THU NHẬN ENZYME PEPSIN từ động vật

Vào năm 1713, Reaumur và Spallanzaai đã chứng minh bằng kết quả thí nghiệm là có “sự tồn tại một nguyên lý tiêu hóa thịt trong dịch vị”. Sau này, Braconnol và đặc biệt Paulo nghiên cứu về cơ chế tiết dịch vị ở dạ dày, nhưng mãi đến 1836, Schwann mới phát hiện ra là chất men phân giải protein của dịch vị. Vào năm 1882, Langley đã thu được pepsinogen, tiền pepsin bằng cách trích dịch vị dạ dày heo với dung dịch kiềm sau đó dùng acid để chuyển pepsinogen thành pepsin. Đến năm 1930, Nothrop đã thu nhận được pepsin dạng tinh thể.

Hình 1: Cấu tạo phân tử Pepsin THU NHẬN ENZYME PEPSIN TỪ ĐỘNG VẬT I. TỔNG QUAN Enzyme từ nguồn động vật và khả năng ứng dụng: Enzyme Nguồn gốc Ứng dụng Trypsin Pepsin Α-chymotripsin Rennet Protease tuyến tụy Tụy tạng động vật Dạ dày động vật Dạ dày động vật Dạ dày bê Tụy tạng động vật Y học, mềm thịt, làm trong beer Trợ tiêu hóa, mềm thịt Y học Sản xuất cheese Trợ tiêu hóa, tẩy, thuộc da, tẩy lông, cải thiện thức ăn Bảng 1: Các loại Enzyme từ động vật 1. Pepsin Vào năm 1713, Reaumur và Spallanzaai đã chứng minh bằng kết quả thí nghiệm là có “sự tồn tại một nguyên lý tiêu hóa thịt trong dịch vị”. Sau này, Braconnol và đặc biệt Paulo nghiên cứu về cơ chế tiết dịch vị ở dạ dày, nhưng mãi đến 1836, Schwann mới phát hiện ra là chất men phân giải protein của dịch vị. Vào năm 1882, Langley đã thu được pepsinogen, tiền pepsin bằng cách trích dịch vị dạ dày heo với dung dịch kiềm sau đó dùng acid để chuyển pepsinogen thành pepsin. Đến năm 1930, Nothrop đã thu nhận được pepsin dạng tinh thể. a. Enzyme pepsin Pepsin là một enzyme quan trọng của tuyến tiêu hóa động vật thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase). Số phân loại E.C.3.4.4.1, pepsin có tên hệ thống là peptide- peptidohydrolase. Enzyme này hoạt động trong dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát và cá. Ở heo thì pepsin tập trung chủ yếu ở phần đáy dạ dày. Cấu tạo: Pepsin là một sợi polypeptid đơn giản có thể cuộn lại thành hình cầu -1- Pepsin là một protein vững chắc bởi các mối liên kết Hydro, hydrophobic, liên kết điện tử và 3 liên kết S-S. Hình 2: Các liên kết trong phân tử Pepsin Pepsin gồm một mạch polypeptid hợp thành bởi 329 amino acid, mà đầu C là alanin và đầu N là isoleucin. Theo Williamson và Dassmamn, nhóm N cuối của pepsin là chuỗi liên kết peptid gồm 6 amino acid như sau: Leu – Gly – Asp – Asp – His – Glu Thứ tự đầu cuối C của pepsin đã được xác định bởi Van Vunatcis và Herriott (1966) và bởi Willamson, thứ tự là: Val – Gly – Ala -2- Trung tâm hoạt động của pepsin gồm 1 hoặc 2 nhóm carboxyl của acid glutamic, một nhân thơm (phenol) của Tyrosin. Hình 3: Trung tâm hoạt động của pepsin Thành phần hóa học: hàm lượng N chiếm 14.7% Thành phần amino acid: Tên amino acid Số gam a.a/100g pepsin Số gốc a.a trong 1 pt pepsin Tên amino acid Số gam a.a/100g pepsin Số gốc a.a trong 1 pt pepsin