3.4.4.1. Mô hình gây Hemophilia A. Nguyên tắc:
Hemophilia A là một bệnh rối loạn đông máu gây thiếu hụt yếu tố VIII. Có nhiều mô hình gây hemophilia A, tuy nhiên, mô hình được sử dụng nhiều nhất hướng tới mục tiêu là exon 16 và exon 17 đều nằm trên miền A3 của chuỗi nhẹ. Tạo chuột bị mất exon 16 bằng cách chèn các cassette vào đầu 3’ của exon làm ARN nối bất thường, chuột mất exon 17 bằng cách chèn các cassette vào đầu 5’ của exon 17 dẫn đến bỏ qua exon này khi phiên mã. Đột biến trên cả hai exon này gây bệnh Hemophilia A với kiểu hình chảy máu quá mức (còn lại <1% FVIII hoạt động) [16], [71].
Các FVIII chuột giống với FVIII người tới 74%. Các cấu trúc miền của FVIII cũng như phương pháp xử lý và kích hoạt FVIII tương tự nhau ở chuột và
người. Do đó, đánh giá tác dụng của thuốc trên mô hình chuột Hemophilia là một công cụ quan trọng và hữu ích [71].
Tuy nhiên, những con chuột này không dễ bị chảy máu tự phát, chỉ có chảy máu quá mức khi có tổn thương, và trên người, bệnh hemophilia A cũng gây biến chứng chảy máu khớp rất nguy hiểm. Các thuốc cầm máu phát triển theo cơ chế này phải đánh giá được khả năng ngăn chảy máu khớp cấp tính ở bệnh nhân Hemophilia A [71].
Tạo Hemophilia
Dựa trên những con chuột hemophilia A ban đầu được tạo ra trên nền tảng di truyền giống C57BL6/129sv. Nhân giống giữa con đực dị hợp tử và con cái đồng hợp tử lặn tạo ra các lứa chuột con mắc Hemophilia A.
Trên chuột: chuột C57BL/6 (loài thiếu yếu tố VIII do bị xóa exon 16) cả hai giống, có trọng lượng khoảng 280g [81]. Chuột được chia ngẫu nhiên vào các lô:
+ Lô chứng: các con chuột Hemophilia được dùng nước muối sinh lý. + Lô thử: các con chuột Hemophilia được dùng thuốc thử nghiệm.
+ Lô so sánh: các con chuột Hemophilia được dùng thuốc thử đã rõ cơ chế tăng FVIII (như yếu tố VIII tái tổ hợp hoặc DDAVP).
Kết thúc thời gian hấp thu thuốc, tiến hành các thử nghiệm sau:
Thử nghiệm thời gian chảy máu: đo thời gian chảy máu đuôi chuột như mục 2.1.5.
Thử nghiệm thời gian đông máu: gây mê bằng isofluran/N2O/O2. Bộc lộ các động mạch cảnh. Gây tổn thương bằng cách áp một miếng giấy lọc (2 × 5 mm) ngâm trong dung dịch FeCl3 10% tiếp xúc động mạch trong 5 phút.
Thử nghiệm tổn thương khớp: Cạo sạnh lông ở đầu gối. Đâm một kim 30 gauge vào khoang khớp. Gây chảy máu ở đầu gối phải và giữ đầu gối trái làm nhóm chứng.
Đánh giá kết quả: [81]
Xác định thời gian chảy máu: xác định thời gian chảy máu đuôi như mục 2.1.5.
Thời gian đông máu (thử nghiệm gây tổn thương bằng FeCl3): Thời gian từ khi loại bỏ các giấy lọc đến khi chấm dứt dòng máu chảy qua. Nếu không có tắc thì thời gian tắc được ghi nhận là 25 phút.
Định lượng nồng độ yếu tố VIII, anti-FVIII trong huyết tương: sử dụng các xét nghiệm miễn dịch ELISA [18].
