Đề tài “Tổng quan một số mô hình nghiên cứu tác dụng cầm máu của thuốc trên động vật thực nghiệm” đã tiến hành tìm kiếm và tổng hợp các nghiên cứu đã được thực hiện trên thế giới. Tuy nhiên, đề tài mới chỉ dừng lại ở các định hướng về cơ chế tác dụng của thuốc mà chưa tổng hợp được các mô hình in vitro nghiên cứu mức phân tử để có thể kết luận về cơ chế tác dụng của thuốc, chưa tổng hợp được các mô hình gây rối loạn tiêu fibrin – giai đoạn cuối của quá trình cầm máu.
4.2. Bƣớc đầu lựa chọn mô hình nghiên cứu tác dụng cầm máu của một thuốc
Qua quá trình thu thập tài liệu và hệ thống hóa các mô hình của các tác giả trong nước cũng như trên thế giới, chúng tôi bước đầu xin đề xuất một số ý kiến về sự lựa chọn mô hình nghiên cứu phù hợp với điều kiện thực tế của Việt Nam như sau:
Bƣớc 1: Để xác định xem một thuốc có tác dụng cầm máu hay không thì trước hết
nên tiến hành đánh giá tác dụng của thuốc nghiên cứu trên một trong mô hình gây chảy máu bằng cắt đuôi hoặc chân.
Tiếp theo, đánh giá khả năng cầm máu của thuốc trên các mô hình có các mức độ chảy máu khác nhau: mô hình gây tổn thương da và niêm mạc (với mức độ chảy máu ít hơn), và các mô hình gây tổn thương tạng, não, các mạch máu (mức độ chảy máu nhiều hơn).
Những động vật này mang nhiều đặc điểm chảy máu như cơ thể người người. Được áp dụng nhiều trên thế giới. Việt Nam cũng nên áp dụng mô hình này trong những nghiên cứu về thuốc có tác dụng cầm máu.
Bƣớc 2: Với những thuốc đã có xu hướng trên tác dụng cầm máu (rút ngắn thời
gian chảy máu, và làm giảm lượng máu chảy), trên mô hình cắt đuôi/ chi của động vật thì có thể đi sâu nghiên cứu theo định hướng cơ chế tác dụng của thuốc:
Để xác định thuốc có cơ chế tác dụng lên thành mạch hay không: bước đầu cần thử tác dụng của gây co mạch của thuốc, hoặc gây tăng tính thấm thành mạch rồi thử tác dụng của thuốc. Thuốc nếu làm co mạch hoặc giảm tính thấm thành mạch có thể đi sâu vào nghiên cứu hơn trên mức độ phân tử để xác định cơ chế: các chất co mạch do tế bào nội mạc giải phóng (angiotensin II, các peptid co mạch, ...).
Để xác định một thuốc có tác dụng vào yếu tố tiểu cầu hay không: tiến hành kiểm tra tác động của thuốc lên động vật đã bị làm giảm số lượng tiểu cầu hoặc làm giảm các chức năng của tiểu cầu. Nếu sau khi dùng thuốc trên động vật gây giảm tiểu cầu có số lượng tiểu cầu tăng, cần đi sâu vào nghiên cứu ở mức độ phân tử về các quá trình sinh/ hủy tiểu cầu ở tủy xương, lá lách. Nếu sau khi dùng thuốc trên động vật gây giảm chức năng tiểu cầu có sự tăng của một trong ba chức năng: kết dính, kết tập, lưu giữ và giải phóng các hạt thì đi sâu vào nghiên cứu mức phân tử của các chức năng:
+ Kết dính: trên các phân tử như von-Willebrand, các GPIIb/IIIa... + Kết tập: trên các phân tử ADP, thromboxan A2.
Để xác định một thuốc có tác dụng vào các yếu tố đông máu hay không: bằng việc sử dụng các mô hình gây giảm các yếu tố đông máu, kiểm tra các giá trị PT, TT, aPTT và nồng độ yếu tố đông máu đã bị gây giảm trong mô hình. Trong đó:
+ PT: thời gian prothrombin, đánh giá đông máu theo con đường ngoại sinh (bao gồm các yếu tố I, II, III, V, VII, X).
+ TT: thời gian thrombin, đánh giá giai đoạn cuối của quá trình đông máu, chuyển fibrinogen thành fibrin.
