Nghiên cứu khả năng tổng hợp pectinase của nấm mốc phân lập từ cơ chất giàu pectin và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGUYỄN THỊ THÚY HÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỔNG HỢP PECTINASE CỦA NẤM MỐC PHÂN LẬP TỪ CƠ CHẤT GIÀU PECTIN VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Đồ uống Mã số: 60.54.02 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Đà Nẵng – Năm 2011 Footer Page of 126 Header Page of 126 Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN THỊ XÔ Phản biện 1: TS ĐẶNG MINH NHẬT Phản biện 2: PGS TS PHẠM NGỌC ANH Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ kỹ thuật họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 26 tháng 11 năm 2011 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Qua nhiều nghiên cứu gần ñây cho thấy enzym pectinase ngày có nhiều ứng dụng quan trọng lĩnh vực sống: công nghiệp chế biến thực phẩm (như sản xuất rượu vang nước giải khát, sản xuất nước quả, sản xuất cà phê), y học, công nghiệp dệt sợi, sản xuất giấy, xử lý nước thải…[3] Bên cạnh ñó, pectinase mang ñến bước tiến cho nông nghiệp Việc khám phá khả kháng bệnh thực vật ñã ñược kiểm tra với số chủng gây bệnh Kết cho thấy, dưa chuột cà chua non ñược xử lý với enzym pectinase thô có sức ñề kháng chống lại bệnh tốt [20] Thế nhưng, thực tế việc ứng dụng pectinase sản xuất chiếm tỷ lệ không ñáng kể Theo thống kê tình hình ứng dụng pectinase công nghiệp giới chiếm 3% tổng số enzym ñược sử dụng [6], enzym có nhiều ý nghĩa sản xuất Trên thị trường nay, nước châu Âu châu Mỹ sản xuất bán thị trường enzym pectinase loại enzym khác với số lượng lớn Ở Việt Nam, enzym pectinase chủ yếu ñược nhập ngoại Xuất phát từ khía cạnh trên, ñã chọn ñề tài “Nghiên cứu khả tổng hợp pectinase nấm mốc phân lập từ chất giàu pectin ứng dụng công nghệ thực phẩm” nhằm phân lập chủng nấm mốc có khả tổng hợp enzym pectinase cao, từ ñó tiến hành khảo sát số ñiều kiện nuôi cấy thích hợp cho trình sinh tổng hợp enzym ñể tiến hành thử nghiệm ứng dụng Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Phân lập chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp pectinase cao - Xác ñịnh thành phần môi trường, thông số thích hợp (nhiệt ñộ, pH, thời gian nuôi cấy) ñể nấm mốc sinh tổng hợp pectinase cao môi trường sử dụng - Đánh giá khả xử lý lớp nhớt cà phê enzym pectinase quy mô phòng thí nghiệm ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Các chủng nấm mốc phân lập từ vỏ cam hư ñược thu nhận chợ Hòa Khánh - Liên Chiểu – Đà Nẵng - Nghiên cứu ứng dụng enzym pectinase ñể xử lý lớp nhớt cà phê quy mô phòng thí nghiệm PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phương pháp phân lập nấm mốc - Phương pháp quan sát hình thái vi sinh vật - Phương pháp thu nhận enzym - Phương pháp xác ñịnh hoạt tính enzym pectinase - Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ enzym pectinase - Phương pháp tinh pectinase chủng NM1 - Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 5.1 Ý nghĩa khoa học ñề