflatoxin Although there were many methods to reduce amount of aflatoxin as well as the growth of mould, most of scientists still use antagonistic microorganisms for their research because of its safety As we found that one of microorganisms could inhibit the growth of fungi and aflatoxin was Bacillus subtilis The of Bacillus subtilis thesis isolated “Survey of inhibited aflatoxin production by strains from soil” was carried out at Microbiological Laboratory of the Faculty of Animal Husbandry and Veterinary, Agriculture and Forestry University from January to July in 2011 And we had the following results: After culturing Aspergillus flavus and Bacillus subtilis together in days on coconut agar, observed under UV light , we found that some strains of Bacillus subtilis could inhibit the production of aflatoxin of Aspergillus flavus and Bacillus subtilis strain was selected as the strongest inhibitor After days culturing the bacteria in the TSB with and without aflatoxin with different concentrations, we had found that there is no interaction between aflatoxin and Bacillus subtilis development with p > 0,05 iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài .2 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1 Lịch sử phát triển 2.1.2 Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.2.1 Đặc điểm phân loại .3 2.1.2.2 Đặc điểm phân bố 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.5 Đặc điểm sinh hóa .5 2.1.6 Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên .5 2.1.7 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.7.1 Cấu tạo bào tử 2.1.7.2 Đặc điểm tác dụng bào tử 2.1.8 Tính chất đối kháng Bacillus subtilis với vi khuẩn gây bệnh 2.1.9 Những nghiên cứu tác dụng đối kháng Aspergillus… 10 2.2 Khái quát nấm mốc sinh aflatoxin .11 2.2.1 Khái niệm nấm mốc .11 2.2.2 Độc tố nấm mốc 12 2.2.3 Độc tố aflatoxin 12 iv 2.2.3.1 Nguồn gốc 12 2.2.3.2 Cấu trúc hóa học đặc tính hóa lý aflatoxin 13 2.2.3.3 Sự sinh tổng hợp aflatoxin 15 2.2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tạo aflatoxin 15 2.2.3.5 Cơ chế gây bệnh aflatoxin 16 2.2.3.6 Những tác hại aflatoxin gây .17 2.2.3.7 Các phương pháp phân hủy aflatoxin 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 3.2.Đối tượng khảo sát 22 3.3 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 22 3.4 Môi trường nuôi cấy 22 3.5 Phương pháp nghiên cứu 22 3.5.1 Kiểm tra khả sinh aflatoxin Aspergillus flavus… .22 3.5.1.1 Kiểm tra khả sinh aflatoxin Aspergillus flavus .23 3.5.1.2 Đánh giá sơ khả ức chế sản sinh aflatoxin… 23 3.5.2 Đánh giá ảnh hưởng aflatoxin khả làm giảm aflatoxin…24 3.5.2.1 Đánh giá ảnh hưởng aflatoxin lên phát triển vi khuẩn 24 3.5.2.2 Đánh giá tác động vi khuẩn lên hàm lượng aflatoxin 26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kiểm tra khả sinh aflatoxin Aspergillus flavus… .28 4.1.1 Kiểm tra khả sinh aflatoxin Aspergillus flavus 28 4.1.2 Đánh giá sơ khả ức chế sản sinh aflatoxin… 29 4.2 Đánh giá tác động aflatoxin khả làm giảm aflatoxin… 31 4.2.1 Đánh giá tác động aflatoxin lên phát triển vi khuẩn 31 4.2.2 Đánh giá ảnh hưởng vi khuẩn lên hàm lượng aflatoxin 32 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT cfu Colony-forming unit ctv Cộng tác viên DNA Deoxyribonucleic