+ aPTT: thời gian thrombin, đánh giá đông máu theo con đường nội sinh (bao gồm các yếu tố I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII).
Nếu sử dụng thuốc trên các con vật đã được gây rối loạn các yếu tố đông máu làm thay đổi các giá trị trên, thì có thể có những nhận định ban đầu về tác động của thuốc lên các giai đoạn trong quá trình đông máu và khu trú các yếu tố mà thuốc tác động. Sau đó, cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế của thuốc làm tăng yếu tố đông máu.
Trong tất cả các mô hình này, sử dụng các động vật di truyền có thiếu hụt sẵn chức năng tiểu cầu, các yếu tố đông máu là một lựa chọn phù hợp để nghiên cứu tác dụng của thuốc lên các bệnh di truyền ít gặp.
Các hướng lựa chọn mô hình nghiên cứu được mô tả trong sơ đồ dưới. Đây chỉ mới là nhận định chủ quan của tác giả sau quá trình tìm kiếm, thu thập và tổng quan tài liệu, người nghiên cứu nên lựa chọn và định hướng cho phù hợp với mục tiêu và điều kiện nghiên cứu của mình.
Hình 4.1. Sơ đồ các hướng lựa chọn mô hình nghiên cứu. Thuốc nghiên cứu
Mô hình cắt đuôi/ chi
Sàng lọc tác dụng của thuốc
Thời gian chảy máu giảm Khối lượng máu chảy giảm
Đánh giá khả năng cầm máu của thuốc
trong các mô hình gây chảy máu các mức độ khác nhau
Nghiên cứu định hướng cơ chế tác dụng của thuốc lên các yếu tố trong quá trình cầm máu
Tác dụng lên các yếu tố đông máu -Mô hình gây tổn thương tạng -Mô hình gây tổn thương não -Mô hình gây tổn thương mạch máu -Mô hình gây tổn thương da và niêm mạc Tác dụng lên thành mạch Tác dụng lên tiểu cầu -Mô hình nghiên cứu tác dụng co mạch -Mô hình gây tăng tính thấm thành mạch -Mô hình giảm số lượng tiểu cầu -Mô hình gây giảm chất lượng tiểu cầu -Mô hình dùng heparin -Mô hình gây thiếu viamin K -Mô hình gây bệnh gan -Mô hình gây hemophilia
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1. Kết luận
Qua thu thập số liệu và hệ thống hóa các mô hình nghiên cứu tác dụng cầm máu của thuốc trên thực nghiệm chúng tôi đã thu thập được các kết quả như sau: Đã tổng quan được về quá trình cầm máu và các rối loạn cầm máu.
Đã thu thập được 19 mô hình thực nghiệm và hệ thống hóa thành 4 nhóm: Mô hình gây chảy máu bằng tổn thương bao gồm 5 mô hình hệ thống hóa thành 5 nhóm là:
+ Gây chảy máu bằng gây tổn thương tạng (gây tổn thương gan, gây tổn thương lách, gây tổn thương thận).
+ Gây chấn thương não (mô hình tạo tổn thương gây xuất huyết não, mô hình gây xuất huyết não bằng collagenase).
+ Gây tổn thương trên các mạch máu (mô hình gây tổn thương tĩnh mạch chủ dưới thỏ, mô hình gây tổn thương tĩnh mạch cảnh thỏ, mô hình gây tổn thương động mạch chủ bụng chuột, mô hình gây tổn thương động mạch đùi chuột, mô hình gây tổn thương động mạch mạc treo chuột).
+ Gây tổn thương da và niêm mạc (mô hình gây tổn thương niêm mạc mũi thỏ, mô hình gây tổn thương niêm mạc lưỡi chó, mô hình gây tổn thương tai thỏ, mô hình gây tổn thương da chuột).
+ Gây tổn thương bằng cắt đuôi hay cắt chi chuột.
Mô hình gây rối loạn thành mạch: gây giãn mạch bằng acetylcholine và gây tăng tính thấm thành mạch bằng hợp chất 48/80.
Mô hình gây rối loạn tiểu cầu: 2 mô hình gây giảm tiểu cầu và 3 mô hình gây giảm chất lượng tiểu cầu.