tài - Xác ñịnh ñược chủng nấm mốc có hoạt tính enzym pectinase cao - Xác ñịnh thành phần môi trường dinh dưỡng, ñiều kiện nuôi cấy thích hợp ñể chủng nấm mốc sinh tổng hợp enzym pectinase có hoạt ñộ cao Footer Page of 126 Header Page of 126 - Thiết lập ñược sở khoa học cho việc ứng dụng enzym thu ñược chế biến cà phê Việt Nam 5.2 Ý nghĩa thực tiễn ñề tài Đặt sở cho việc xây dựng quy trình sản xuất enzym pectinase, góp phần phát triển ngành công nghệ vi sinh nước ta Đồng thời, với việc sản suất ñược enzym pectinase nước giúp chủ ñộng nguồn enzym giảm giá thành sản phẩm Ngoài ra, việc sử dụng chế phẩm enzym trình sản xuất cà phê giai ñoạn tách nhớt cho sản phẩm cà phê thóc nhớt thuận tiện cho phơi sấy, nâng cao chất lượng sản phẩm CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN Ngoài phần mở ñầu, kết luận tài liệu tham khảo, luận văn bao gồm chương sau: + Chương 1: Tổng quan + Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu + Chương 3: Kết thảo luận Footer Page of 126 Header Page of 126 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 ENZYM PECTINASE Pectinase nhóm enzym thủy phân pectin, sản phẩm tạo thành acid galacturonic, galactose, methanol Đây nhóm enzym ñược ứng dụng rộng rãi kỹ thuật ñứng sau amylase protease 1.1.1 Cơ chất enzym pectinase Pectin chất enzym pectinase Pectin phổ biến tự nhiên, ñặc biệt giới thực vật 1.1.2 Phân loại enzym pectinase 1.1.3 Ứng dụng enzym pectinase 1.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC 1.2.1 Hình dạng, kích thước, cấu tạo nấm mốc 1.2.2 Dinh dưỡng tăng trưởng nấm mốc 1.2.3 Sinh sản nấm mốc 1.2.4 Nấm mốc sinh tổng hợp enzym pectinase 1.3 TỔNG QUAN VỀ CHẾ BIẾN CÀ PHÊ 1.3.1 Các chủng loại / giống cà phê 1.3.2 Cấu tạo cà phê 1.3.3 Các phương pháp tách nhớt cà phê 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI VỀ ENZYM PECTINASE 1.4.1 Các công trình nước 1.4.2 Các công trình nước Footer Page of 126 Header Page of 126 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu - Vỏ cam thu mua từ chợ Hòa Khánh – Liên Chiểu – Đà Nẵng ñược sử dụng ñể phân lập chủng nấm mốc sinh tổng hợp pectinase - Quả cà phê Robusta (cà phê vối) ñược thu mua vườn huyện Bảo Lâm, tỉnh Lâm Đồng 2.1.2 Hoá chất 2.1.3 Dụng cụ - Thiết bị 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phân lập nấm mốc phương pháp pha loãng thập phân 2.2.2 Phương pháp giữ giống 2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái vi sinh vật 2.2.4 Phương pháp thu nhận enzym 2.2.5 Phương pháp xác ñịnh hoạt tính enzym pectinase 2.2.6 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid – 3,5- dinitrosalicylic) 2.2.7 Tinh pectinase chủng NM1 sắc ký lọc gel 2.2.8 Định lượng protein phương pháp quang phổ Footer Page of 126 Header Page of 126 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PECTINASE Sau nhiều lần phân lập chủng nấm mốc thu nhận từ vỏ cam hư môi trường thạch Czapek, thu ñược chủng nấm mốc có hình thái khuẩn lạc khác ñược ký hiệu NM1, NM2, NM3 Sau ñó, tiến hành soi nấm mốc kính hiển vi