acid ppb Part per billion UV Ultra Violet RNA Rebonucleic acid vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hóa Bacillus subtilis Bảng 2.2 Sự khác tế bào sinh dưỡng bào tử Bacillus subtilis Bảng 2.3 Số lượng Escherichia coli (cfu/ml) 10 Bảng 2.4 Khả ức chế aflatoxin B1 chủng vi khuẩn 11 Bảng 2.5 Một số loài nấm mốc có khả sinh aflatoxin 13 Bảng 2.6 Ảnh huởng pH lên hàm luợng aflatoxin (µg/150 ml) 14 Bảng 2.7 Khả ức chế aflatoxin chủng Bacillus subtilis 21 Bảng 3.1 Đánh giá tác động aflatoxin lên vi khuẩn 25 Bảng 3.2 Đánh giá ảnh hưởng vi khuẩn lên hàm lượng aflatoxin 27 Bảng 4.1 Tổng số vi khuẩn Bacillus subtilis 32 Bảng 4.2 Hàm lượng aflatoxin 33 Bảng 4.3 Giá trị pH hàm lượng aflatoxin vào ngày 0, ngày 33 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 2.2 Cấu trúc hóa học surfactin Hình 2.3 Cấu trúc hóa học agrastatin Hình 2.4 Cấu trúc hóa học iturin Hình 2.5 Aspergillus flavus 11 Hình 2.6 Cấu trúc hóa học loại aflatoxin 14 Hình 2.7 Điều kiện tạo aflatoxin từ nấm mốc .15 Hình 2.8 Sự gắn kết aflatoxin B1 vào chuỗi DNA vị trí 7N Guanin 17 Hình 3.1 Thí nghiệm khả sinh aflatoxin Aspergillus flavus 23 Hình 3.2 Khả ức chế sản sinh aflatoxin vi khuẩn Bacillus subtilis .23 Hình 3.3 Đánh giá ảnh hưởng aflatoxin lên phát triển vi khuẩn 26 Hình 4.1 Khuẩn lạc Aspergillus flavus ánh đèn UV sau ngày ni cấy 28 Hình 4.2 Khuẩn lạc vi khuẩn tiếp xúc chưa tiếp xúc với khuẩn lạc nấm mốc 29 Hình 4.3 Vòng sáng aflatoxin chỗ tiếp xúc, không tiếp xúc với vi khuẩn 29 Hình 4.4 Sự ức chế khuẩn lạc vi khuẩn khuẩn lạc nấm mốc .30 Hình 4.5 Vòng sáng aflatoxin phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis 30 Hình 4.6 Vòng sáng aflatoxin A flavus 31 viii Bảng 3.1 Đánh giá ảnh hưởng aflatoxin lên phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis Lô Nồng độ aflatoxin (ppb) Thể tích dịch vi khuẩn giống (ml) Thí nghiệm 100 200 1 450 600 Đối chứng 2500 - - - - - 1 1 1 ( -): khơng có aflatoxin Thời gian: ngày Chỉ tiêu theo dõi: tổng số lượng vi khuẩn vào ngày 0, 3, thí nghiệm  Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn Bacillus subtilis Pha loãng huyễn dịch mẫu thu theo bậc 10 liên tiếp, chọn nồng độ pha loãng liên tiếp thích hợp, dùng micropipette hút 0,1 ml huyễn dịch mẫu cho lên môi trường đĩa TSA, trang que trang vô trùng, ủ 37oC 24 Đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn hình thành đĩa theo cơng thức - Số khuẩn lạc trung bình 1ml dịch mẫu độ pha loãng liên tiếp Y= (x1+ x2 + x3)/3 Trong đó: Y: số khuẩn lạc trung bình độ pha lỗng x1, x2, x3: số khuẩn lạc trung bình có ml dịch mẫu nồng độ pha loãng - Số khuẩn lạc 1ml dịch mẫu độ pha lỗng X = A/(h * V) Trong đó: X: số khuẩn lạc có 1ml dịch mẫu pha lỗng A: số khuẩn lạc trung bình có đĩa (trong tổng số đĩa nồng độ pha loãng) h : độ pha lỗng (10-5, 10-6…) V : thể tích dịch mẫu cấy đĩa Theo dõi số lượng vi khuẩn phân tích thơng kê vào ngày 0, ngày 3, ngày để kiểm tra khác biệt số lượng vi khuẩn lơ đối chứng khơng có aflatoxin lơ 25 thí nghiệm có aflatoxin Nếu có sai khác có nghĩa aflatoxin tác động đến vi khuẩn làm thay đổi tổng số vi khuẩn môi trường 3.5.2.2 Đánh giá tác động vi khuẩn lên hàm lượng aflatoxin  Mục tiêu: tìm hiểu khả ức chế vi khuẩn Bacillus subtilis aflatoxin - Chuẩn bị mơi trường TSB có bổ sung aflatoxin giống mục 3.5.2.1 - Chuẩn bị dịch vi khuẩn: dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn Bacillus subtilis chọn thí nghiệm 3.5.1.2 từ ống giống TSA nghiêng cho vào 30 ml mơi trường TSB chuẩn bị, ủ bình TSB cấy vi khuẩn 37oC 24 h Sau dùng micropipette hút dịch vi khuẩn cho vào ống nghiệm môi trường TSB bổ sung aflatoxin theo tỷ lệ 1/10 thể tích Đối với lơ đối chứng khơng cho vi khuẩn mà có mơi trường TSB bổ sung aflatoxin với nồng độ khác nhau: 100 ppb, 200 ppb, 450 ppb, 600 ppb, 2500 ppb Cả lơ đối chứng lơ thí nghiệm đem ủ 37oC theo dõi ngày Sau tiến hành đo hàm lượng aflatoxin vào ngày 3, ngày Chỉ đo nồng độ cuối (450 ppb, 600ppb, 2500 ppb) Đồng thời theo dõi pH lúc đầu sau nuôi cấy vi khuẩn tất lô 100 ppb 200 ppb Theo dõi hàm lượng aflatoxin 37OC TSB 450 ppb 24 vào ngày 3, 600 ppb 2500 pppb Hình 3.3 Đánh giá ảnh hưởng vi khuẩn lên hàm lượng aflatoxin 26 Bảng 3.2 Đánh giá ảnh hưởng vi khuẩn lên hàm lượng aflatoxin Lô Nồng độ aflatoxin (ppb) Vi khuẩn Đối chứng 100 200 - - Thí nghiệm 450 600 - - 2500 100 200 - + + 450 600 2500 + + + (-): khơng có vi khuẩn; (+): có vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: pH mơi trường trước sau nuôi cấy, hàm lượng aflatoxin vào ngày 3, ngày  Phương pháp theo dõi pH: sử dụng máy đo pH  Phương pháp xác định nồng độ aflatoxin: gửi mẫu phân tích theo phương pháp sắc ký lớp mỏng  Dùng trắc nghiệm Ttest để đánh giá kết thống kê Nếu nồng độ aflatoxin lơ thí nghiệm sau phân tích ngày 3, ngày khác biệt so với lô đối chứng chứng tỏ vi khuẩn làm ảnh hưởng đến hàm lượng aflatoxin Do aflatoxin bị ảnh hưởng môi trường kiềm nên ta cần đo pH lúc trước sau ni cấy lơ thí nghiệm đối chứng để đánh giá xác nguyên nhân làm thay đổi hàm lượng aflatoxin có, từ đánh giá tác động vi khuẩn lên hàm lượng aflatoxin 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kiểm tra khả sinh aflatoxin Aspergillus flavus đánh giá sơ khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng Bacillus subtilis 4.1.1 Kiểm tra khả sinh aflatoxin Aspergillus flavus Sau – ngày nuôi cấy môi trường thạch nước cốt dừa đem soi đèn UV (365 nm) kết hình 4.1 a) a) b) A c) Hình 4.1 Khuẩn lạc Aspergillus flavus (A flavus) ánh đèn UV sau ngày nuôi cấy (a) chủng A flavus M12; (b) chủng A flavus M20; (c) chủng A.flavus M4; A: vòng sáng aflatoxin Vòng sáng quanh khuẩn lạc nấm mốc vòng aflatoxin Aspergillus flavus sinh Vòng sáng sáng chứng tỏ lượng độc tố sinh nhiều, mạnh Như hình 4.1 độ sáng vòng aflatoxin chủng nấm mốc A flavus M4 cho độ sáng cao chủng M20 độ sáng thấp ngược lại chủng M12 khơng có vòng sáng aflatoxin quanh khuẩn lạc Điều cho thấy chủng M4 có khả sinh aflatoxin 28 A nhiều M12 khơng có khả sinh dộc tố, M4 chọn làm tiếp thí nghiệm sau 4.1.2 Đánh giá sơ khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Theo dõi từ ngày đầu nuôi cấy nấm mốc đến ngày thứ 3, quan sát bên thấy số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis bắt đầu tiếp xúc với khuẩn lạc nấm mốc Aspergillus flavus chủng số ngược lại số chủng chưa tiếp xúc với khuẩn lạc nấm mốc Aspergillus flavus chủng số A B a) b) Hình 4.2 Khuẩn lạc vi khuẩn tiếp xúc chưa tiếp xúc với khuẩn lạc nấm mốc (a) chủng Bacillus subtilis số nuôi cấy chung với nấm mốc; (b) chủng Bacillus subtilis số