BÁO CÁO TỐI ƯU HÓA ,ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY, CHỦNG TRICHODERMAHARZIANUM, THU NHẬN ENZYME CELLULASE, THEO PHƯƠNG PHÁP ,QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM
Tài ngun, lượng mơi trường phát triển bền vững TỐI ƯU HĨA ĐIỀU KIỆN NI CẤY CHỦNG TRICHODERMA HARZIANUM THU NHẬN ENZYME CELLULASE THEO PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM Nguyễn Hoàng Anh, Nguyễn Thúy Hương Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Mail: hoanganh3789@gmail.com Đến tòa soạn ngày: Nhận đăng ngày: TĨM TẮT Enzyme cellulase có nhiều ứng dụng quan trọng xử lý môi trường nhằm tạo phân bón hữu vi sinh ứng dụng rộng rãi nông nghiệp Để thu nhận cellulase môi trường lên men bán rắn, Chúng lựa chọn chủng Trichoderma harzianum nguồn sinh tổng hợp enzyme cellulase Trong nghiên cứu này, tiến hành tối ưu điều kiện nuôi cấy theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhằm thu nhận lượng enzyme cellulase cao Trong đó: độ ẩm, pH, tỷ lệ giống, D-glucose, ammonium sulphate xác định yếu tố tác động đáng kể (p0.05 bị loại khỏi phương trình hồi quy Phương trình hồi quy có dạng: Y= 5.2768 - 0.298192 X5 + 0.330013 X1 - 0.439467 X32 + 0.426711 X3 X5 + 0.273125 X3 X4 - 0.478048 X1 X3 - 0.592205 X22- 0.58372 X52- 0.341008 X4 X5 - 0.461741 X42 - 0.591569 X12 Bảng Mức độ ảnh hưởng độ tin cậy yếu tố tối ưu Tên yếu tố Mức độ ảnh hưởng Độ tin cậy Tên yếu tố Mức độ ảnh hưởng Độ tin cậy X3 0.72 0.4204b X2X2 69.44 0.0000a X2 0.14 0.7188b X2X5 0.34 0.5749b X5 17.22 0.0032a X2X4 5.28 0.0506b X4 5.4 0.0486b X1X2 0.86 0.3811b X1 21.1 0.0018a X5X5 67.47 0.0000a X3X3 38.24 0.0003a X4X5 15.02 0.0047a X2X3 2.01 0.1944b X1X5 0.26 0.6207b X3X5 23.51 0.0013a X4X4 42.22 0.0002a X3X4 9.63 0.0146a X1X4 0.49 0.5050b X1X3 29.51 0.0006a X1X1 69.29 0.0000a Hệ số hồi quy (R2) tính 0.972545 Điều thể có 97.2547% số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu tiên đốn theo mơ hình Giá trị R 2> 0.75 thể mơ hình tương thích với thực nghiệm có nghĩa tương quan chặt chẽ yếu tố thí nghiệm hoạt tính sinh Phương trình hồi quy tìm cho thấy yếu tố pH, độ ẩm, tỷ lệ giống, D-glucose ammonium sulphate ảnh hưởng đến khả sinh sinh tổng hợp enzyme cellulase nấm T harzianum Trong đó: pH ban đầu môi trường tỷ lệ thuận với hàm mục tiêu Y theo dạng hàm bậc với số dương tỷ lệ nghịch theo hàm hai với số âm Mức độ ảnh hưởng theo hàm bậc (21.1), hàm bậc hai (69.29) Điều cho thấy pH lựa chọn chưa thích hợp cho tăng trưởng phát triển nấm mốc Dựa vào kết xác định tọa độ điểm tối ưu pH thích hợp 5.25 Lý giải cho điều trình sinh trưởng chúng làm tăng pH môi trường, cộng với tương tác ảnh hưởng lẫn yếu tố làm thay đổi pH môi trường Từ điểu cho thấy khoảng pH thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme chủng T harzianum từ 5.0-5.5 Độ ẩm ban đầu môi trường tỷ lệ nghịch với hàm mục tiêu Y theo dạng hàm bậc hai với số âm Mức độ ảnh hưởng theo hàm bậc hai (69.44) Điều cho thấy độ ẩm có tác động ức chế lại tốc độ tăng trưởng khả sinh tổng hợp enzyme nấm mốc Có thể giải thích sau: nấm Trichoderma vi sinh vật hiếu khí, nên trình tăng trưởng, chúng tiêu thụ oxy phục vụ cho q trình hơ hấp tế bào Q trình hơ hấp tế bào đường phân, chu trình CREP cuối chuỗi vận chuyển electron Trong q trình đó, phân tử cacbonhydrate bị phân giải đến CO2 nước, đồng thời lượng giải phóng dạng ATP nhiệt [11] C6H12O6 + 6O2 -> 6CO2 + 6H2O + lượng (ATP + nhiệt) Do q trình hơ hấp có tạo nhiệt nước, nên quan sát trình tăng trưởng nấm mốc, chúng tơi nhận thấy mơi trường nóng dần lên có nhiều giọt nước bám thành bình Điều làm thay đổi độ ẩm môi trường, cụ thể làm tăng độ ẩm, làm cho độ ẩm không ổn định gây ức chế lại tăng trưởng phát triển nấm mốc Tỷ lệ giống tỷ lệ nghịch với hàm mục tiêu Y theo dạng hàm bậc hai với số âm Mức độ ảnh hưởng theo hàm bậc hai (38.24) Dựa vào kết xác định tọa độ điểm tối ưu tỷ lệ giống thích hợp 0.55%.Từ kết cho thấy, tỷ lệ giống có tác động mạnh đến khả sinh tổng hợp enzyem nấm Mật độ giống dày xảy tình trạng cạnh tranh dinh dưỡng q trình tăng trưởng, hạn chế tăng trưởng khả sinh tổng hợp enzyme nấm mốc Vì vậy, cần điều chỉnh lại tỷ lệ giống cho phù hợp, để đảm bảo tăng trưởng phát triển nấm mốc Hàm lượng carbon (D-glucose) bổ sung vào môi trường tỷ lệ nghịch với hàm mục tiêu Y theo dạng hàm bậc hai với số âm Mức độ ảnh hưởng theo hàm bậc hai (42.22) Dựa vào kết xác định tọa độ điểm tối ưu hàm lượng D-glucose thích hợp 0.44% Điều cho thấy hàm lượng đường D-glucose bổ sung vào mơi trường chưa phù hợp, có tác động ức chế lại sinh tổng hợp enzyme nấm mốc Hàm lượng D-glucose bổ sung vào môi trường chưa đủ cho phát triển sinh tổng hợp enzyme, ảnh hưởng trực tiếp đến trình hình thành sợi nấm phát triển đại phân tử sinh tổng hợp enzyme Hàm lượng nitơ (ammonium sulphate (NH4)2SO4) bổ sung vào môi trường tỷ lệ nghịch với hàm mục tiêu Y theo dạng hàm bậc hai số âm Mức độ ảnh hưởng theo hàm bậc hai (67.47) Dựa vào kết xác định tọa độ điểm tối ưu hàm lượng ammonium sulphate thích hợp 0.9% Điều cho thấy hàm lượng ammonium sulphate bổ sung vào môi trường chưa phù hợp, có tác động ức chế lại sinh tổng hợp enzyme nấm mốc Như giải thích bên tăng hàm lượng chất vượt giới hạn định hoạt tính enzyme giảm ngun nhân: thứ chất nhiều tạo áp lực làm giảm trình sinh tổng hợp enzyme, thứ hai chất tăng lực tiết tối đa khơng đổi làm hoạt tính enzyme giảm Điều làm cho tăng trưởng nấm mốc bị giảm Với ứng dụng Trichoderma nông nghiệp việc tạo chủng có khả sinh tổng hợp enzyme cao, thời gian tăng trưởng ngắn kinh tế vấn đề nghiên cứu rộng rãi.Với kết tiền đề này, tiếp tục nghiên cứu để tìm điều kiện tối ưu hiệu KẾT LUẬN Biểu đồ Mặt đáp ứng hoạt tính theo tỷ lệ giống – độ ẩm Từ yếu tố ban đầu tỷ lệ giống, nhiệt độ, độ ẩm, pH, D-glucose, lactose, pepton, (NH4)2SO4, sàng lọc chọn yếu tố: pH 5.25; độ ẩm 60.68%; tỷ lệ giống 0.55%; D-glucose 0.44% (NH4)2SO4 0.9% Hoạt tính enzyme cellulase cực đại dự đốn theo mơ hình 5.47 UI/g TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Christian P Kubicek and Gary E Harman – Trichoderma and Gliocladium, Taylor & Francis Ltd, 1998, pp 278 [2] Plackett RL Burman JP – The design of optimum multifactorial experiment, Biometrika, 1946, 37, pp 305-325 [3] Trần Thị Thanh Thuần Nguyễn Đức Lượng – Nghiên cứu enzyme cellulase pectinase từ chủng Trichoderma viride Aspergillus niger nhằm xử lý nhanh vỏ cà phê, Sciense & technology development, 12, 13 (2009) 50-56 [4] Laurent P.L Buchon, J.F.G Michel, N.Orange – Production of pectate lyase and cellulase by Chyrseomonas luteola strain MFCL0 depends on the growth temperature and the nature of the culture medium: evidence for two critical temperature, App.And Env Micro, 66 (2000) 1538-1543 [5] Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường – Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, tập – Thí nghiệm hóa sinh học, Đại học Quốc gia Tp.HCM [6] Sibtain Ahmed Syeda Sana Imdad, Amer Jamil – Comparative study for the kinetics of extracellular xylanases from Trichoderma harzianum and Chaetomium thermophilum,Electronic Journal of Biotechnology, 15, (2012) 1-8 [7] Kredics.L,Manczinger L Z Antal, Z Pe´Nzes, A Szekeres, F Kevei and E Nagy – Invitro water activity and pH dependence of mycelial growth and extracellular enzyme activities of Trichoderma strains with biocontrol potential, Journal of Applied Microbiology, 96 (2004) 491–498 [8] Ikram-Ul-Haq Kiran Shahzadi, Uzma Hameed, Muhammad Mohsin Javed and M.A Qadeer – Solid State Fermentation of cellulase by locally isolated Trichoderma harzianum for exploitation of agricultural byproducts, Pakistan Journal of biological sciences, 9, 9(2006) 1779-1782 [9] Kannan Neethu, Rubeena M., S Sajith, S Sreedevi, Prakasan Priji, K N Unni, M K Sarath Josh, V N Jisha, S Pradeep, Sailas Benjamin – A novelstrain of Trichoderma viride shows complete lignocellulolytic activities, Advances in Bioscience and Biotechnology, (2012) 1160-1166 [10] Rubeena M., Kannan Neethu, S Sajith, S Sreedevi, Prakasan Priji, K N Unni, M K Sarath Josh, V N Jisha, S Pradeep, Sailas Benjamin – Lignocellulolytic activities of a novel strain of Trichoderma harzianum,Advances in Bioscience and Biotechnology, (2013) 214221 [11] Bùi Trang Việt – Sinh học tế bào, Đại Học Quốc Gia TpHCM (2005) tr 434