Nguyên tắc:
Các tạng như gan, lách, thận là những cơ quan lớn ở bụng và rất dễ bị tổn thương [76]. Mặt khác, chúng có cấu trúc bề mặt rộng, nhiều mạch máu để nuôi cơ quan, nhu mô không có cơ trơn, có ít collagen, vì vậy khi bị tổn thương thường gây chảy máu rất nghiêm trọng, rất khó để cầm máu [14], [43], [56], [70]. Chính vì gây chảy máu mức độ nặng, các mô hình gây tổn thương các tạng thường sử dụng để thử tác dụng cầm máu tại chỗ của thuốc. Tiềm năng cầm máu của các thuốc được đánh giá dựa vào các chỉ số là thời gian chảy máu và lượng máu chảy. Đồng thời, kiểm tra mô bệnh học để biết được ảnh hưởng của thuốc lên vùng mô bị tổn thương. Các mô hình này đã bắt chước được các tổn thương hay phẫu thuật tạng thường gặp trên lâm sàng, được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu [50].
Cách tiến hành:
Sử dụng chuột cống Wistar đực trọng lượng khoảng 250 – 400g, hoặc thỏ trắng New Zealand cả hai giống, nặng 2.5 – 3kg, chia ngẫu nhiên thành các lô:
+ Lô chứng trắng: mở bụng mà không gây tổn thương tạng, không được sử dụng biện pháp cầm máu nào.
+ Lô chứng bệnh: gây tổn thương tạng và sử dụng dung môi pha thuốc hoặc nước muối sinh lý.
+ Lô thử: gây tổn thương tạng và sử dụng thuốc nghiên cứu.
Mô hình này thường gây chảy máu mức độ nặng, do đó, dùng thử nghiệm tác dụng cầm máu tại chỗ của thuốc.
Sau khi chia lô, các con vật được để đói qua đêm và tiến hành gây mê (chuột: tiêm màng bụng ketamin hydroclorid liều 20 mg/kg và xylazin liều 2 mg/kg, thỏ: tiêm tĩnh mạch natri pentobarbital liều 50 mg/kg) và cố định chúng vào bàn phẫu thuật. Theo dõi các chỉ số để đảm bảo sự khác biệt là không đáng kể giữa các nhóm về cân nặng, khối lượng phần tạng đã cắt bỏ, các thông số huyết học như (số lượng hồng cầu, hematocrit, hemoglobin, bạch cầu, tiểu cầu, aPTT, PT, TT) trước thử nghiệm và để đảm bảo không có thay đổi về huyết học nào ảnh hưởng đến thời gian chảy máu. Kiểm tra lại sau thử nghiệm nhằm đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên các thông số trên. Riêng trên thỏ, đặt thêm một ống thông vào động mạch đùi để theo dõi huyết áp động mạch trong suốt thời gian thử nghiệm, đảm bảo không có sự khác nhau giữa các nhóm trước khi gây tổn thương và sự thay đổi huyết áp do mất máu sau tổn thương.
Phương pháp gây tổn thương: Gây tổn thương gan:
+ Trên chuột theo phương pháp cắt gan: Cạo lông phần giữa bụng, sát trùng bằng povidon iod. Mở khoang bụng bằng một đường rạch giữa bụng 3 cm theo chiều dọc, bắt đầu từ mũi ức. Bộc lộ thùy trung gian trái. Cắt gan theo đường ngang dài nhất trên thùy trung gian trái mà không làm thay đổi vị trí giải phẫu của thùy. Khối lượng gan cắt vào khoảng 1 – 2g. Khâu bụng. Riêng ở nhóm chứng trắng, chỉ kiểm tra gan sau đó bụng được khâu lại [14].
Hình 3.2. Vị trí của đường rạch trên mô hình gây tổn thương gan [14] Thùy trung gian trái
+ Trên chuột theo phương pháp đâm thủng gan: mô hình của Murakamiet và cộng sự: tiếp xúc gan sau khi mở bụng, đặt giấy lọc đã cân trước trọng lượng dưới thùy gan. Gây một vết thương trên gan (giữa thùy trái) bằng kim tiêm 13 gauge (hoặc 18 gauge theo mô hình của Tang và cộng sự (2010)) như hình dưới: [88], [96]. Ngoài ra Akarsu và cộng sự (2011) cũng thực hiện mô hình gây vết rạch (1cm chiều dài, 2mm chiều sâu) [12].
