3.1.4.1. Mô hình tạo tổn thương gây xuất huyết não Nguyêntắc:
Chảy máu ở não xảy ra khi có tổn thương các thành mạch máu não, và khi đó, việc cầm máu là cực kỳ cần thiết nhưng rất khó để đạt đủ tác dụng cầm máu. Các mô hình gây ra tổn thương não bằng cách tạo vết rạch vào nhu mô não được dùng nghiên cứu về chảy máu ở não trên lâm sàng.
Mặt khác, xuất huyết và tụ máu ở não có thể được đo lường bằng MRI, và các tình trạng viêm, phù, xuất huyết và thoái hóa thần kinh so sánh qua hình ảnh mô bệnh học [24]. Chuột được gây tổn thương sọ não theo mô tả của Stahel và cộng sự (2000), của Habgood và cộng sự (2007) là những mô hình khả thi trong các nghiên cứu các thuốc cầm máu.
Cách tiến hành:
Động vật: sử dụng thỏ New Zealand có trọng lượng khoảng 2.5 – 3 kg. Chia ngẫu nhiên thành các lô:
+ Lô chứng: gây tổn thương não và cầm máu tại chỗ bằng dung môi pha thuốc hoặc dung dịch nước muối đẳng trương.
+ Lô so sánh: gây tổn thương não và cầm máu tại chỗ bằng thuốc cầm máu đã biết rõ cơ chế.
Phương pháp gây tổn thương:
Gây tổn thương não thỏ: đặt các con thỏ ở vị trí nằm nghiêng, rạch trên da đường rạch dài 3 cm ở giữa đường nối sọ-đuôi. Sau khi cắt bỏ màng xương, tạo 2 lỗ trên đường khớp vành (là một đường khớp của vòm sọ) dưới kính hiển vi phẫu thuật. Khắc nhẹ nhàng lên màng cứng, gây tổn thương vào sâu nhu mô với 4 mm chiều dài và 1 mm chiều rộng [24].
Gây chấn thương não chuột: rạch vết rạch trên hộp sọ, khoan bằng một mũi khoan phẫu thuật để tạo một lỗ khoan đường kính 4 mm, 1 mm phía bên và 1 mm phía sau thể bregma để lộ ra màng cứng. Cho một thanh kim loại nặng 250 g rơi xuống màng cứng từ độ cao 2 cm phía trên. Đóng vết rạch lại. Tiêm dưới da dung dịch buprenorphine để giảm đau. Cung cấp thức ăn và nước uống tự do [52].
Sau khi cầm máu đạt yêu cầu, các cạnh của màng cứng được khép lại mà không khâu. Đóng da phía trên lại.
Đánh giá kết quả:
Định lượng thể tích máu tụ trong não sau 24h: sử dụng chụp cộng hưởng từ T2 (MRI T2) là một cách để đo thể tích máu tụ nội sọ [48].
Đánh giá mức độ phù: Chụp MRI trên mặt phẳng đường khớp vành. Đánh giá dựa vào giá trị T1W và T2W của MRI.Mức độ phù được đánh giá thông qua sự giảm tín hiệu trên T1W và tăng tín hiệu trên T2W. Diện tích của khu vực phù được đo qua hình ảnh MRI.
Kiểm tra mô bệnh học: 24 giờ sau tổn thương, các con vật được giết bằng tiêm tĩnh mạch pentobarbital 100 mg/kg. Tách não để đánh giá mô bệnh học. Đánh giá: xuất huyết, phù nề quanh tế bào, viêm, và thoái hóa thần kinh. Mỗi thông số trên được phân loại theo các cấp độ 0: không; 1: nhẹ; 2: có ý nghĩa. Tính tổng số điểm trong mỗi nhóm và điểm trung bình cộng. So sánh giữa các nhóm.
3.1.4.2. Mô hình gây xuất huyết nội sọ (ICH) bằng collagenase
Nguyên tắc:
Khi bị xuất huyết nội sọ, nồng độ enzym collagenase tại chỗ tăng do được giải phóng từ các tế bào và các mô sau khi bị tổn thương. Tác dụng của enzym collagenase là phá vỡ thành mạch máu, làm máu rò rỉ vào các mô xung quanh. Từ những hiểu biết này, các mô hình gây xuất huyết nội sọ bắt chước ICH tự phát bằng cách sử dụng enzym collagenase tiêm tại chỗ với liều thích hợp [53], [55].
