Phương pháp tinh sạch enzyme cellulase bằng phương- 123docz.net

2.1 Chuẩn bị gel

Cân 4.4g gel khô (có thể nhiều hơn một chút để trừ hao phần thất thoát) cho vào dung dịch đệm acetate 50mM, pH5 thể tích bằng gấp đôi thể tích lớp nền gel cần dùng cho một cột.

Sau khi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành, không khuấy, để ổn định trong suốt quá trình hydrate hoá.

Sau khi quá trình hydrate hoá diễn ra hoàn tất, gạn lớp nổi trên bề mặt, chuyển dung dịch trên vào bình hút chân không, khử khí trong dung dịch trong khoảng 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ bình nhưng không được khuấy.

Thêm dung dịch đệm để khử khí với thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền, lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định, gạn hoặc loti lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loti các hạt mịn. Lặp lại qua trình 4 hoặc 5 lần để loại >90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel.

Đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột. Tránh tạo bọt khí khi đổ gel vào và đảm bảo việc nhồi cột đều.

Khi lớp nền trong cột đạt từ 2-5cm, mở khoá đầu racha cột cho đến khi cột nạp đầy gel. Khoá đầu ra của cột và gắn flow adaptor. Mở khoá đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền chảy qua một lúc để diều chỉnh tốc độ dòng chảy.

Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel.

Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor.

2.2 Chuẩn bị mẫu

Mẫu chạy sắc ký phải sạch và hoà tan hoàn toàn trong dung dịch.

2.3 Thu và xác định mẫu tách được

Dịch sau khi chạy ra khỏi cột được cho vào 20 ống nghiệm, mỗi ống (phân đoạn) chứa 4ml. Tốc độ dòng chảy 4ml/6phút trong 1 ống.

Sau khi chạy gel xong ta đem đi đo mật độ quang ở bước sóng 280 nm nhằm xác định ống nào chứa hàm lượng cellulase cao và làm các bước xác định hoạt tính của enzyme cellulase đã được tinh sạch trong các ống.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] PGS TS Nguyễn Tiến Thắng. Giáo trình công nghệ enzyme. ĐH. KTCN TP.HCM, 2010.

[3] PGS TS Nguyễn Tiến Thắng. Tài liệu hướng dẫn thực tập mônCông nghệ enzyme và protein. Viện sinh học nhiệt đới, 2010.

Tài liệu tiếng nước ngoài

[1] R.A. Nieves, C.I. Ehrman, W.S. Adney, R.T. Elander, and M.E. Himmel. Technical Communication: Survey and analysis of commercial cellulase preparations suitable for biomass conversion to ethanol. 1998.

[2] Y.-H. Percival Zhang, Michael E. Himmel, Jonathan R. Mielenz. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. 2006.

Website:

[1] http://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_niger

[2] http://cnx.org/content/m30247/latest/

Phương pháp tinh sạch enzyme cellulase bằng phương pháp sắc kí lọc gel