Đo các thông số đông máu: thời gian đông máu, TT, PT, aPTT. aPTT ở nhóm thử phải rút ngắn hơn so với nhóm chứng.
Đánh giá tổn thương đầu gối: 24h sau khi gây tổn thương khớp gối, giết chuột. Đo đường kính chảy máu, phân loại theo hình ảnh chảy máu (VBS) và xếp hạng từ 0 đến 3 [65].
Bảng 3.3. Điểm cho các tổn thương khớp gối trên chuột hemophilia
Điểm Bao khớp Máu trong bao khớp
0 Không sưng Không
1 Không sưng Có
2 Có sưng nhưng không căng khớp Có
3 Có cả sưng và căng khớp Có
3.4.4.2. Mô hình gây Hemophilia B. Nguyên tắc:
Hemophilia B là bệnh thiếu hụt yếu tố IX (yểu tố Christmas hay thành phần thromboplastin huyết tương).
Gen yếu tố IX của người là một gen dài 34 kb nằm trên nhiễm sắc thể X (q 27.1) có chứa 8 exon (từ a đến h) và 7 intron. Trong đó có exon g và h mã hóa cho hoạt động của protein yếu tố IX. Chuỗi protein yếu tố IX của người và chuột tương đồng nhau tới 68%. Nhiều đột biến tạo hemophilia B trên chuột được tìm thấy trên khắp chiều dài của gen, điển hình là các đột biến điểm làm thay đổi baze nitơ trong chuỗi ADN [46]. Gây đột biến tạo ra chuột thiếu yếu tố IX bằng cách xóa hoặc exon
h (mã hóa chức năng xúc tác của protease serine) hoặc cả hai exon g và exon h. Những con chuột được tạo từ hai phương pháp này không có protein yếu tố IX trong máu. Chuột thiếu yếu tố IX đồng hợp tử (FIX -/- ) không có yếu tố IX ở gan và tuần hoàn, chảy máu quá mức không thể cầm máu khi bị cắt đuôi [46], [71], [85]. Duy trì chủng Hemophilia B bằng các sử dụng giống cái bị xóa cả 2 gen yếu tố IX trên hai nhiễm sắc thể X. Tuy nhiên, chảy máu tự phát hiếm khi được quan sát trên chuột FIX -/-, chuột sẽ chảy máu đến chết sau khi được cắt đuôi [71].
Cách tiến hành: [72], [85]
Động vật: chuột C57BL/6 có bệnh hemophilia B (giảm yếu tố IX) (FIX -/-). Lấy máu: gây mê với tiêm phúc mạc avertin 1.25%.
Các xét nghiệm và đo lường kết quả như đối với Hemophilia A. Chỉ có khác biệt là thay vì định lượng FVIII, mô hình này tiến hành định lượng FIX và anti-FIX. Thuốc nếu rút ngắn được thời gian chảy máu đáng kể ở chuột mắc hemophilia được coi là có tác dụng lên quá trình cầm máu. (Ở động vật bình thường, chảy máu sẽ ngừng tự nhiên sau 2-8 phút. Ở con vật mắc hemophilia nặng, chảy máu tiếp tục cho đến 20 phút, hoặc chảy máu cho đến chết).
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ LỰA CHỌN CÁC MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU
Cầm máu là một quy trình phức tạp bao gồm năm giai đoạn: co mạch, tạo nút tiểu cầu, đông máu, co cục máu đông và tan cục máu đông. Cầm máu có sự tham gia của nhiều yếu tố mà mỗi yếu tố trong mỗi giai đoạn đặc trưng cho một cơ chế cầm máu nhất định. Căn cứ vào đó, nhiều mô hình đã được tạo ra để nghiên cứu khả năng cầm máu của các thuốc mới. Trong mỗi mô hình, động vật thực nghiệm và các điều kiện thí nghiệm có ảnh hưởng nhất định đến kết quả nghiên cứu. Do đó, việc lựa chọn một mô hình động vật có thể chứng minh tốt nhất các tác dụng của thuốc là rất quan trọng.