ñể quan sát ñặc ñiểm cấu tạo bào tử sợi nấm chủng nấm mốc ñó Hình thái chủng nấm mốc MN1, NM2, NM3 có ñặc ñiểm: - Chủng NM1: khuẩn lạc tròn, bề mặt lồi, mép khuẩn lạc mịn, không làm thay ñổi màu môi trường Bào tử màu ñen, khối bào tử hình cầu, sợi nấm ăn sâu vào môi trường, có vách ngăn, cuống ñính bào tử không phân nhánh Bào tử ñính tỏa ñều ñầu sợi nấm - Chủng NM2: khuẩn lạc tròn, bề mặt lồi, xốp, mép khuẩn lạc dày, làm ñổi màu môi trường (môi trường có màu vàng) Bào tử màu xanh lục, khối bào tử dạng chổi (chuổi bào tử ñính hướng lên phía trông giống chổi), sợi nấm không ăn sâu vào môi trường, có vách ngăn, cuống ñính bào tử phân nhánh - Chủng NM3: khuẩn lạc tròn, bề mặt lồi, mép khuẩn lạc cưa, không làm thay ñổi màu môi trường Bào tử ban ñầu có màu vàng nhạt sau chuyển thành màu xanh lục Khối bào tử hình cầu, sợi nấm ăn sâu vào môi trường, có vách ngăn, cuống ñính bào tử không phân nhánh Bào tử ñính tỏa ñều ñầu sợi nấm Như vậy, vào ñặc ñiểm hình thái chủng NM1, NM2 NM3 nhận ñịnh chủng A.niger, P.italicum A.flavus Footer Page of 126 Header Page of 126 3.2 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN TRÊN MÔI TRƯỜNG CZAPEK CỦA CÁC CHỦNG NẤM MỐC PHÂN LẬP ĐƯỢC Sự phát triển nấm mốc ñược xác ñịnh trực tiếp ñường kính phát triển khuẩn lạc môi trường Czapek theo thời gian Bảng 3.2: Tổng hợp ñường kính khuẩn lạc trung bình chủng nấm mốc NM1, NM2, NM3 nuôi thời gian khác ĐK khuẩn Chủng lạc (mm) Thời gian nuôi môi trường Czapek (h) 24 36 48 NM1 8,33 13,39 18,72 NM2 1,70 4,28 NM3 9,78 14,05 60 72 96 26,72 32,39 35,50 6,33 8,00 9,67 10,39 20,45 27,33 35,11 37,77 nấm mốc Dựa vào số liệu bảng 3.2 thấy khả phát triển hai chủng nấm mốc NM1 NM3 gần mạnh hẳn so với chủng NM2, kết giống với kết khảo sát tốc ñộ phát triển chủng nấm mốc A.flavus, P.digitatum P.italicum tác giả Đào Thiện cộng [13] 3.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH ENZYM PECTINASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM MỐC PHÂN LẬP ĐƯỢC Để ñánh giá khả sinh enzym pectinase chủng nấm mốc phân lập ñược, tiến hành nuôi môi trường: bán rắn lỏng Khả sinh enzym pectinase ñược ñánh giá gián tiếp qua ñường kính vòng phân giải pectin Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 10 Bảng 3.3: Đường kính trung bình vòng thủy phân pectin chủng nấm mốc NM1, NM2, NM3 môi trường lỏng (mm) Đường kính trung bình vòng thủy phân pectin chủng nấm mốc môi trường lỏng (mm) Chủng NM NM1 14,5 NM2 12,4 NM3 15,2 Bảng 3.4: Đường kính trung bình vòng thủy phân pectin chủng nấm mốc NM1, NM2, NM3 môi trường bán rắn (mm) Đường kính trung bình vòng thủy phân pectin chủng nấm mốc môi trường bán rắn (mm) Chủng NM NM1 25,1 NM2 17,1 NM3 26,7 Kết bảng 3.3 bảng 3.4 cho thấy khả sinh enzym pectinase chủng nấm mốc phân lập ñược môi trường bán rắn cao so với môi trường lỏng Kết hoàn toàn phù hợp với lý thuyết rằng: lượng enzym ñược tạo thành từ môi trường nuôi cấy bề mặt thường cao nhiều so với nuôi cấy chìm [5] Với ba chủng nấm mốc phân lập ñược chủng NM3 có khả sinh tổng hợp pectinase mạnh sau ñó chủng NM1 cuối chủng NM2, ñó hai chủng NM1 NM3 có khả phân giải pectin cao hẳn so với chủng NM2 Kết tương ứng ñối với chủng nấm mốc hai môi trường: lỏng bán rắn Mặc dù chủng NM3 cho hàm lượng pectinase cao theo nhận ñịnh chủng NM3 A.flavus, ñây chủng Footer Page 10 of 126 Header Page 12 of 126 12 vi sinh vật xảy nhanh chóng vòng vài ba phút sau cho chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy [6] Hoạt ñộ pectinase (U/ml) 8,49 3 3,83 3,04 Pectin Bột cà rốt Bột vỏ bưởi Nguồn cung cấp chất cảm ứng Hình 3.13: Hoạt ñộ pectinase canh trường nuôi cấy có bổ sung nguyên liệu cảm ứng khác Trái lại, bột cà rốt bột vỏ bưởi nguồn cung cấp pectin cao có chứa nhiều thành phần khác, lên men nấm mốc sử dụng thành phần dễ hấp thụ trước Mặt khác, pectin dạng liên kết với chất khác cellulose, hemicellulose nên ñể hấp thụ ñược pectin nấm mốc ñòi hỏi phải tiết enzym ñể phân giải liên kết sử dụng ñược Vì vậy, nghiên cứu chọn pectin tinh khiết làm nguồn chất cảm ứng, chủng NM1 ñược nuôi cấy với hàm lượng pectin khác là: 1g, 2g, 3g, 4g, 5g 100g môi trường Footer Page 12 of 126 13 Header Page 13 of 126 Hoạt ñộ pectinase (U/ml) 12 11,05 10 9,18 8,63 1,91 Hàm lượng pectin (g/100g môi trường) Hình 3.14: Hoạt ñộ pectinase canh trường nuôi cấy có chất cảm ứng pectin với hàm lượng khác Từ kết thấy hàm lượng pectin có ảnh hưởng rõ rệt ñến hoạt ñộ pectinase Điều giải thích sau: Khi tăng nồng ñộ chất từ – 3g/100g môi trường chủng NM1 sinh tổng hợp enzym pectinase nhiều ñể thủy phân lượng chất môi trường, ñó hoạt ñộ enzym tăng lên Nhưng tiếp tục tăng nồng ñộ chất lên hoạt ñộ enzym giảm xuống Sự giảm hoạt ñộ enzym nguyên nhân sau: Pectin có tính nhớt làm cho ñộ nhớt môi trường tăng, làm giảm ñộ thông thoáng môi trường gây ảnh hưởng ñến trao ñổi chất, sinh trưởng phát triển vi sinh vật ñó trình sinh tổng hợp giảm Footer Page 13 of 126 14 Header Page 14 of 126 Kết nghiên cứu cho thấy nồng ñộ pectin thích hợp ñể bổ sung vào 100g môi trường nuôi cấy chủng NM1 sinh tổng hợp pectinase 3g 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ ñến khả sinh tổng hợp pectinase Bảng 3.6: Thành phần môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp pectinase với nguồn niơ khác Thành phần Môi trường Môi trường Môi trường Cám 78% 78% 78% Trấu 20% 20% 20% Pectin 3g/100g 3g/100g 3g/100g môi trường môi trường môi trường (NH4)2SO4 2% NH4NO3 2% Pepton 2% môi trường Nguồn nitơ Kết nghiên cứu hình 3.15 cho thấy chủng NM1 có khả sinh tổng hợp pectinase cao sử dụng nguồn nitơ (NH4)2SO4 sau ñó ñến pepton cuối NH4NO3 Điều phù hợp với lý thuyết Trần Xuân Ngạch cho nguồn nitơ từ muối amoni kim loại kiềm hay từ pepton, cazein thủy phân ức chế tạo thành enzym pectinase [7] Đồng thời, theo kết nghiên cứu Vinod Kunar Joshi cộng cho biết hoạt ñộ enzym PE nuôi cấy môi trường rắn sử dụng nguồn nitơ (NH4)2SO4 (6,46 ñơn vị) cao sử dụng pepton (5,40 ñơn vị) [22] Bên cạnh ñó, kết nghiên cứu Z.H Bai cộng sự tổng hợp enzym pectinase môi trường rắn sử dụng nguồn nitơ (NH4)2SO4 cao dùng NH4NO3 pepton [20] Footer Page 14 of 126 Header Page 15 of 126 15 Hoạt ñộ pectinase (U/ml) 11,23 12 10,39 11,05 10 (NH4)2SO4 NH4NO3 Pepton Nguồn cung cấp nitơ Hình 3.15: Hoạt ñộ pectinase canh trường nuôi cấy có bổ sung nguồn nitơ khác Từ kết chọn nguồn cung cấp nitơ cho nghiên cứu (NH4)2SO4 Tiếp theo, tiến hành nuôi cấy chủng NM1 môi trường bảng 3.6 với hàm lượng (NH4)2SO4 khác là: 1%; 1,5%, 2%; 2,5%; 3% Từ kết hình 3.16 thấy rằng, hoạt ñộ pectinase bị ảnh hưởng lớn hàm lượng (NH4)2SO4 Theo nhận ñịnh ñiều do: nồng ñộ chất tăng, tốc ñộ sinh trưởng vi sinh vật tăng lên ñó khả sinh tổng hợp enzym pectinase tăng theo Tuy nhiên, tiếp tục tăng nồng ñộ chất lên hoạt ñộ enzym giảm xuống chất tạo áp lực làm giảm trình sinh tổng hợp enzym Khi tăng nồng ñộ chất vượt giới hạn ñịnh dẫn ñến áp suất thẩm thấu tăng lên, gây khó khăn cho trình hấp thụ chất dinh dưỡng từ bên Điều Footer Page 15 of 126 Header Page 16 of 126 16 hạn chế sinh trưởng phát triển nấm mốc mà khả sinh tổng hợp enzym giảm ñi Hoạt ñộ pectinase (U/ml) 10 11,27 10 8,71 7,05 1,0% 1,5% 2,0% 2,5% Hàm lượng (NH4)2SO4 3,0% Hình 3.16: Hoạt ñộ pectinase canh trường nuôi cấy có nguồn nitơ (NH4)2SO4 với hàm lượng khác 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ñến khả tổng hợp enzym pectinase Môi trường nuôi cấy ñược sử dụng ñể khảo sát ảnh hưởng thời gian sau: cám 78%, trấu 20%, (NH4)2SO4 2%, pectin 3g/100g môi trường Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 17 Hoạt ñộ pectinase (U/ml) 18 16,91 16 14 12 10 8,05 7,51 8,72 7,89 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 Thời gian nuôi cấy (h) Hình 3.17: Hoạt ñộ pectinase nuôi cấy thời gian khác Nhìn vào hình 3.17, ta thấy thay ñổi thời gian hoạt ñộ enzym pectinase thay ñổi theo Điều ñược giải thích bởi: ngày ñầu chất dinh dưỡng môi trường nhiều nên khả sinh tổng hợp pectinase chủng NM1 tăng lên theo thời gian Nhưng sau ngày thứ hoạt ñộ pectinase giảm chất dinh dưỡng môi trường dần cạn kiệt, sản phẩm tiết nhiều nên khả sản xuất pectinase chủng NM1 giảm ñi Như vậy, ñể thu ñược pectinase có hoạt ñộ cao nên kết thúc trình sinh tổng hợp pectinase thời gian 72h Footer Page 17 of 126 18 Header Page 18 of 126 3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến khả tổng hợp enzym pectinase Tiến hành nuôi cấy môi trường ñã ñược xác ñịnh mục 3.4.3 nhiệt ñộ khác nhau: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC thời gian ngày 18 Hoạt ñộ pectinase (U/ml) 16,95 16 14 12 10 10,45 9,21 20 25 30 35 40 Nhiệt ñộ nuôi cấy ( C) Hình 3.18: Hoạt ñộ pectinase nuôi cấy nhiệt ñộ khác Từ kết biểu diễn hình 3.18 cho thấy nhiệt ñộ nuôi cấy ảnh hưởng rõ rệt lên tạo thành enzym pectinase Điều ñược giải thích rằng: giai ñoạn ñầu nhiệt ñộ tăng làm tăng chuyển ñộng cấu tử có môi trường, làm tăng va chạm có hiệu dẫn ñến vận tốc phản ứng xảy nhanh Tuy nhiên, enzym có chất protein ñó tăng nhiệt ñộ tới giới hạn ñó vận tốc phản ứng enzym bị giảm biến tính enzym Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 19 