Hình 3.3. Gây tổn thương gan theo phương pháp đâm thủng [96].
+ Trên thỏ: thực hiện 1 vết rạch giữa bụng (dài khoảng 20 cm). Tạo tổn thương gan để gây chảy máu bằng cách dùng kéo cắt các cực trước của thùy phải, trái và thùy giữa của gan. Các tổn thương gan của các con vật được tạo ra một cách nhất quán.
Gây tổn thương lách:
Sau khi làm sạch vùng bụng của chuột bằng dung dịch povidon iod, mở ổ bụng bằng đường rạch dài 3 cm. Đặt một bao polyester hình phễu dưới lá lách để thu máu chảy ra. Tạo tổn thương lách bằng đường rạch khoảng 0.5 cm chiều sâu và 0.3 cm chiều dài [89].
Gây tổn thương thận:
Đặt chuột ở vị trí nghiêng, cạo lông vùng lưng, chuẩn bị dung dịch povidon iod để sát trùng. Cắt 1/10 quả thận ở phần đáy bằng cách sử dụng một bản mẫu đã tiêu chuẩn hóa từ trước [43].
Đánh giá kết quả
Ngay sau khi gây các tổn thương như trên, tùy theo từng yêu cầu của nghiên cứu mà có thể đánh giá kết quả qua các thông số sau:
Thời gian chảy máu: là thời gian từ khi bắt đầu thực hiện vết cắt lên bề mặt các tạng cho đến khi chảy máu dừng lại hoàn toàn. Duz và cộng sự (2010) cũng đưa ra bảng giá trị thời gian chảy máu cho các vị trí tổn thương tương ứng [23].
Thể tích máu mất: Máu chảy trong ổ bụng được thấm vào bông đã cân trước (sau khi máu chảy hoàn toàn, cho bông vào ổ bụng để thấm máu). Tính khối lượng máu chảy do tổn thương bằng cách gộp bông đã thấm máu và cân chính xác. Mật độ của máu được giả định là 1.0 g/cm3. Thể tích máu mất xác định theo chênh lệch bông ban đầu và sau khi thấm máu, chia cho khối lượng động vật [50].
Công thức: V = (mb2 – mb1)/m
mb1: khối lượng bông trước khi phẫu thuật mb2: khối lượng bông sau khi phẫu thuật m: khối lượng con vật
Tính thể tích máu mất trong tổn thương lách: dùng xi-lanh lấy máu từ túi polyester. Tính toán lượng máu mất theo thể tích trên xilanh và gỡ túi polyester khỏi khoang bụng. Khâu bụng.
Xác định các chất chỉ điểm trong tổn thương tạng: ly tâm mẫu máu để thu được huyết thanh, bảo quản ở -80oC để xác định nồng độ aminotransterase (AST), alanine aminotransferase (ALT), lactate dehydrogenase (LDH), lactate và creatinin. Các nồng độ được đo theo các máy móc và dụng cụ đo có sẵn trong các phòng thí nghiệm [37], [76].
Các xét nghiệm in-vitro: thời gian đông máu (CT), thời gian hình thành cục máu đông (CFT), độ cứng tối đa cục máu đông (MCF) [77]. Đo aPTT và PT bằng máy phân tích đông máu [50].
Kiểm tra đại thể: kiểm tra mức độ bám dính trong ổ bụng, sau phẫu thuật 7 ngày, gây mê chuột, mở bụng và quan sát mức độ bám dính của vết thương vào ở bụng, bám dính của tạng với cơ quan xung quanh. Dính: 1 điểm, không dính: 0 điểm. Tính toán và cho điểm.
Kiểm tra vi thể mô bệnh học: giết chuột, lấy các mẫu mô bệnh học và ngâm trong dung dịch formalin 10%. Làm tiêu bản. Đánh giá các tiêu chí mô bệnh học dưới kính hiển vi (về hoại tử, viêm) và cho điểm theo bảng sau:
Bảng 3.1. Điểm các tiểu chí hoại tử và viêm trên mô bệnh học các tạng [14].
Điểm Hoại tử Viêm
0 Không hoại tử 0% Không viêm 0%
1 Hoại tử tối thiểu ≤ 1% Viêm tối thiểu ≤ 1%
2 Nhẹ < 25% Nhẹ < 25%
3 Trung bình 25% - 50% Trung bình 25% - 50%
4 Nặng > 50% Nặng > 50%