Mô hình gây rối loạn các yếu tố đông máu: 1 mô hình gây bằng heparin, 2 mô hình gây giảm vitamin K, 2 mô hình gây bệnh gan, 2 mô hình di truyền.
Đã phân tích và đánh giá được ưu nhược điểm của các mô hình nghiên cứu tác dụng cầm máu của thuốc trên động vật thực nghiệm, bước đầu định hướng sử
dụng các mô hình để nghiên cứu về tác dụng và xa hơn là định hướng các cơ chế tác dụng của thuốc cầm máu.
5.2. Đề xuất
Với những kết quả thu được từ đề tài “Tổng quan một số mô hình nghiên cứu tác dụng cầm máu của thuốc trên động vật thực nghiệm”, chúng tôi xin đề xuất một số ý kiến để đề tài này góp phần phục vụ hiệu quả cho các nghiên cứu về thuốc cầm máu sau này:
Tìm hiểu thêm một số động vật thiếu hụt các yếu tố trong quá trình cầm máu trên di truyền phù hợp cho nghiên cứu các bệnh hiếm gặp trên lâm sàng.
Hệ thống thêm các mô hình động vật gây rối loạn tiêu fibrin để thử tác dụng của thuốc lên quá trình tiêu fibrin.
Tiến hành nghiên cứu sâu hơn các mô hình về cơ chế phân tử và đích tác dụng của thuốc cầm máu trên cả bốn giai đoạn: thành mạch, tiểu cầu, các yếu tố đông máu, tiêu fibrin.
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt:
1. Hà Thị Anh (2009), Huyết học truyền máu, NXB Y Học.
2. Hà Thị Anh (2009), Kỹ thuật xét nghiệm huyết học – truyền máu, NXB giáo dục, tr 108 – 141.
3. Bộ môn Dược lực Trường Đại học Dược Hà Nội (2008), Giải phẫu sinh lý, tr.81 – 89.
4. Bộ môn Dược lực Trường Đại học Dược Hà Nội (2011), Thực tập dược lý, tr. 22 – 23, 41 – 42.
5. Bộ y tế (2007), Dược lý học, tập 2, NXB Y học, tr. 113 – 126.
6. Đào Văn Chinh, Trần Kim Xuyến (1979), Đông máu và bệnh lý đông máu, NXB Y học.
7. Phạm Thị Mai Hương (2013), Nghiên cứu tác dụng của cây móc theo hướng cầm máu, Khóa luận dược sĩ đại học.
8. Nguyễn Văn Khang (2004), “Nghiên cứu chế thử thuốc cầm máu sát khuẩn trên băng cấp cứu dưới nước”, Khóa luận thạc sĩ dược học.
9. Lê Thị Nga (2008), “Tổng quan về các mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc”, Khóa luận dược sĩ đại học, tr.20 – 23.
10. Nguyễn Anh Trí (2008), Đông máu và ứng dụng trong lâm sàng, NXB Y Học.
11. Viện huyết học - truyền máu trung ương (2009), Kỹ thuật xét nghiệm huyết học và truyền máu ứng dụng trong lâm sàng, NXB Y Học.
Tài liệu tiếng nước ngoài:
12. Akarsu Cevher, Kalayci Mustafa Uygar, Yavuz Erkan, Özkara Selvinaz, Gőkçek Berk, Özdenkaya Yaşar, Yalçin Orhan (2011), “Comparison of the hemostatic efficiency of Ankaferd Blood Stopper and fibrin glue on a liver
laceration model in rats”, Turkish Journal of Trauma and Emergency Surger,
17 (4):308-312.
13. Akimoto Toshio, Hayashi Norihide, Adachi Mari, Kobayashi Nobuaki, Zhang Xue-Jun, Ohsuga Masaru, Katsuta Yasumi (2005), “Viability and plasma vitamin K levels in the common bile duct-ligated rats”, Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science , 54(2):155- 161.
14. Aysan Erhan, Bektas Hasan, Ersoz Feyzullah, Sari Serkan, Kaygusuz Arslan, Huq Gulben Erdem (2010), “Ability of the ankaferd blood stopper® to prevent parenchymal bleeding in an experimental hepatic trauma model”,
International Journal of Clinical and Experimental Medicine, 3(3):186-191. 15. Baklaja Radmila, Pešić Milan C., Czarneck Jan (2008), Haemostasis and
Haemorrhagic Disorders, Fermentation-Biotecc GmbH.
