Giảm tiểu cầu có thể do nhiều nguyên nhân: giảm tổng hợp (suy tủy xương) hoặc tăng phá hủy (chiếu xạ ung thư, kháng thể kháng tiểu cầu). Trên thực nghiệm, có thể sử dụng sự kết hợp nhiều phương pháp để gây giảm số lượng tiểu cầu và bắt chước được các trường hợp giảm tiểu cầu trên lâm sàng để nghiên cứu các thuốc cầm máu.
3.3.1.1. Mô hình gây giảm tiểu cầu bằng kháng huyết thanh và chiếu xạ
Nguyên tắc:
Giảm tiểu cầu có thể gây ra bởi phương pháp chiếu xạ và tiêm huyết thanh kháng tiểu cầu. Chiếu xạ làm giảm sản xuất mẫu tiểu cầu và huyết thanh kháng tiểu cầu làm tăng phá hủy tiểu cầu, kết hợp hai phương pháp này gây giảm tiểu cầu rõ
rệt trên thỏ (Blajchman (1979)). Dựa vào nguyên tắc trên có thể tạo ra các mô hình giảm số lượng tiểu cầu nhằm nghiên cứu tác dụng cầm máu của thuốc [17].
Cách tiến hành:
Động vật: thỏ trắng New Zealand cả hai giống, trọng lượng trong khoảng 2.5 – 3kg. Chia ngẫu nhiên thành các lô:
+ Lô chứng trắng: gây giảm tiểu cầu, không nhận thuốc điều trị.
+ Lô chứng bệnh: gây giảm tiểu cầu, cho dùng dung môi pha thuốc hoặc nước muối sinh lí.
+ Lô thử: gây giảm tiểu cầu và cho dùng thuốc thử nghiệm.
+ Lô so sánh: gây giảm tiểu cầu và cho dùng thuốc có tác dụng làm tăng số lượng tiểu cầu (romiplostim hoặc eltrombopag).
Gây giảm tiểu cầu:
Chiếu xạ: giảm tiểu cầu được tạo ra bằng cách chiếu nguồn cesium 90 rads trong 30 phút vào các con thỏ, thực hiện trong 10 ngày liên tiếp. Trong quá trình chiếu xạ, tai và cổ thỏ được bảo vệ bằng một dải ruy băng để tránh gây hại cho các tĩnh mạch cổ và các mạch máu ở tai. Số lượng tiểu cầu bắt đầu giảm sau khi chiếu xạ 4 ngày và giảm rõ rệt sau 10 ngày chiếu xạ. Do đó, quá trình chiếu xạ thường được thực hiện trong 10 ngày.
Tiêm huyết thanh kháng tiểu cầu (anti-GPIbα, anti-αIIbβ3, và anti-hlL4R): tiêm cho thỏ vào ngày chiếu xạ cuối cùng, liều lượng nằm trong khoảng 0.04 và 0.1 ml/kg [17]. Goerge và cộng sự (2008) dùng liều 2 µg/g [30].
Đánh giá:
Xác định thời gian chảy máu tĩnh mạch cảnh: sau 30 phút tiêm huyết thanh kháng tiểu cầu. (theo phương pháp mô tả mục 2.1.3).
Xác định thời gian chảy máu vi mạch: rạch vết rạch tiêu chuẩn 6mm qua tai thỏ sau khi đã được làm ấm trong 5 phút ở 37oC. Sau khi rạch, ngay lập tức nhúng tai vào dung dịch nước muối sinh lý. Ghi nhận thời gian chảy máu tai thỏ.
Các xét nghiệm đông máu và chức năng tiểu cầu: PT, aPTT, TT, đo độ kết tập tiểu cầu (kỹ thuật như mục 2.2.2.2) [17].
So sánh sự khác nhau giữa các nhóm nghiên cứu về thời gian chảy máu tĩnh mạch cảnh, thời gian chảy máu vi mạch, số lượng tiểu cầu.
3.3.1.2. Mô hình gây giảm tiểu cầu bằng các chất hoạt hóa tiểu cầu. Nguyên tắc:
Khi tiểu cầu được hoạt hóa để tham gia tạo huyết khối, thì số lượng tiểu cầu trong máu giảm [91]. Do đó, để tạo mô hình dùng để nghiên cứu tác dụng cầm máu, có thể tiêm tĩnh mạch các chất hoạt hóa tiểu cầu như: collagen, ADP. Các chất này có thể làm giảm tiểu cầu tối đa trong vòng vài phút và hiệu quả giảm số lượng tiểu cầu được tăng cường bằng cách tiêm thêm epinephrin [91].
Ngoài ra, Völkl và Dierichs (1986) cho rằng khi tiêm tĩnh mạch enzym collagenase dẫn đến phân giải protein, hình thành các khoảng trống tế bào nội mô và tiếp xúc sâu hơn vào lớp sâu của thành mạch. Thành mạch bị tổn thương làm cho tiểu cầu được hoạt hóa để kết dính với thành mạch, tạo huyết khối, do đó gây giảm tiểu cầu trong máu (mức tối đa 5 – 10 phút sau khi tiêm collagenase) [91].
Dựa trên nguyên tắc đó, gây giảm tiểu cầu trên chuột và tiến hành nghiên cứu về tác dụng của các thuốc trên quá trình cầm máu.
Tiến hành:
Động vật: Sử dụng chuột lang đực (Pirbright White), trọng lượng 300-600g, hoặc chuột nhắt trắng (260 – 300g) hoặc thỏ Chinchilla cả 2 giống có trọng lượng 2- 3kg. Các con vật được chia ngẫu nhiên thành các lô:
+ Lô chứng: gây giảm tiểu cầu và cho dùng dung môi pha thuốc hoặc nước muối sinh lý.
+ Lô thử: gây giảm tiểu cầu và cho dùng thuốc thử nghiệm.
Cho các con vật dùng thuốc. Kết thúc thời gian hấp thu tiến hành gây giảm tiểu cầu bằng cách tiêm tĩnh mạch đuôi một trong các chất/ hỗn hợp chất sau:
+ 1.5 U/kg collagenase [92]
+ 100 μl hỗn hợp collagen (150 μg/ml) kết hợp với ADP (170 mM) [95]. Với thỏ: tiêm chậm vào tĩnh mạch vành tai, với chuột: tiêm vào tĩnh mạch đuôi.
Đánh giá:
Số lượng tiểu cầu: lấy khoảng 50 – 100 µl máu vào ống chứa kali-EDTA. Xác định số lượng tiểu cầu của mẫu máu tại các thời điểm: 1 và 2 phút (chuột), tại 5, 10, 15 phút (thỏ) sau khi tiêm các chất gây giảm số lượng tiểu cầu.
Tính tỉ lệ tiểu cầu trong lô chứng và lô thử tại các các thời điểm lấy máu so với thời điểm ban đầu [91].
Tính phần trăm ức chế tiểu cầu cho mỗi lô thử - chứng [91].