3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng pH ñến khả tổng hợp enzym pectinase Tiến hành nuôi cấy môi trường ñã ñược mô tả mục 3.4.3 với nhiệt ñộ 300C thời gian ngày giá trị pH khác Hoạt ñộ pectinase (U/ml) 18 17,10 16 14 12 11,89 10 7,07 2,5 3,0 3.5 4,0 4,5 5,0 16,83 11,74 5,5 6,0 6,5 pH môi trường nuôi cấy Hình 3.19: Hoạt ñộ pectinase nuôi cấy giá trị pH khác Từ hình 3.19 cho thấy thay ñổi pH hoạt ñộ enzym bị biến ñổi Điều ñược lý giải bởi: pH có ảnh hưởng ñến vận tốc phản ứng enzym thay ñổi pH làm cho hoạt ñộ enzym thay ñổi Ở pH mà ñó trạng thái ion hóa trung tâm hoạt ñộng enzym chất thể cách tốt ñược gọi pH thích hợp Từ kết nghiên cứu cho thấy, pH thích hợp cho hoạt ñộng enzym pectinase chủng NM1 nằm khoảng 5,0 – 5,5 ñạt giá trị cực ñại pH =5,0 Footer Page 19 of 126 20 Header Page 20 of 126 Như vậy, với việc tiến hành khảo sát ảnh hưởng ñiều kiện nuôi cấy ñến khả sinh tổng hợp enzym pectinase, ñã thiết lập ñược ñiều kiện sinh tổng hợp pectinase thích hợp chủng nấm mốc NM1 ñể dịch lên men thu ñược có hoạt ñộ pectinase cao 17,10U/ml ứng với môi trường có thành phần sau: cám 78%, trấu 20%, (NH4)2SO4 2%, pectin 3g/100g môi trường Các thành phần môi trường ñược nuôi cấy nhiệt ñộ 300C pH=5,0 thời gian ngày 3.5 Phân tích chế phẩm enzym qua cột sephadex G-50 Hoạt ñộ pectinase Hàm lượng protein (U/ml) (mg/ml) 20 18 16 14 12 10 17,978 1,212 0,915 7,474 0,543 4,551 1,179 0,151 2 10 11 1213 1415 16 1718 1920 2122 23 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 Hoạt ñộ pectinase Hàm lượng protein Phân ñoạn chạy sắc ký Hình 3.20: Hoạt ñộ pectinase hàm lượng protein ño ñược phân ñoạn chạy sắc ký Từ phân ñoạn ñến phân ñoạn 23, có peak tương ứng ñạt ñỉnh phân ñoạn 9, 13, 22 với hàm lượng protein 0,915mg/ml, 0,543mg/ml, 0,151mg/ml, nhiên peak protein phân giải không rõ ràng Điều cho thấy phân ñoạn có protein số protein có kích thước phân tử Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 21 gần nhau, với hàm lượng thấp so với hàm lượng protein ñỉnh Dựa vào kết phân tích hoạt ñộ pectinase phân ñoạn cho thấy phân ñoạn hoạt ñộ pectinase tăng lên theo chiều tăng protein ñạt ñến giá trị lớn phân ñoạn với hoạt ñộ 17,978U/ml Những phân ñoạn từ ñến 22 hoạt ñộ pectinase biến thiên, có ba ñỉnh với hoạt ñộ tương ứng 7,474U/ml, 4,551U/ml 1,179U/ml Ở phân ñoạn 23, protein hoàn toàn hoạt tính pectinase Nhận xét chung: trình tinh enzym pectinase thông qua cột sắc ký loại bỏ bớt phần không chứa protein chưa tách ñược protein riêng biệt cách rõ ràng peak protein chưa phân chia cách rõ nét 3.6 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG XỬ LÝ LỚP NHỚT QUẢ CÀ PHÊ CỦA DỊCH CHIẾT ENZYM Để thử nghiệm khả phân giải pectin dịch chiết enzym thu ñược, tiến hành nghiên cứu thử nghiệm xử lý dịch chiết nhớt từ hạt cà phê khảo sát thời gian làm nhớt hạt cà phê 3.6.1 Thử nghiệm xử lý nhớt dịch chiết thu ñược từ hạt cà phê Để khảo sát khả phân giải pectin hạt cà phê, bước ñầu thử nghiệm dịch nhớt chiết từ cà phê Hình 3.21 biểu diễn trình giảm