nuôi cấy chung với nấm mốc; A: khuẩn lạc vi khuẩn; B: khuẩn lạc nấm mốc Dưới đèn UV chỗ tiếp xúc khuẩn lạc nấm mốc vi khuẩn vòng sáng mờ bị khuyết chỗ khơng tiếp xúc vòng sáng sáng a) a) b) b) Hình 4.3 Vòng sáng aflatoxin khơng chỗ tiếp xúc không tiếp xúc với khuẩn lạc vi khuẩn (a) chủng Bacillus subtilis số nuôi cấy chung với nấm mốc;(b)chủng Bacillus subtilis số nuôi cấy chung với nấm mốc 29 Như hình 4.3 chủng Bacillus subtilis bắt đầu tiếp xúc khuẩn lạc nấm mốc nên vòng sáng aflatoxin quanh khuẩn lạc mờ bị khuyết Còn chủng số vi khuẩn chưa tiếp xúc vòng sáng aflatoxin quanh khuẩn lạc nấm mốc sáng không bị khuyết Sang ngày thứ 4, thứ khuẩn lạc vi khuẩn bắt đầu ăn sâu vào khuẩn lạc nấm mốc Những chỗ khuẩn lạc vi khuẩn tiếp xúc khuẩn lạc nấm mốc khơng phát triển bị khuyết chỗ khơng tiếp xúc khuẩn lạc nấm mốc phát triển bên ngồi Hình 4.4 Sự ức chế khuẩn lạc vi khuẩn khuẩn lạc nấm mốc Khi quan sát đèn UV (bước sóng 365 nm) chỗ tiếp xúc khuẩn lạc nấm mốc bị khuyết vòng sáng bị mờ bị khuyết, chỗ khuẩn lạc nấm mốc phát triển vòng sáng độ sáng bị mờ nhiều Hình 4.5 Vòng sáng aflatoxin bị mờ khuyết phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis 30 Tại vị trí tiếp xúc với khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtils khuẩn lạc nấm mốc Aspergillus flavus bị khuyết vào không phát triển hình 4.4 chứng tỏ vi khuẩn Bacillus subtilis ức chế phát triển nấm mốc Aspergillus flavus Qua kết đèn UV cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis có khả ức chế sản sinh độc tố aflatoxin nấm mốc Aspergillus flavus, hình 4.3 hình 4.5 chỗ tiếp xúc khuẩn lạc nấm mốc vòng sáng aflatoxin bị mờ nhiều So sánh khả ức chế sinh aflatoxin 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis thể qua độ sáng vòng aflatoxin đèn UV bước sóng 365 nm (tại vị trí khuẩn lạc nấm mốc tiếp xúc với khuẩn lạc vi khuẩn) a) b) d) e) c) f) Hình 4.6 Vòng sáng aflatoxin A flavus ni cấy chung với chủng Bacillus subtilis(B.s) khác đèn UV (a) chủng B s 8; (b) chủng B s 2; (c) chủng B s 5; (d) chủng B s 6; (e) chủng B s 3; (f) chủng B s 11 Theo hình 4.6 chủng số làm vòng sáng aflatoxin mờ nhất, chủng số 3, số 6, số 11 cho kết vòng sáng aflatoxin có độ sáng cao nhất, chủng lại làm mờ vòng sáng aflatoxin Do chủng số chọn để tiến hành thí nghiệm 4.2 Đánh giá tác động aflatoxin lên phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis khả làm giảm aflatoxin Bacillus subtilis 4.2.1 Đánh giá tác động aflatoxin lên phát triển vi khuẩn Sau ngày theo dõi phát triển vi khuẩn có kết tổng số lượng vi khuẩn 31 Bảng 4.1 Tổng số vi khuẩn Bacillus subtilis Ngày Mẫu Ngày Ngày Ngày ĐC 10,91 11,63 12,61 M100ppb 11,62 9,08 12,96 M200ppb 11,00 12,24 12,04 M450ppb 11,54 12,15 12,51 M600ppb 11,00 11,01 13,35 M2500ppb 10,10 11,08 12,03 Kết phân tích thống kê khác số lượng vi khuẩn lơ đối chứng khơng có aflatoxin lơ thí nghiệm có aflatoxin ngày 0, ngày 3, ngày khơng có ý nghĩa (p > 0,05) Sự khác biệt số lượng vi khuẩn nồng độ aflatoxin khác khơng có ý nghĩa mặt thống kê (p > 0,05) Do nói aflatoxin khơng làm ảnh hưởng đến phát triển vi khuẩn Mặt khác khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê số lượng mẫu số lần lặp lại điều kiện kinh phí hạn chế nên dẫn đến sai số lớn Dù thể tích dịch vi khuẩn cho vào lô