Cystin Cystein Mehtionin Arginin Histtidin Lysin Acid aspatic Acid glutamic Serin Threonin 1.64 0.50 0.70 1.00 0.90 0.90 16.00 11.90 12.20 9.60 4 2 4 2 2 2 41 28 40 28 Glycin Valin Leucin Prolin Phenylalanin Isoleucin Tyrosin Tryptophan Amide N 6.40 7.10 10.40 5.00 6.40 10.80 8.50 2.40 1.32 20 21 27 15 13 28 16 4 32 Bảng 2: Thành phần Amino acid trong phân tử pepsin Pepsin chứa nhiều nhóm amino acid có các đặc điểm: -3- - Có tính acid → pepsin thể hiện tính acid mạnh. - Kỵ nước - Mạch nhánh không phân cực → pepsin dễ tan trong rượu etylic nồng độ cao và trong các hỗn hợp chứa nhiều dung môi phân cực. Do đặc điểm về thành phần amino acid, pepsin tinh khiết mang điện tích (-) ngay cả trong môi trường HCl 0.1N Phân loại: dựa theo nguồn gốc hình thành (từ màng nhầy hay các phần khác của dạ dày) chia thành 4 loại pepsin A, B, C và D với các pepsinogen (tiền pepsin) tương ứng Pepsin được tách từ các nguồn động vật khác nhau (heo, bò) và các pepsin khác nhau được tách từ cùng một nguồn (A, B, C, D) thì có đôi chút khác nhau về thành phần hóa học. Trọng lượng phân tử: 34500 Dalton, pepsin của heo lớn hơn một chút khoảng 35000 Dalton. Loại TLPT (Dalton) Amino acid ở đầu N Pepsinogen A Pepsin A Pepsinogen B Pepsin B Pepsinogen C Pepsin C Pepsinogen D Pepsin D 40 400 ± 1600 32 700 ± 1200 39 000 38 600 41 400 36 000 41 000 35 000 Leu Ile Met, His Ala Ser Ser và Leu hoặc Ile Leu Ile Bảng 3: Khối lượng phân tử của các loại pepsinogen và pepsin Đặc tính: Chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi chua, nếu thêm lactose, glucose hay saccarose thì có vị ngọt (Dược điển Việt Nam). Pepsin dễ hút ẩm, tan trong nước cho một dung dịch đục lờ, không tan trong cồn 95 o , ester, chloroform. Pepsin ở cả 2 dạng: kết tinh và thô. Pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin, gelatinase, cathepsin và Brucke pepsin. Pepsin heo thô chứa một pepsin chính A, pepsin phụ B, C, D và gastricsin (E.C.3.4.4.22) Pepsin xúc tác sự thủy giải protein, tạo các polypeptide, proteose, pepton và vết amino acid. Pepsin chủ yếu thủy phân liên kết peptid trong đó có sự tham gia của amino -4- 1 10 20 30 : : acid mạch vòng và liên kết Ala-Ser, Ala-Ala,… Pepsin không cắt ở liên kết chứa Valin, Alanin, và Glycin. Pepsin phân cắt một cách dễ dàng các protein tan trong nước như albumin, hemoglobin, mystin, globulin, caxin… còn những protein không tan hay các nucleprotein, protein hình sợi như keratin, neucin, glagen, gluten, các nucleoprotein… pepsin khó hoặc không phân cắt được. Pepsin bị ức chế bởi cơ chất dạng epoxides. Điểm đẳng điện của pepsin ở gần pH = 1 do sự có mặt của gốc phosphoric acid trong phân tử enzyme, khi loại bỏ gốc này pH đẳng điện của pepsin là 1.7 Pepsin thủy phân protein trong vùng acid khá rộng từ 1 – 4. pH hoạt động tối ưu của pepsin thay đổi tùy theo trạng thái và bản chất của cơ chất, thường trong khoảng 1.8- 2.2 . VD: Với cơ chất là