ñộ nhớt dịch chiết, ñó ñộ nhớt dịch chiết trước xử lý enzym tương ứng 100% (50,56mm.s-1) Sau 20 phút xử lý enzym ñộ nhớt dịch chiết từ hạt cà phê 2,93 – 5,20% ñó với ñối chứng dịch chiết Footer Page 21 of 126 22 Header Page 22 of 126 nhớt 97,43% Sau 180 phút, ñộ nhớt dịch chiết ñược xử lý với enzym tỷ lệ khác 2,87%, ñộ nhớt mẫu ñối chứng 82,63% Độ nhớt tương ñối (%) 100 100 100% 97,43 90 80 82,63 dịch chiết 30% 70 60 dịch chiết 20% 50 40 dịch chiết 10% 30 5,20 20 10 dịch chiết 50% 2,93 1,58 2,87 1,94 10 15 20 40 60 80 120 150 180 Thời gian xử lý dịch nhớt (phút) dịch chiết Đối chứng dịch chiết Đối chứng nước Hình 3.21: Sự thay ñổi ñộ nhớt dịch chiết thu ñược từ hạt cà phê sau xử lý dịch chiết enzym pectinase theo tỷ lệ khác Dựa vào kết cho nên kết thúc trình xử lý dịch nhớt khoảng thời gian từ 20-40 phút sau khoảng thời gian hiệu xử lý tăng không ñáng kể (sau thời gian xử lý 40 phút ñộ nhớt dịch chiết giảm xuống 2,453,86% ñó với thời gian xử lý 180 phút ñộ nhớt giảm ñi không nhiều 1,94-2,87%) Footer Page 22 of 126 23 Header Page 23 of 126 Từ nhận ñịnh kết luận dịch chiết enzym ñược sản xuất chủng NM1 có hiệu xử lý lớp nhớt cà phê 3.6.2 Khảo sát thời gian xử lý lớp nhớt hạt cà phê Kết thời gian làm nhớt bổ sung dịch chiết enzym theo tỷ lệ khác ñược thể hình 3.22 Thời gian xử lý nhớt (h) 45 45 40 35 30 25 20 15 10 5 5,5 11 15 100% 50% 30% 20% 10% Đối chứng Mẫu Hình 3.22: Thời gian làm nhớt cà phê xử lý dịch chiết enzym pectinase theo tỷ lệ khác Hình 3.22 biểu diễn thời gian làm lớp nhớt cà phê bổ sung dịch chiết enzym pectinase với tỷ lệ khác Khi bổ sung dịch chiết enzym theo tỷ lệ từ 10-100% thời gian làm nhớt hạt cà phê giảm từ 15h xuống 5h, cho chất lượng hạt cà phê tốt so với mẫu ñối chứng bổ sung nước (thời gian lên men kéo dài 45h) cụ thể là: màu sắc cà phê nhân ñẹp lớp nhớt ñược loại bỏ hoàn toàn khỏi vỏ thóc không hội nhiễm Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 24 vào nhân, cà phê nhân mùi khó chịu thời gian lên men ngắn, không xuất hạt lên men Từ kết ñịnh xử lý lớp nhớt với tỷ lệ hạt cà phê ñã bóc vỏ : dịch chiết enzym pha loãng : 1, ñó dịch chiết enzym ñược pha loãng theo nồng ñộ 20-30% (so với dịch enzym ban ñầu) tương ứng với thời gian xử lý giảm từ 11-9h trình sản xuất cà phê nhân phụ thuộc lớn vào ñiều kiện làm khô Vì chọn khoảng thời gian xử lý với trình xát vỏ thực vào buổi tối ủ cà phê với enzym qua ñêm ñể phơi cà phê vào sáng hôm sau Khoảng thời gian không dài cho trình lên men ñồng thời lượng enzym bổ sung vào lên men Ngoài ra, với việc phơi cà phê nhân vào buổi sáng ñể tận dụng ñược nguồn lượng tự nhiên từ mặt trời, cho chất lượng cà phê nhân tốt mà giá thành lại giảm Từ kết luận thay ñổi ñộ nhớt bổ sung dịch enzym pectinase khảo sát thời gian xử lý lớp nhớt cà phê, thấy enzym pectinase ñược sản xuất chủng NM1 có hiệu xử lý lớp nhớt cà phê, có khả làm nhớt thời gian ngắn cho chất lượng cà phê nhân tốt Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ * Kết luận Từ kết nghiên cứu thu ñược rút kết luận