Các phương pháp này đã được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng. Illanes và cộng sự (2010) đã chỉ ra rằng chụp cộng hưởng từ (MRI) là một trị số đo lường cho khối lượng máu tụ nội sọ, cũng như đo lường mức độ phù ở não [36]. Foerch và cộng sự (2013), Lauer và cộng sự (2013) [48], Sun và cộng sự (2011) [84] cũng gây ICH trên chuột, tuy nhiên, phương pháp đo khối lượng máu xuất huyết bằng cách trực tiếp hơn: định lượng hemolobin trong máu xuất huyết ở não, đo kích thước máu tụ thông qua cắt lát não và chụp ảnh [8], [26].
Tiến hành:
Động vật: sử dụng chuột đực trưởng thành C57BL/6 hoặc CD-1, có trọng lượng khoảng 20 - 27g hoặc chuột Wistar, cả hai giống, có trọng lượng trung bình 240 ± 30g. Gây mê bằng halothan đường hô hấp (1.5% đến 2%) trong hỗn hợp oxy/không khí [26], [36].
Các con chuột được chia thành các lô:
+ Lô chứng: gây ICH và cho dùng dung môi pha thuốc hoặc dung dịch nước muối đẳng trương.
+ Lô thử: gây ICH và cầm máu tại chỗ bằng thuốc nghiên cứu.
+ Lô so sánh: gây ICH và cầm máu tại chỗ bằng thuốc cầm máu đã biết rõ cơ chế.
Mô hình này có thể sử dụng nghiên cứu tác dụng tại chỗ hay toàn thân của thuốc. Thử nghiệm tác dụng toàn thân yêu cầu tiêm thuốc trước khi gây chảy máu, thử nghiệm tại chỗ gây chảy máu trước, sau đó thử thuốc.
Phương pháp gây xuất huyết nội sọ chuột: đặt chuột vào khung rắn (Model 51650; Stoelting) để cố định chuột. Khoan một lỗ khoan với độ sâu 3.5 mm ở vị trí 0.5 mm phía trước và 2 mm phía bên so với vị trí thể bregma. Đặt một kim tiêm 10 µl vào thể vân còn lại ở độ sâu 3.5 mm tính từ hộp sọ. Sau đó, tiêm 0.3 ml dung dịch nước muối có chứa 0.045 – 0.075U collagenase type VII. Năm phút sau, rút kim, bịt kín các lỗ khoan bằng sáp xương và khâu da đầu lại. Phẫu thuật kéo dài từ 15 – 35 phút cho mỗi con chuột [26], [36], [55].
Đánh giá kết quả:
24h sau khi gây tổn thương, tùy vào từng yêu cầu của nghiên cứu mà có thể xác định các thông số sau:
Định lượng khối lượng máu xuất huyết nội sọ: sử dụng phương pháp quang phổ hemoglobin sau khi gây ICH. Khối lượng máu xuất huyết sau một khoảng thời gian xác định kể từ khi gây ICH [26], [48].
Phương pháp như sau: gây mê sâu bằng isofluran 5%. Bộc lộ và tách não chuột, chia thành bán cầu não trái và phải, được đặt trong ống thủy tinh có chứa 3ml đệm phosphat, thu lấy máu từ não. Tiến hành siêu âm để ly giải màng hồng cầu và tách lấy phần dung dịch bên trên, và cho vào thuốc thử Drabkins. Xác định tỉ lệ hấp thụ quang ở 540 nm, tính khối lượng xuất huyết não (cả 2 bán cầu) dựa vào đường cong tiêu chuẩn [26]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đo kích thước tụ máu của chuột: bộc lộ và tách não chuột, cắt lát 1mm. Chụp các hình ảnh của các lát cắt với một máy ảnh kỹ thuật số. Kích thước khối máu tụ được tính qua các hình ảnh bằng phần mềm ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/) [26].
Định lượng thể tích máu tụ trong não: phương pháp MRI như trên.
Đo độ phù não: sau khi chụp MRI, giết chuột. Gỡ não và tách thành hai bán cầu não. Cân riêng mỗi bán cầu bằng một cân phân tích điện tử để xác định trọng lượng ướt. Sau đó, cả hai bán cầu được sấy khô ở 70oC trong 48h và cân một lần nữa để xác định trọng lượng khô. Tính riêng các giá trị khối lượng máu tụ ướt và khô [36].
Tính toán lượng nước theo công thức sau: (WWc – DWc)/ WWc × 100%
+ WWc: trọng lượng ướt hiệu chỉnh: trọng lượng ướt của bán cầu trừ đi trọng lượng máu tụ ướt.
+ DWc: trọng lượng khô hiệu chỉnh: trọng lượng khô của bán cầu trừ đi trọng lượng máu tụ khô.
Lượng máu xuất huyết và kích thước khối máu tụ được so sánh giữa các nhóm với các t-test.