Gan là nơi tổng hợp ra hầu hết các yếu tố đông máu. Bệnh lý gan (xơ gan, viêm gan) có thể dẫn đến giảm tổng hợp một số yếu tố đông máu như fibrinogen (yếu tố I), prothrombin (yếu tố II), proaccelerin (yếu tố V), proconvectin (yếu tố VII), antihemophylie (yếu tố VIII), christmas (yếu tố IX), làm rối lọan cơ chế đông máu [3]. Thêm vào đó, gan cũng tổng hợp các chất chống đông tự nhiên (protein C, protein S, antithrombin II) và các chất chủ yếu trong hệ thống tiêu sợi huyết (plasminogen và α2-antiplasmin) và thải một số yếu tố đông máu đã hoạt hóa (IXa, Xa, XIa, t-PA) trong tuần hoàn.
Các mô hình gây bệnh ở gan làm giảm các yếu tố đông máu, gây rối loạn chảy máu bao gồm:
3.4.4.3. Mô hình gây xơ gan do thắt ống dẫn mật. Nguyên tắc:
Xơ gan cấp sẽ tiến triển trên các con vật được thắt ống dẫn mật kéo dài 4- 5 tuần. Đây là mô hình gây bệnh gan được được Huang (2007), Akimoto (2005) sử dụng. Những mô hình này nhằm nghiên cứu tác dụng của thuốc lên quá trình đông máu thiếu hụt nhiều yếu tố đông máu.
Động vật: chuột đực Spraque-Dawley, trọng lượng 240 – 270 g (~250g). Chuột được chia ngẫu nhiên vào các lô:
+ Lô chứng: gây xơ gan và cho dùng dung môi pha thuốc hoặc nước muối sinh lý.
+ Lô thử: gây xơ gan và dùng thuốc thử nghiệm.
+ Lô so sánh: gây xơ gan và dùng thuốc cầm máu đã biết làm tăng vitamin K (như vitamin K).
Cho nhịn ăn 12h trước khi thử nghiệm.
Gây xơ gan thứ cấp bằng thắt ống dẫn mật (BDL): gây mê bằng tiêm bắp ketamin liều 100 mg/kg, rạch đường giữa bụng, nâng các thùy gan lên và kéo tá tràng xuống để bộc lộ ống mật chủ. Buộc sợi chỉ đầu tiên ở bên dưới đường giao nhau của các ống dẫn trong gan. Buộc sợi chỉ thứ hai ở phía trên cổng vào của ống tụy. Sau đó, tiêm từ từ dung dịch formalin 10% (~ 100 µL/100 g trọng lượng cơ thể) vào đường mật phía trên sợi chỉ đã buộc để ngăn chặn sự giãn nở của ống mật được thắt còn lại. Cho chuột ăn chế độ ăn bình thường và uống nước tự do để hồi phục [13], [35].
Xơ gan mật thứ cấp được ghi nhận 4 tuần sau thắt ống dẫn mật [13]. Sau 4 tuần, tiến hành thử thuốc. Kết thúc thúc thời gian hấp thu, lấy máu:
Máu cho xét nghiệm đếm tế bào máu được lấy bằng cắt đuôi. Máu dùng cho các xét nghiệm khác được lấy từ tĩnh mạch chủ. Đánh giá: [13]
Các xét nghiệm đông máu: đếm số lượng tế bào máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu), các giá trị PT, aPTT, TT.
Xét nghiệm chức năng gan: bilirubin, triglycerid, cholesterol, GOT, ALP, γ- GT.
Nồng độ vitamin K1 và K2 được đo bằng phương pháp của Hirauchi và cộng sự [13].
Kiểm tra mô học gan trên chuột: hình thành các vách xơ và sự tăng ống dẫn mật quá mức.
So sánh sự khác biệt giữa các nhóm nghiên cứu.
Các nghiên cứu khác: Akimoto và cộng sự (2005) đã cải tiến phương pháp này bằng cách cho chuột ăn chế độ ăn giàu dinh dưỡng để kéo dài thời gian sống cho chuột (tất cả các con chuột sống qua 31 ngày và có một số con sống tới ngày 50) [13].
3.4.4.4. Mô hình gây bệnh gan bằng thuốc. Nguyên tắc:
Phenobarbital (PB) là một chất cảm ứng CYP2B, và chỉ cần tiêm một liều duy nhất tiêm đã gây kéo dài thời gian đông máu trên chuột (Lox và Frederick, 1983), tuy nhiên, theo Mochizuki (2008) cho thấy dùng liều cao kéo dài trong 2 tuần sẽ cho những ảnh hưởng rõ rệt hơn [59].
Dựa vào nguyên tắc trên, gây mô hình chuột có bệnh gan bằng PB đường uống dài ngày được sử dụng để nghiên cứu tác dụng của thuốc lên động vật có rối loạn chảy máu.
Cách tiến hành:
Động vật: chuột đực Sprague-Dawley (SD), được nuôi 1 tuần để thích nghi. Chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô:
+ Lô chứng: không được dùng PB, cho dùng nước muối sinh lý. + Lô chứng bệnh: dùng PB, cho dùng nước muối sinh lý.
+ Lô thử: dùng PB, cho dùng thuốc thử nghiệm ở các mức liều khác nhau. Gây bệnh gan bằng thuốc: cho chuột dùng phenobarbital (PB) liều 100 mg – 150/ kg/ ngày, cho dùng qua đường uống trong 14 ngày [59], [60]. Thử thuốc vào ngày cuối cùng dùng PB. Kết thúc thời gian hấp thu thuốc hoặc nước muối sinh lý, tiến hành lấy máu qua động mạch chủ bụng dưới vào ống nghiệm chứa sẵn chất chống đông. Các mẫu được ly tâm (khoảng 1600xg trong 10 phút) để thu huyết tương.
Đánh giá:
Xét nghiệm đông máu: xác định thời gian prothrombin (PT), thời gian kích hoạt một phần thromboplastin (aPTT), fibrinogen, AT III, fibrinogen. Sử dụng
Thrombotest để xác định giảm các yếu tố đông máu liên quan vitamin K: VII, IX, X [60].
Kiểm tra chức năng gan: đo Aspartat aminotransferase (AST), alanin aminotransferase (ALT) và alkalin phosphat (ALP) bằng máy phân tích tự động [59].
Trọng lượng gan: cân chính xác sau khi cắt gan từ chuột.
Xác định lượng P450 gan: Xác định theo phương pháp quang phổ CO của Omura và Sato (1964), chuẩn bị microsom gan chứa khoảng 1 mg protein/ml, đem đo quang phổ CO trên một máy quang phổ U-3200. Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp mô tả bởi Lowry và cộng sự (1951). Tính toán cytochrome P450 trên trọng lượng protein microsom (nmol/mg protein) [59].
Phương pháp chuẩn bị microsom gan (cho thí nghiệm xác định P450): Cắt gan, ngâm trong dung dịch KCl 1.15% và đông lạnh ở -80oC. Sau đó, gan được làm tan băng và đồng nhất với dung dịch KCl 1.15% để đạt được hỗn dịch 25%. Ly tâm ở 9.000xg trong 20 phút để thu dung dịch microsom gan.
So sánh các kết quả giữa nhóm thử và nhóm chứng.