sau: Sử dụng phương pháp nuôi cấy môi trường Czapek, ñã phân lập ñược chủng nấm mốc chủng từ vỏ cam hư là: NM1, NM2, NM3 Đã quan sát, mô tả ñặc ñiểm hình thái chủng nấm mốc phân lập ñược: - NM1: khuẩn lạc tròn, bề mặt lồi, mép khuẩn lạc mịn, không làm thay ñổi màu môi trường Bào tử màu ñen, khối bào tử hình cầu, sợi nấm ăn sâu vào môi trường, có vách ngăn, cuống ñính bào tử không phân nhánh - NM2: khuẩn lạc tròn, bề mặt lồi, xốp, mép khuẩn lạc dày, làm ñổi màu môi trường Bào tử màu xanh lục, khối bào tử dạng chổi, sợi nấm không ăn sâu vào môi trường, có vách ngăn, cuống ñính bào tử phân nhánh - NM3: khuẩn lạc tròn, bề mặt lồi, mép khuẩn lạc cưa, không làm thay ñổi màu môi trường Bào tử ban ñầu có màu vàng nhạt sau chuyển thành màu xanh lục Khối bào tử hình cầu, sợi nấm ăn sâu vào môi trường, có vách ngăn, cuống ñính bào tử không phân nhánh Từ ñó, dự ñoán chủng NM1 chủng A.niger, chủng NM2 P.italicum chủng NM3 A.flavus Chọn ñược chủng NM1 dùng cho nghiên cứu khả sinh trưởng, phát triển mạnh khả sinh tổng hợp pectinase cao Trong ñó, ñường kính khuẩn lạc 35,5mm; Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 26 ñường kính thủy phân nuôi cấy môi trường lỏng 14,5mm môi trường bán rắn 25,1mm Bằng việc khảo sát ñiều kiện nuôi cấy, ñã thiết lập ñược ñiều kiện sinh tổng hợp enzym pectinase cao từ chủng nấm mốc NM1 ñể thu ñược dịch chiết enzym có hoạt ñộ cao 17,1U/ml ứng với chất cảm ứng pectin 3g/100g môi trường, nguồn cung cấp nitơ (NH4)2SO4 2%, nhiệt ñộ nuôi cấy 300C, pH=5,0 thời gian ngày Bước ñầu tinh enzym pectinase chủng NM1 qua sắc ký lọc gel sephadex G-50, ñã loại bỏ bớt phần không chứa protein chưa tách ñược protein cách riêng biệt peak protein chưa phân chia cách rõ nét Ứng dụng dịch chiết enzym pectinase vào xử lý lớp nhớt cà phê quy mô phòng thí nghiệm cho kết khả quan: cà phê nhân nhớt, màu sắc ñẹp mùi khó chịu thời gian ngắn nhiều so với phương pháp lên men tự nhiên * Kiến nghị Định danh chủng nấm mốc NM1 Tiến hành tối ưu hóa ñể có ñiều kiện tốt cho sinh tổng hợp pectinase Để tách ñược protein cách riêng biệt, ñỉnh mang hoạt tính cần ñược tinh thêm ñược kiểm tra lại ñiện di gel Nghiên cứu mở rộng quy mô ứng dụng quy trình sản xuất enzym pectinase theo ñiều kiện nuôi cấy ñể thu ñược cà phê nhân có chất lượng tốt mà nhập ngoại enzym từ nước Footer Page 26 of 126 ... pectinase chủ yếu ñược nhập ngoại Xuất phát từ khía cạnh trên, ñã chọn ñề tài Nghiên cứu khả tổng hợp pectinase nấm mốc phân lập từ chất giàu pectin ứng dụng công nghệ thực phẩm nhằm phân lập. .. 1.1.3 Ứng dụng enzym pectinase 1.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC 1.2.1 Hình dạng, kích thước, cấu tạo nấm mốc 1.2.2 Dinh dưỡng tăng trưởng nấm mốc 1.2.3 Sinh sản nấm mốc 1.2.4 Nấm mốc sinh tổng hợp enzym pectinase. .. GIÁ KHẢ NĂNG SINH ENZYM PECTINASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM MỐC PHÂN LẬP ĐƯỢC Để ñánh giá khả sinh enzym pectinase chủng nấm mốc phân lập ñược, tiến hành nuôi môi trường: bán rắn lỏng Khả sinh enzym pectinase