16. Bi Lei, Sarkar Rita, Naas Thierry, Lawler Ann M., Pain Jayashree, Shumaker Sally L., Bedian Vahe, Kazazian Haig H. Jr. (1996), “Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies”, Blood, 88(9):3446-3450.
17. Blajchman Morris A., Senyi A. F., Hirsh J., Surya Y., Buchanan M., Mustard J. F., (1979), “Shortening of the Bleeding Time in Rabbits by Hydrocortisone Caused by Inhibition of Prostacyclin Generation by the Vessel Wall”, The Journal of clinical investigation, 63(5):1026-1035.
18. Cao Ou, Armstrong Elina, Schlachterman Alexander, Wang Lixin, Okita David K., Conti-Fine Bianca, High Katherine A., Herzog Roland W. (2006), “Immune deviation by mucosal antigen administration suppresses gene- transfer–induced inhibitor formation to factor IX”, Blood, 108(2):480-486. 19. Cipil Handan S., Kosar Ali, Kaya Arif, Uz Burak, Haznedaroglu Ibrahim C.,
Goker Hakan, Ozdemir Oktay, Koroglu Mustafa, Kirazli Serafettin, Firat Huseyin Cahit (2009), “In vivo hemostatic effect of the medicinal plant
extract Ankaferd Blood Stopper in rats pretreated with warfarin”, Clinical and applied thrombosis/hemostasis, 15(3):270-276.
20. Corrigan James J. Jr., Ulfers Lorraine L. (1981), “Effect of vitamin E on prothrombin levels in warfarin-induced vitamin K deficiency”, The American journal of clinical nutrition, 34(9):1701-1705.
21. Denis Cécile V., Kwack Kyubum, Saffaripour Simin, Maganti Srinivas, André Patrick, Schaub Robert G., Wagner Denisa D. (2001), “Interleukin 11 significantly increases plasma von Willebrand factor and factor VIII in wild type and von Willebrand disease mouse models”, Blood, 97(2):465-472. 22. Denis Cécile, Methia Nassia, Frenette Paul S., Rayburn Helen, Ullman-
Culleré Mollie, Hynes Richard O., Wagner Denisa D. (1998), “A mouse model of severe von Willebrand disease: Defects in hemostasis and thrombosis”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95(16):9524-9529.
23. Duz Erkan, Aslan Logman, Alkan Ismail, Bayram Irfan, Kaya Abdullah, Ayhan Harun, Ozer Eda (2010), “The investigation on the effect of the vegetal origin Ankaferd Blood Stopper in experimental intra-abdominal surgery over rabbits”, Journal of Animal and Veterinary Advances, 9(10): 1491-1494.
24. Emmez Hakan, Emre Durdag, Tonge Mehmet, Tokgoz Nil, Gonul Ipek, Ceviker Necdet (2010), “Radiological and histopathological comparison of microporous polysaccharide hemospheres and oxidized regenerated cellulose in the rabbit brain: a study of efficacy and safety”, Turkish Neurosurgery, 20(4):485-491.
25. Ficicilar H., Zergeroglu A.M., Ersoz G., Erdogan A., Ozdemir S., Tekin D. (2006), “The Effects of Short-Term Training on Platelet Functions and Total Antioxidant Capacity in Rats”, Physiological research, 55(2):151-156.
26. Foerch Christian, Arai Ken, Jin Guang, Park Kyung-Pil, Pallast Stefanie, van Leyen Klaus, Lo Eng H. (2008), “Experimental model of warfarin-associated intracerebral hemorrhage”, Stroke, 39(12):3397-3404.
27. Forsythe LeeAnn T., Willis Saundra E. (1989), “Evaluating oral mucosa bleeding times in healthy dogs using a spring-loaded device”, The Canadian Veterinary Jounal, volume 30.
28. Friesenecker Barbara E, Tsai Amy G, Martini Judith, Ulmer Hanno, Wenzel Volker, Hasibeder Walter R, Intaglietta Marcos, Dünser Martin W (2006), “Arteriolar vasoconstrictive response: comparing the effects of arginine vasopressin and norepinephrine”, Critical Care, 10(3):R75.