protein biến tính, pH tối ưu của hoạt tính xúc tác của pepsin hơi chuyển về vùng có pH kiềm so với protein nguyên thể (do sự biến tính của protein đã làm thay đổi tính chất của liên kết thủy phân). Pepsin bền nhất trong khoảng pH từ 4 – 5, nhưng trong vùng pH này hoạt lực của enzyme có phần thay đổi giảm đi, từ pH = 5.5 trở lên, pepsin không hoạt động. Khả năng hòa tan pepsin phụ thuộc vào độ tinh khiết. Tính đặc hiệu của pepsin phụ thuộc vào loại pepsin. Pepsin A và D tính đặc hiệu xảy ra trong phạm vi rộng hơn pepsin B và C. Pepsin A, D thủy phân lên cả hai cơ chất Hb và APD ( acetyl-L-phenylalanyl-L-diiodtyrosine) còn pepsin B chỉ có hoạt động lên APD, pepsin C chỉ hoạt động lên cơ chất Hb. Đặc tính thủy phân chuyên biệt đối với chuỗi Insulin B: Chuỗi insulin B oxy hóa được thủy giải bằng pepsin A-1 và A-3. Hai vị trí nhạy cảm nhất để thủy giải là nối: Ala14-Leu15 và Leu15-Tyr16. Tỷ số của mức độ phân cắt nối Ala14-Leu15 và Leu15- Tyr16 khác nhau ở pepsin các loài. Vị trí phân cắt thứ 2 là Leu11-Val12 và Phe25-Tyr26. Quá trình ủ lâu với pepsin có thể cắt những nối khác như Tyr16-Leu17 và Phe24-Phe25. -5- FNNEHLCaGSHL VEA L Y LVCaGERGF F YTPKA R1 – CO – NH – R2 + R3 – COOH → R3 – CO – NH – R2 + R1 – COOH Gốc R2 là: – CH – CH2 – C6H4 – OH COOH Cũng như nhiều protease khác, ngoài việc phân cắt được liên kết peptid, pepsin có khả năng phân cắt cả liên kết ester hay những hợp chất ester sulfite có nhân thơm và có thể làm đông tụ sữa. Ngoài ra pepsin còn gây ra sự phân giải protein ở một số enzyme như trypsin, pepsin, amilase… Ngoài khả năng thủy phân các protein tự nhiên, pepsin còn thủy phân nhiều cơ chất tổng hợp. Trong đó có các liên kết peptide chứa p-nitrophenylalanin, 3,5- dibromotyrosine hay 3,5-dinitrotyrosine và diiodtyrosine đều bị thủy phân và chúng được dùng trong nghiên cứu động học phản ứng của pepsin. Pepsin không tác dụng lên nucleoprotein, hoặc các protein không tan như: keratin, neucin… Một số trường hợp đặc biệt trong thủy phân protein của pepsin phải kể đến như sau: - Chất tạo keo tự nhiên collagen natif chịu sự thủy phân của pepsin, trong khi đó chất tạo keo tinh sạch lại tỏ ra kháng pepsin - Các peptide có phân tử lượng nhỏ đặc biệt có thể kháng enzyme. - Một vài protein khác dễ bị tấn công khi ở dạng tự nhiên hơn là khi đã qua một lần bị biến tính, trường hợp của ovalbumin là một ví dụ điển hình. Sự chuyển peptide do pepsin xúc tác Với sự có mặt của các chất nhận chứa 1 carboxyl tự do, pepsin có thể thực hiện sự chuyển đổi gốc tyrosin, phản ứng này tiến hành dựa trên sự chuyển amino của phần amine của chất cho là tyrosin sang chất nhận. Sơ đồ phản ứng sau: Quá trình dự trữ pepsin: - Pepsinogen ổn định 12 – 18 tháng ở 2 – 8 o C - Pepsin ổn định 1 – 2 năm ở 2 – 8 o C - Dự trữ ở 2 – 8 o C. -6- Chế phẩm pepsin thô có thể giữ hoạt tính được trong nhiều năm ở nhiệt độ 0 - 4 o C. Pepsin dạng dung dịch không bền ở pH = 6. Pepsin ở trạng thái khô khá bền, ngay cả trong điều kiện môi trường nhiệt độ thường, dung dịch pepsin kém bền nhất là khi ở pH quá thấp. Khi đó, ta thấy xảy ra hiện tượng tự tiêu (tự phân giải của enzyme) kèm theo sự tạo thành các phân tử nhỏ (vì pepsin hoạt động mạnh trong môi trường khá acid). Sự tự tiêu: Pepsin vừa là protein vừa là enzyme phân giải protein nên có khả năng phân hủy chính nó. Sự tự tiêu được coi là nguyên nhân của tính không đồng nhất khi điện di của nhiều loại chế phẩm enzym pepsin. Theo Ingram, trong quá trình pepsin tự tiêu hóa ở nhiệt độ 45 o C , pH=4 trong 24h, có 45% tyrosin của phân tử enzyme được giải phóng và kết tinh, ngoài ra còn xuất hiện các peptide có phân tử lượng nhỏ từ 1000 – 2000. Theo Perlmann, sự tự tiêu hóa của pepsin tạo ra những sản phẩm có thể thẩm tích và có hoạt động phân giải protein, tuy nhiên sẽ chỉ còn được 64% hoạt tính gốc, hoạt tính này được thực hiện trên hemoglobin. Nói chung, sự tự tiêu của pepsin thường xảy ra trong trường hợp pepsin ở dạng dung dịch, pH thấp, nhiệt độ thích hợp, tạo ra nhiều thành phần có phân tử lượng nhỏ hơn pepsin, giảm lượng tyrosin và chỉ thành phần nào có đặc tính của pepsin gốc thì mới hoạt động. b. Tiền enzyme Pepsinogen Ở phần màng nhầy dạ dày của động vật, có các tế bào chứa zymogen hay pepsinogen. Pepsinogen là một protein được cấu tạo từ 400 gốc amino acid và ở dạng mạch polypeptide đơn, pepsinogen chứa nhiều lysin hơn pepsin. Northrop và Herriot đã thu được pepsinogen dạng tinh thể hình kim và xác định pepsinogen không những có trong dịch vị mà còn hiện diện trong máu, nước tiểu, tinh dịch. Lượng pepsinogen trong máu tăng giảm theo một tỷ lệ nhất định với lượng pepsinogen trong dịch vị. Trọng lượng phân tử pepsinogen heo khoảng 42000 còn pepsin heo khoảng 35000Da. Theo Oke Khovitch thì trọng lượng phân tử pepsinogen = 42240Da; trọng lượng phân tử của pepsin = 39930Da. Khối lượng phân tử của pepsinogen A-1/2/3 và C-1/2 được xác định tương ứng là -7- 41, 40, 40, 39 và 39 kDa xác định bằng phương pháp SDS-PAGE. Pepsinogen có 3 loại A và 2 loại C gọi là pepsinogen A-1, A-2, A-3, C-1, C-2, được kết tinh từ dạ múi khế dê trưởng thành. Mức độ liên quan của chúng trong dạ múi khế của dạ dày tương ứng là 27,19, 14, 25 và 15%. Thành phần amino acid hoàn toàn giống nhau giữa các isozymogen của các loại tương ứng nhưng khác nhau giữa 2 loại đặc biệt ở Glx/Asx và Leu/Ile. Sự khác nhau này được đặc trưng cho các loại pepsinogen từ các nguồn gốc động vật khác nhau. Ở pH = 4.7 không có hoạt động đông tụ, ở giá trị pH<6 pepsinogen có tính acid kém hơn pepsin. Pepsinpgen ổn định được trong môi trường trung tính và kiềm yếu pH=7-9, nhưng sẽ bị phá hủy nếu pH>9 và bị hủy nếu ngâm trong dung dịch ethanol 50% trong 24h, pepsinogen chỉ ổn định trong một thời gian ngắn với pH môi trường <6. Pepsinogen bền trong dung dịch có pH thấp hơn 8.5. Trong vùng pH = 8.5 – 10.5 khi giữ trong một thời gian ngắn, sự biến tính kiềm của pepsinogen thuận nghịch, nhưng giữ lâu trong môi trường kiềm thị biến tính không thuận nghịch. Về cơ chế, sự biến tính kiềm của pepsinogen là sự phá vỡ một số liên kết hydro trong phân tử protein – enzyme. Trong hỗn hợp nước – dung môi hữu cơ, phân tử pepsin và pepsinogen mất khả năng hoạt hóa thành pepsin hoạt động c. Sự hoạt hóa pepsinogen thành pepsin Sự hoạt động của các enzyme thủy phân theo một trong hai con đường chủ yếu: - Tự hoạt hóa (pepsin và trypsin…) - Cần một hoặc vài loại ion kim loại chuyên biệt để hoạt hóa. Pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin tức là pepsinogen bất hoạt. Khi tiếp xúc với môi trường acid tự nhiên của dạ dày hoặc chính pepsin, pepsinogen sẽ được hoạt hóa thành pepsin. Quá trình hoạt hóa pepsinogen là quá trình thủy phân liên kết peptid giữa acid glutamic 41 và isoleucin 42, giải phóng peptid kìm hãm, thành phần amino acid của peptide kìm hãm này tương ứng với 41 amino acid của pepsinogen và phản ứng được xúc tác bởi chính ion H + và cũng chính bởi pepsin. Phần môn vị của dạ dày gồm những tế bào đỉnh vách có thể tiết ra acid HCl, dẫn đến sự tiết pepsinogen và tự hoạt hóa thành pepsin trong dạ dày. Quá trình này xảy ra ở pH<6. Khi trong môi trường có pH cao hơn, có thể xảy ra sự tái kết hợp ngược lại. Từ môi trường trung tính chuyển sang môi trường acid, đầu tiên pepsinogen sẽ chuyển thành pepsin ở pH = 5.1; 40 o C. Ở pH = 4.1, mức độ chuyển hóa tăng gấp 10 lần. -8- Pepsin 4 pepde Chất ức chế Pepsin + chất ức chế Phức hợp pepsin-chất ức chế pH = 5.4 Pepsin-chất ức chế + 5 pepde Pepsinogen phức hợp pH = 5.4 Pepsin được tạo thành lại tiếp tục quá trình giải phóng peptid kìm hãm, chuyển pepsinogen thành pepsin hoạt động. Vì vậy quá trình này mang tính chất của một quá trình tự xúc tác. Sự hoạt hóa pepsinogen chỉ xảy ra trong môi trường acid có pH<5.6. Khi pH>5.6 peptide kìm hãm lại có thể kết hợp thuận nghịch với pepsin tạo thành phức hợp không hoạt động. Việc hoạt hóa pepsinogen bao gồm sự loại bỏ khoảng 1% phân tử, như vậy phần được loại bỏ đi là phải có tính kiềm trội hơn hẳn phần còn lại. Quá trình động học của sự hoạt hóa này đã được nghiên cứu, bắt đầu bằng sự acid hóa hoặc bằng cách cộng thêm pepsin vào môi trường. Ở pH = 5.4 quá trình này xảy ra theo cơ chế tự xúc tác. Kết quả trọng lượng phân tử giảm 20%. Toàn bộ quá trình tạo thành pepsin từ pepsinogen (heo) có thể biểu diễn như sau: Trong quá trình hoạt hóa pepsinogen, bằng phương pháp chuẩn độ, người ta đã chỉ ra rằng, một liên kết pepsin được tạo thành kèm theo với sự bẻ gãy 9 liên kết peptide. Sáu peptide đã được sản sinh ra trong quá trình hoạt hóa gồm 5 peptide nhỏ và 1 peptide lớn: -9- - Peptide lớn nhất là một chất ức chế pepsin (trọng lượng phân tử 5000) ; ở pH=5.4 chất ức chế này vẫn kết hợp với phân tử pepsin; do đó với những điều kiện như vậy, quá trình