Vitamin K có tác dụng làm đông máu bằng cách: carboxyl hóa gốc glutamat trong cấu trúc hóa học của các yếu tố II, VII, IX, X để chuyển chúng thành các yếu tố đông máu có hoạt tính [2]. Giảm Vitamin K sẽ làm giảm các yếu tố đông máu hoạt hóa, gây chảy máu kéo dài. Do đó, có thể gây mô hình thiếu vitamin K trên thực nghiệm bằng cách: cho dùng thuốc kháng vitamin K, chế độ ăn thiếu vitamin K.
3.4.4.1. Mô hình dùng thuốc kháng vitamin K. Nguyên tắc:
Các thuốc kháng vitamin K ức chế enzym epoxid – reductase, cản trở việc khử vitamin K – epoxid thành vitamin K, do đó làm giảm vitamin K trong huyết tương. Mô hình này đã được Foerch và cộng sự thực hiện năm 2008 trên chuột Wistar, sử dụng thuốc kháng vitamin K là warfarin, đây được xem là mô hình hữu ích trong nghiên cứu tác dụng của các thuốc cầm máu trên động vật giảm vitamin K [26]. Illanes (2010), Schlunk (2012), Zhou (2011) cũng sử dụng mô hình này trong nghiên cứu .
Cách tiến hành
Chuột nhắt trắng cả hai giống, trọng lượng trong khoảng 200-350 g [19], [27], [44], [48]. Các con chuột được chia làm các lô:
+ Lô chứng trắng: không dùng warfarin, sau đó cho dùng nước muối sinh lý. + Lô chứng bệnh: cho dùng warfarin, sau đó cho dùng nước muối sinh lý. + Lô thử: cho dùng warfarin, sau đó cho dùng thuốc thử nghiệm.
+ Lô so sánh: cho dùng warfarin, sau đó cho dùng thuốc cầm máu đã rõ cơ chế có thể đảo ngược tác dụng của kháng vitamin K (vitamin K, phức hợp prothrombin cô đặc, huyết tương tươi đông lạnh, yếu tố VIII kích hoạt, axit tranexamic) [36].
Gây chảy máu bằng thuốc kháng đông: chuột được cho dùng warfarin liều như sau:
+ 2 mg/kg cho 24h, pha vào nước uống, cho dùng kéo dài 3 - 4 ngày [19], [26], [27], [44], [48]. Kiểm tra giá trị INR của các con chuột để đảm bảo đáp ứng với warfarin là đồng nhất trên tất cả các loài động vật trong nghiên cứu [19]. + 10 mg/kg/ 24h, pha vào nước uống, một hoặc 2 lần trong ngày, trong 2 ngày
liên tiếp.
+ 0.4 mg/kg cho 24h, cho dùng 3 ngày liên tiếp [36], [84]. + 0.01 -1.0 mg/ 100g, tiêm màng bụng trong 7 ngày [20].
Đối với gây ICH bằng cách tiêm collagenase: kiểm tra INR trước khi tiêm collagenase, chỉ tiêm cho các con chuột có INR 3 – 6 [36]. Gây mô hình ICH bằng tiêm collagenase như mục 2.1.2.
Đánh giá kết quả:
Đo INR: rút 0.6 ml máu từ tĩnh mạch. Cho máu vào ống nghiệm chứa 66.6 ml citrat. Đo INR và PT bằng máy phân tích.
Thời gian chảy máu: gây mê bằng isofluran 3%, duy trì nhiệt độ thân nhiệt ở 37 ± 5o
C. Thời gian được tính từ khi cắt cụt chân hoặc cắt đuôi hoặc đâm thủng động mạch đùi trái bằng kim 24 gauge đến khi máu ngừng chảy, theo mô hình mục 2.2.5.
Đo thời gian máu đông: nhỏ một giọt máu (từ vết thương chân hoặc đuôi) lên mặt kính cong, dùng đồng hồ xác định thời gian cho tới khi máu đông (không thay đổi hình dạng khi nghiêng phiến kính) [8], [11].
Lượng máu chảy: đo bằng giấy thấm cho đến khi máu ngừng chảy. Cân giấy trước và sau khi thực hiện gây tổn thương. Chênh lệch trọng lượng giấy trước và sau khi gây tổn thương được coi là lượng máu chảy [19].
Mô hình gây ICH: đánh giá các kết quả như đã nêu ở mục 2.1.2.2.