phương pháp thực hút số lượng vi khuẩn khác lần hút nên tiến hành đếm số lượng vi khuẩn vào ngày để biết chắn số lượng vi khuẩn ban đầu có sở để so sánh ngày rõ ràng có khác biệt lơ dù chưa bị tác động khác biệt ý nghĩa mặt thống kê 4.2.2 Đánh giá ảnh hưởng vi khuẩn lên hàm lượng aflatoxin Khi phân tích hàm lượng aflatoxin qua ngày kết theo bảng 4.2 Thấy thay đổi hàm lượng aflatoxin tất lô không theo quy luật Kết phân tích thống kê cho thấy khác biệt hàm lượng aflatoxin lô đối chứng khơng có vi khuẩn lơ thí nghiệm có vi khuẩn khơng có ý nghĩa (p > 0,05), có mặt vi khuẩn khơng làm ảnh hưởng đến hàm lượng aflatoxin Hàm lượng aflatoxin theo bảng 4.3 tăng giảm ngày có lẽ điều kiện nuôi cấy không ổn định (do lấy 32 mẫu kiểm tra liên tục) làm ảnh hưởng đến hàm lượng aflatoxin Cũng số lần lặp lại số lượng mẫu phân tích khơng nhiều nên dẫn đến sai số lớn Bảng 4.2 Hàm lượng aflatoxin Ngày Mẫu Ngày Ngày ĐC 450 ppb 1820 ppb 400 ppb ĐC 600 ppb 3820 ppb 284 ppb ĐC 2500 ppb 110 ppb 85 ppb M 450 ppb ppb 192 ppb M 600 ppb 1040 ppb 175 ppb M 2500 ppb 208 ppb 166 ppb ĐC: lô đối chứng khơng có vi khuẩn với nồng độ aflatoxin tương ứng; M: lơ thí nghiệm có vi khuẩn với nồng độ aflatoxin tương ứng Ngoài pH ảnh hưởng đến hàm lượng aflatoxin So sánh lại hàm lượng aflatoxin vào ngày đầu ngày cuối với giá trị pH có kết theo bảng sau: Bảng 4.3 Nồng độ aflatoxin giá trị pH vào ngày ngày Mẫu Ngày Ngày pH Nồng độ aflatoxin (ppb) pH Nồng độ aflatoxin (ppb) ĐC450ppb 7,3 450 7,4 400 ĐC600ppb 7,3 600 7,4 284 ĐC2500ppb 7,3 2500 7,3 85 M450ppb 7,3 450 7,5 192 M600ppb 7,3 600 7,6 175 M2500ppb 7,3 2500 7,6 166 Theo phân tích tương quan mối quan hệ thay đổi pH thay đổi hàm lượng aflatoxin độc lập, hay nói cách khác khác biệt ngẫu nhiên 33 thay đổi pH khơng có mối tương quan đến hàm lượng aflatoxin Tuy nhiên pH môi trường nuôi cấy vi khuẩn lại tăng q trình phát triển vi khuẩn tiết chất mang tính kiềm 34 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Tìm chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả ức chế sản sinh aflatoxin từ nấm mốc Aspergillus flavus Khơng có ảnh hưởng qua lại nồng độ aflatoxin số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis Sự thay đổi pH phạm vi nghiên cứu đề tài khơng có mối tương quan với nồng độ aflatoxin 5.2 Đề nghị Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng chủng Bacillus subtilis số bổ sung vào thức ăn gia súc Sàng lọc thêm chủng khác có khả ức chế mạnh 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần Tiếng Việt: Tơ Minh Châu 2000 Giáo trình vi sinh vật ứng dụng chăn nuôi Tủ sách Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty, 2001 Vi sinh vật học NXB giáo dục Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp 2003 Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi NXB nông nghiệp Lý Kim Hữu 2005 Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic Luận văn tốt nghiệp Khoa Chăn Nuôi-Thú Y Trường Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Dương Thanh Liêm 2001 Giáo trình độc chất học Tủ sách Đại Học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Nguyễn Quỳnh Nam 2006 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis phân heo thử đối kháng với Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy heo Luận văn tốt