này không thể thực hiện cơ chế tự xúc tác. Ở những pH thấp hơn, chất ức chế có thể phân ly thuận nghịch ra khỏi phân tử enzyme. Dưới tác dụng của pepsin, chất ức chế (inhibitor) được thủy phân thành 4 peptide nhỏ ở pH khoảng từ 5, mức độ phân hủy cao ở pH gần bằng 4. - Cùng với chất ức chế này, quá trình hoạt hóa còn giải phóng ra 5 peptide nhỏ khác như đã nói trên. Đây là những peptide trung tính, trung bình có khoảng 10 gốc amino acid; trọng lượng phân tử trung bình của cả 5 peptide vào khoảng 4000. Như vậy, cùng với sự thủy phân chất ức chế, toàn bộ quá trình hoạt hóa đã được thực hiện với việc bẻ gãy 9 liên kết peptide. Hình : Sự hoạt hóa pepsinogen thành pepsin d. Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của pepsin Ảnh hưởng của pH: pepsin là 1 protease acid điển hình, hoạt động ở vùng pH acid từ 1 – 4, pH thích hợp của pepsin khoảng 1.5 – 2.4. Đối với mỗi cơ chất thì pH thích hợp có thể thay đổi. Cơ chất là hemoglobin thì pH tối ưu là 2.2 -10- [...]... dinh dưỡng cao c Enzyme pepsin trong dạ dày heo Pepsin hình thành từ màng nhầy của dạ dày, phân bố trên các phần khác nhau của dạ dày ở dạng tiền pepsin (pepsinogen) nhưng tập trung chủ yếu ở phần đáy mỏng của dạ dày(75%) -14- II 1 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME PEPSIN Nguyên liệu thu nhận pepsin Màng nhầy dạ dày heo Hình: dạ dày heo 2 Các phương pháp thu nhận a Thu nhận dung dịch pepsin pepsin Bản chất... chúng hoạt động là khác nhau Ví dụ: pepsin A và C tách chiết từ dạ dày bê có hoạt tính thủy phân Hb cao nhất ở pH=2-3, pepsin A-2/3 vẫn duy trì hoạt tính ở vùng có pH>3 nhưng pepsin A-1 thì không Tương tự pepsin, pepsinogen khác nhau chịu ảnh hưởng của pH môi trường khác nhau Pepsin dê A và C hoạt động ở pH thấp tương tự những enzyme từ nguồn động vật khác pH thích hợp khoảng 2 đối với pepsin A và... với pepsin C Những hoạt tính của pepsin A chỉ bằng một nửa pepsin C pH phụ thu c hoạt tính pepsin A-2 và A-3 hoàn toàn giống nhau nhưng khác với pepsin A-1 Hoạt tính của pepsin A-2 và A-3 lớn hơn A-1, đặc biệt khoảng pH 3-4 Hoạt tính cao nhất của pepsin A heo tương tự như pepsin C của dê và cao gấp 2 lần pepsin A dê Ảnh hưởng của nhiệt độ: đa số enzyme hoạt động tốt ở nhiệt độ 30-40oC, một số enzyme. .. đưa pH về vùng thích hợp với nó Pepsin có điểm đẳng điện pI từ 1 – 1.4 Pepsin của heo có điểm đẳng điện pI là 1 Ảnh hưởng pH lên các loại pepsin khác nhau, như pepsin B bền ở pH=6.9 và 25 0C và cũng điều kiện này pepsin C sẽ bền hơn pepsin A còn ở pH=8.5 pepsin C bị vô hoạt nhanh chóng, pepsin D thì không bền ở pH>6 Đối với pepsin có nguồn gốc khác nhau hay các loại pepsin (A, B,C, D) có cùng nguồn... enzyme chịu nhiệt có thể hoạt động ở nhiệt độ cao hơn tới 70oC, khi nhiệt độ lên tới 90oC thì hầu như tất cả các enzyme đều ngưng hoạt động Pepsin là một enzyme hoạt động ở nhiệt độ khá cao Nhiệt độ thích hợp tối ưu khoảng từ 40-50oC Ở 70oC, pepsin mất khả năng tiêu đạm Tốc độ xúc tác phản ứng thủy phân của pepsin không cao bằng các protease khác, nhưng độ bền nhiệt của pepsin cao hơn, nhất là khi cơ... là albumin thì pH tối ưu là 1.5 Pepsin bền vững ở vùng pH rất acid, nó có độ bền tối đa ở pH=4 – 5 nhưng trong vùng pH này hoạt lực của enzyme rất thấp từ pH>5.5 pepsin không hoạt động vì có sự biến tính của protein enzyme mà cụ thể là phá vỡ một số liên kết hydro trong phân tử làm cho cấu trúc của enzyme bị biến đổi Ở pH quá thấp thì pepsin xảy ra hiện tượng tự phân Pepsin đã bị vô hoạt trong môi trường... tủa Cho hình thành chất kết tủa phosphattricalci từ niêm mạc dạ dày heo (ngâm nước) có mặt H3PO4 Sau đó chất kết tủa được hòa tan bằng HCl và dung dịch thu được mang đi thẩm tích (dialyz) Dung dịch pepsin thô thu được sau khi xử lý bằng ester sẽ thu lại chất cặn có thành phần cấu tạo là pepsin sơ lọc (phương pháp Bruches) b Các phương pháp thu pepsin thô từ dịch chiết •Phương pháp tủa  Phương pháp tủa... lạnh 40C và cô đặc dưới áp suất thấp, enzyme bị tủa bởi alcohol và đựơc tách ra Sau khi pepsin bị tủa bằng alcohol, đem lọc và làm khô Các phương pháp chiết tách trên đều cho phép thu chế phẩm pepsin chưa tinh -17- khiết, có lẫn protein lạ và các protease khác Pepsin này hoàn toàn có thể sử dụng điều trị trong y học hay trong công nghiệp Quy trình thu nhận enzyme từ dạ dày heo ( Payeba và cộng sự) -18-... protein (mg/mL) ∆OD: hiệu suất mật độ quang của mẫu enzyme đo được ở λ = 605 nm (A) -24- F: độ pha loãng mẫu enzyme Vpu: thể tích mẫu enzyme đem xác định hàm lượng protein Vmau: thể tích mẫu đich enzyme (mL) mmau: khối lượng enzyme pha ra dạng dịch (mg) menzyme: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g) Pt: hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme (mg protein) 3 Xác định hoạt tính protease theo... nhận a Thu nhận dung dịch pepsin pepsin Bản chất của quá trình chiết tách pepsin từ màng nhầy dạ dày là sự phối hợp của ba quá trình: phá vỡ tế bào, hoạt hóa và chiết tách enzyme - Sản xuất pepsin hiện nay có hai phương pháp là phương pháp chiết và tự phân, đều dựa trên nguyên tắc: pepsin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày của động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid loãng (theo Konne và Muraviep, . Hình 1: Cấu tạo phân tử Pepsin THU NHẬN ENZYME PEPSIN TỪ ĐỘNG VẬT I. TỔNG QUAN Enzyme từ nguồn động vật và khả năng ứng dụng: Enzyme Nguồn gốc Ứng dụng Trypsin Pepsin Α-chymotripsin Rennet Protease. dày(75%). -14- II. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME PEPSIN 1. Nguyên liệu thu nhận pepsin Màng nhầy dạ dày heo. Hình: dạ dày heo 2. Các phương pháp thu nhận pepsin a. Thu nhận dung dịch pepsin Bản chất của quá. của enzyme có phần thay đổi giảm đi, từ pH = 5.5 trở lên, pepsin không hoạt động. Khả năng hòa tan pepsin phụ thu c vào độ tinh khiết. Tính đặc hiệu của pepsin phụ thu c vào loại pepsin. Pepsin