29. Giles Alan R., Tinlin Shawn, Greenwood Ronald (1982), “A canine model of hemophilic (factor VIII:C deficiency) bleeding”, Blood, 60(3):727-730. 30. Goerge Tobias, Ho-Tin-Noe Benoit, Carbo Carla, Benarafa Charaf, Remold-
O'Donnell Eileen, Zhao Bing-Qiao, Cifuni Stephen M., Wagner Denisa D. (2008), “Inflammation induces hemorrhage in thrombocytopenia”, Blood, 111(10): 4958-4964.
31. Greene T. K., Schiviz A., Hoellriegl W., Poncz M., Muchitsch E. M. (2010), “Towards a standardization of the murine tail bleeding model”, Journal of Thrombosis and Haemostasis, 8(12): 2820–2822.
32. Hagisawa Kohsuke, Saito Akihiro, Kinoshita Manabu, Fujie Toshinori, Otani Naoki, Shono Satoshi, Park Young-Kwang, Takeoka Shinji (2013), “Effective control of massive venous bleeding by “multioverlapping therapy” using polysaccharide nanosheets in a rabbit inferior vena cava injury model”,
Journal of Vascular Surgery, 1(3): 289-297.
33. Hasgul Rukiye, Uysal Sema, Haltas Hacer, Akyol Sumeyye, Yuksel Yasemin, Gurel Ayse and Armutcu Ferah (2012), “Protective effects of Ankaferd blood stopper on aspirin-induced oxidative mucosal damage in a rat model of gastric injury”, Toxicology and Industrial Health, 1–8.
34. Hirayama Kazuhiro, Uetsuka Koji, Kuwabara Yoshibumi, Tamura Motoi, Itoh Kikuji (2007), “Vitamin K deficiency of germfree mice caused by feeding standard purified diet sterilized by gamma-irradiation”, Experimental animals, 56(4):273-278.
35. Huang Hui-Chun, Wang Sun-Sang, Chang Ching-Chih, Lee Fa-Yauh, Chang Full-Young, Lin Han-Chieh, Hou Ming-Chih, Lu Rei-Hwa, Lee Shou-Dong (2007), “Chronic indomethacin treatment enhances the portal-systemic collateral vascular response to vasopressin in bile-duct ligated rats”, Journal of the Chinese Medical Association, 70(12):521-526.
36. Illanes Sergio, Zhou Wei, Schwarting Sönke, Heiland Sabine, Veltkamp Roland (2011), “Comparative effectiveness of hemostatic therapy in experimental warfarin-associated intracerebral hemorrhage”, Stroke, 42(1): 191-195.
37. Kalayci Mustafa Uygar, Soylu Aliye, Eroglu Hasan Erol, Kubilay Dilek, Sancak Banu, Ugurluoglu Ceyhan, Ercin Ugur, Koca Yavuz, Karatepe Oguzhan (2010), “Effect of ankaferd blood stopper on hemostasis and histopathological score in experimental liver injury”, Bratislavske lekarske listy, 111 (4): 183 – 188.
38. Kandemir Ozer, Buyukates Mustafa, Kandemir Nilufer Onak, Aktunc Erol, Gul Aylin Ege, Gul Sanser, Turan S Akin (2010), “Demonstration of the histopathological and immunohistochemical effects of a novel hemostatic agent, ankaferd blood stopper, on vascular tissue in a rat aortic bleeding model”, Journal of Cardiothoracic Surgery, 5:110.
39. Kelles Mehmet, Kalcioglu M. Tayyar, Samdanci Emine, Selimoglu Erol, Iraz Mustafa, Miman Murat Cem, Haznedaroglu Ibrahim C. (2011), “Ankaferd Blood Stopper is more effective than adrenaline plus lidocaine and gelatin foam in the treatment of epistaxis in rabbits”, Current Therapeutic Research, 72: 5.
40. Kirkman Matthew A, Allan Stuart M, Parry-Jones Adrian R (2011), “Experimental intracerebral hemorrhage: avoiding pitfalls in translational research”, Journal of cerebral blood flow and metabolism, 31(11):2135- 2151.
41. Klement Petr, Liao Peng, Hirsh Jack, Johnston Marilyn, Weitz Jeffrey I.