Đang tải... (xem toàn văn)
Hóa chất: − Muối NaCl, HCl sử dụng để kết tủa thu enzyme, nên hóa chất phải tinh khiết, khô, không lẫn tạp chất, nhất là kim lọai nặng vì gây tủa và bất họat enzyme. − Nabenzoate: chất bảo quản. Thiết bị: máy điều nhiệt, máy ly tâm, máy quang phổ kế, máy nghiền đồng hóa, máy đo pH, cân Mettler K7, cân Prolabo. Nguyên liệu: Nguyên liệu thu rennin là ngăn thứ tư dạ dày bê non (dạ múi khế) dưới 5 tháng tuổi. Quy trình: gồm 2 giai đọan: thu nhận dung dịch rennet (có chứa rennin) và thu nhận rennin. − Dung dịch rennet thu nhận có màu hổ phách nhạt đến màu nâu đậm hoặc bột màu trắng đến nâu nhạt, được bảo quản ở nồng độ muối cao 1420% và them chất bảo quản sodium benzoate, propylene glycol. Tinh sạch rennin thô: có thể sử dụng 2 phương pháp • Phương pháp 1: Thẩm tích bằng màng bán thấm( cellophan) • Phương pháp 2: phương pháp sắc kí DEAE sephadex G50 • − Nguyên tắc: • Màng bán thấm (cellophan) có cấu tạo gồm nhiều lỗ nhỏ dung để tách muối và cho chất có phân tử lượng nhỏ qua túi và giữ lại những chất có phân tử lượng lớn theo nguyên tắc khuyếch tán từ nồng độ cao (dung dịch trong cellophane) đến nồng độ thấp (bên ngoài cellophane) cho đến khi đạt cân bằng nồng độ. • − Thực hiện: • Cho rennin thô vào giấy cellophane, đặt vào nước cất lạnh ở nhiệt độ 0 – 4 độ C, khuấy và thay nước cất lạnh (2 ngày đêm) cho đến khi thử âm tính với AgNO3, làm khô nhanh túi bằng sấy quạt gió, nhiệt độ 30 – 40 độ C. Cân trọng lượng túi sau khi sấy khô. Hiệu số trọng lượng túi ban đầu và sau khi thẩm tích là lượng NaCl đã thẩm tích qua màng. • − Nguyên tắc: • Khi cho một dung dịch chứa nhiều chất có phân tử lượng khác nhau chạy qua cột chứa các hạt gel sephadex đã trương nở thì xảy ra quá trình tách những phân tử có kích thước và trọng lượng khác nhau. Những chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lọt vào bên trong lỗ gel do đó sẽ di chuyển chậm qua cột. Các chất có phân tử lượng lớn hơn sẽ dichuyển bên ngoài hạt gel nên sẽ chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột trước. Sau đó, chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lần lượt đi ra theo mức độ phân tử lượng của chúng. Kết quả là tách được các chất có phân tử lượng khác nhau thành các phân đoạn theo trình tự các phân đọan có trọng lượng phân tử lớn ra truớc, các phân đọan có trọng lượng phân tử nhỏ ra sau. • Thực hiện: + Hòa tan tủa trở lại bằng 50ml dung dịch đệm citrate 0.025M, pH 5.1 ta được dung dịch A. Hút 5ml dung dịch A thêm vào dung dịch đệm citrate 0.025M, pH 5.1 (để qua đêm). + Sau đó đem ly tâm 15000 vòngphút trong 50 phút bỏ cặn. Phần dịch thu được cho qua cột DEAE sephadex G50 (từ 15% thể tích cột) và được cân bằng bởi dung dịch đệm citrate 0.025M + Sau đó enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 018%. + Thu mẫu qua cột: Protein được giải phóng theo chiều gradient nồng độ của muối NaCl từ 018% với tốc độ chảy 30mlh.Ta thu được 15 phân đọan và 2 peak A, B. Hiệu suất về họat tính enzyme: pepsin 20% và chymosin 72%. Xác định hoạt tính thủy phân (proteolytic activity) của enzyme bằng cách ủ với hemoglobin trong 10 phút, đo mật độ quang OD ở bước sóng 280nm. Sấy đông khô: _ Nguyên tắc của quá trình sấy đông khô: nước ra khỏi nguyên liệu bằng cách chuyển từ trạng thái đá (rắn) vào trạng thái khí mà không làm hỏng nguyên liệu. _ Quá trình sấy đông khô: gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn 1 – làm lạnh: đây là giai đoạn quan trọng làm lạnh nguyên liệu xuống điểm eutectic (điểm có nhiệt độ thấp nhất mà tại đó pha lỏng và pharắn cùng tồn tại) đảm bảo quá trình thăng hoa xảy ra ở giai đoạn kế tiếp. Giai đoạn 2 – sấy bậc 1: tạo áp suất chân không và hạ nhiệt độ xuống – 40°C để nước trong nguyên liệu thăng hoa ở trạng thái lạnh. Giai đoạn 3 – sấy bậc 2 : giai đoạn này có nhiệt độ cao hơn giai đoạn sấy bậc1 để giúp cho nguyên liệu giữ nguyên các tính chấthóa lý. Giai đoạn này áp suất chân không tiếp tụcthúc đẩy quá trình thăng hoa. _ Tính chất của sản phẩm sấy đông khô: Nếu sấy ở nhiệt độ thường dễ làm enzyme bị hư hỏng,mất đi tính chất ban đầu thì phương pháp này giúp choenzyme giữ nguyên liệu được tính chất hóa lý và có thể bảoquản trong thời gian dài. Sau khi sấy đông khô, enzyme thu được có dạng mảnh, màu trắng hoặc phớt hồng.