nghiệp Khoa Công Nghệ Sinh Học Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Lê Anh Phụng 2001 Bệnh nhiễm độc aflatoxin phương pháp phát aflatoxin Chuyên đề cấp tiến sĩ Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Lê Anh Phụng 2001 Nấm mốc sinh độc tố ảnh hưởng độc tố nấm mốc động vật Hướng khắc phục độc tố nấm mốc Chuyên đề cấp tiến sĩ Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Phạm Hồng Thái 2007 Phân lập vi khuẩn Bcillus subtilis từ đất khảo sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng phân lập Luận văn tốt nghiệp Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Khắc Tuấn 1996 Vi sinh vật học NXB nông nghiệp 11 Nguyễn Ngọc Quỳnh Trâm 2010 Đánh giá tương tác Bacillus subtilis kháng sinh việc ức chế vi khuẩn E coli Luận văn tốt nghiệp Khoa Chăn Nuôi – Thú Y Trường Đại Học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh 12 Đặng Ngọc Phương Uyên 2007 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất khảo sát tính đối kháng với vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy heo Luận văn tốt nghiệp Khoa Công Nghệ Sinh Học Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh Phần tiếng Anh: 13 A Ceigler, E B Lillehoj, R E Peterson, and H H Hall 1966 Microbial Detoxification of Aflatoxin Applied Microbiology 14: 934 - 939 14 Norio Kimura and Susumu Hirano Inhibitory Strains of Bacillus subtilis for Growth and Aflatoxin production of Aflatoxigenic fungi 1988 Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry 52: 1173 – 1179 15 Nguyen Ngoc Hai 2006 Bacillus subtilis possibly used for aflatoxin control Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture 75 – 77 16 J W Bennett and Klich Mycotoxins 2003 Clinical Microbiology Reviews 16: 497 - 516 36 Internet: http://ci.nii.ac.jp/naid/110006323784/ http://nhanloc.net/ http://vi.wikipedia.org 37 PHỤ LỤC THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG 1.1 Trypticase Soya Agar (TSA) Soya peptone 15g Tryptone peptone 5g NaCl 5g Agar 18g Nước cất 1000 ml pH 7,3 ± Cân 30 g môi trường TSB + 18 g agar, hòa tan vào 1000ml nước cất, đem hấp tiệt trùng 121oC 20 phút 1.2 Trypticase Soya Broth (TSB) Soya peptone 15 g Tryptone peptone 5g NaCl 5g Nước cất 1000 ml pH 7,3 ± Cân 30 g mơi trường TSB, hòa tan vào 1000ml nước cất, đem hấp tiệt trùng 121oC 20 phút 1.3 Môi trường thạch khoai tây Khoai tây: 200 g Saccharose: 20 g Cloramphenicol: 1–2g Agar: 18 g Nước cất: 1000 ml pH = 6.5 1.4 Môi trường thạch nước cốt dừa Nước cốt dừa đóng hộp: 500 ml Nước cất: 500 ml Agar: 18 g Cloramphenicol: 1–2g HÓA CHẤT Nước muối sinh lý 0.9 % NaCl: 9g Nước cất: 1000 ml ... 1/103, hàm luợng aflatoxin giảm 99,6 lần Năm 2007, Phạm Hoàng Thái thực đề tài Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất, khảo sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng 10 phân lập đuợc” Kết... đề tài Khảo sát khả sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis có nguồn gốc từ đất xử lý nhiễm aflatoxin nguyên liệu bắp” cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất có khả làm giảm aflatoxin. .. protease Chúng tiến hành đề tài: “ Khảo sát khả ức chế aflatoxin Bacillus subtilis phân lập từ đất 1.2 Yêu cầu đề tài Đánh giá khái quát khả làm giảm aflatoxin ảnh hưởng aflatoxin lên phát triển vi