3.4.4.2. Mô hình gây bằng chế độ ăn thiếu vitamin K. Nguyên tắc:
Thiếu viamin K trong máu xảy ra trên những con chuột được cho ăn một chế độ ăn có ít hơn 5 ng vitamin K/g mỗi ngày [57], [64]. Đây là mô hình đã được sử dụng bởi Matsuura và cộng sự (1988), Uchida và cộng sự (1987), Hirayama và cộng sự (2007) và chứng tỏ đây là mô hình hữu ích cho các nghiên cứu thuốc cầm máu trên động vật thiếu vitamin K [57], [34].
Cách tiến hành:
Động vật: chuột Dawley Sprague đực, 7 tuần tuổi. Nuôi trong phòng với nhiệt độ 23 ± 2oC, độ ẩm tương đối 55 ± 10 %, chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày (8:00 – 20:00). Các con chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô:
+ Lô chứng trắng: cho ăn chế độ ăn bình thường và cho dùng nước muối sinh lý.
+ Lô chứng bệnh: cho ăn chế độ ăn thiếu vitamin K và cho dùng nước muối sinh lý.
+ Lô thử: cho ăn chế độ ăn thiếu vitamin K và cho dùng thuốc thử nghiệm. + Lô so sánh: cho ăn chế độ ăn thiếu vitamin K và cho dùng thuốc cầm máu đã
biết rõ cơ chế làm tăng vitamin K.
Gây thiếu vitamin K bằng chế độ ăn: cho dùng chế độ ăn bình thường hoặc thiếu vitamin K trong 4 – 6 ngày.
+ Chế độ ăn bình thường (JCLCA-1, Nhật Bản hoặc TD81053, Mỹ), có hàm lượng vitamin K 500 ng/g - 600 ng/g Vitamin K1) [57], [64].
+ Chế độ ăn thiếu vitamin K bao gồm: vitamin Ki 30-50 ng/g (18.0%), sucrose (67.6%), dầu hạt cải và dầu đậu nành (8.0%), hỗn hợp muối Hegsted (4.0%), sợi (1.5%) và đủ lượng vitamin trừ vitamin K [90].
+ Hoặc chế độ ăn theo bảng sau: sử dụng chế độ ăn AIN-76 có hàm lượng vitamin K dưới 5 ng/g, như bảng 2.2 dưới đây [34]. (chế độ ăn bình thường
có thành phần tương ứng bằng, chỉ có hàm lượng vitamin K là 500 ng/g so với chế độ ăn ANI-76, công thức tính cho 100g thức ăn).
Bảng 3.2. Chế độ ăn AIN-76 thiếu vitamin K
Casein 20.0 Vitamin A (500 000 IU/g) 0.08
DL-Methionine 0.3 Vitamin D3 (500 000 IU/g)
0.02
Tinh bột ngô 15.0 Vitamin E (500 IU/g) 1.00
Tinh bột ngô dextrin hóa
Vitamin B1 0.06
Sucrose 50.0 Vitamin B2 0.06
Bột cellulose 5.0 Vitamin B6 0.07
Dầu ngô 5.0 Vitamin B12 (0.1% ) 0.10
Dầu đậu nành Acid Nicotinic 0.30
Vitamin tổng hợp 1.0 D-calci pantothenat 0.16
L-Cystine Acid Folic 0.02
Choline bitartrate 0.2 D-Biotin 0.002
Tert-
butylhydroquinone
Vitamin K1
Vitamin K3 0.0005
Sucrose, Bột vừa đủ 97.9495
Trong tất cả các thí nghiệm, các con chuột được nuôi trong chuồng có đáy là lưới thép (2 con chuột mỗi lồng) để ngăn chuột hấp thu một lượng Vitamin K từ việc ăn phân [57].
Đánh giá: [57]
Thời gian máu chảy: đo thời gian chảy máu đuôi chuột như mô hình mục 2.1.5.
Đo các thông số đông máu ở chuột: gây mê, rút máu từ tĩnh mạch chủ vào ống tiêm đã có chất chống đông. Xác định các thông số: PT, nồng độ fibrinogen và thời gian chảy máu, định lượng nồng độ yếu tố VII trong huyết tương.
Các thông số hóa sinh: kiểm tra ảnh hưởng của thuốc lên chức năng qua các thông số được đo: GOT, GPT, LDH huyết tương.
Kiểm tra trên lâm sàng: xuất huyết tại các vị trí: phổi, màng não, bụng, chân, tay, bàng quang và các vị trí khác.
So sánh giữa các nhóm nghiên cứu.