Nguyên tắc:
Máu chảy ra khỏi mạch máu (động mạch, tĩnh mạch, mao mạch) khi có các vết thương trên thành mạch và chỉ ngừng lại khi có sự hình thành thành nút tiểu cầu do kết tập tiểu cầu dẫn tới hình thành fibrin tại vết thương đó. Thuốc có tác dụng lên quá trình cầm máu làm rút ngắn thời gian máu chảy trên các mạch máu đều được coi là có tiềm năng cầm máu. Dựa trên nguyên tắc này có thể tạo các mô hình gây tổn thương các mạch máu để kiểm tra tác dụng cầm máu của các thuốc mới [91]. Cách tiến hành:
Động vật: sử dụng thỏ đực New Zealand trắng, trọng lượng 2 kg [32], hoặc chuột nhắt trắng, giống đực Wistar (WA) hoặc Sprague – Dawley, trọng lượng 250 – 300g [38], [91]. Chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô:
+ Lô chứng: gây tổn thương mạch máu, dùng nước muối sinh lý. + Lô thử: gây tổn thương mạch máu, dùng thuốc thử nghiệm.
+ Lô so sánh: gây tổn thương mạch máu, dùng thuốc cầm máu đã biết rõ cơ chế.
Mô hình này cũng có thể thử thuốc dùng toàn thân hoặc tại chỗ. Thử thuốc toàn thân khi gây tổn thương các mạch máu nhỏ và thử thuốc tại chỗ khi gây tổn thương trên các mạch máu lớn. Phương thức thử thuốc như mô hình gây tổn thương gan.
Trước khi gây tổn thương mạch máu, tiến hành gây mê các con vật (thỏ: tiêm bắp ketamin liều 50 mg và xylazin liều 20 mg và duy trì bằng natri pentobarbital liều 15 mg/kg thông qua tĩnh mạch biên ở tai; chuột: tiêm màng bụng natri pentobarbital liều 60 mg/kg).
Phương pháp gây tổn thương:
Gây tổn thương tĩnh mạch chủ dưới ở thỏ: rạch một vết rạch ở phần giữa bụng dưới. Cô lập tĩnh mạch chủ dưới khỏi các mô xung quanh, ít nhất 3 cm của mạch được đặt lên tấm nilon sáng màu để quan sát rõ vị trí gây tổn thương. Lưu lượng máu của tĩnh mạch chủ dưới tạm thời được giữ bởi 2 kẹp ở hai đầu. Thực hiện một vết rạch dọc dài 7 mm trên thành mạch đã chọn [32].
Gây tổn thương tĩnh mạch đùi: rạch da, bóc tách mô. Đâm vào phần giữa tĩnh mạch đùi sau bằng kim, tạo tổn thương có đường kính 0.6 mm [63].
Hình 3.4. Vị trí đâm kim và đường kính vết thương trên tĩnh mạch đùi [63].
Gây tổn thương tĩnh mạch cảnh ở thỏ: cô lập các tĩnh mạch cảnh khỏi các mô xung quanh. Dùng cây kim 23 gauge đâm vuông góc thành mạch. Máu chảy ra từ vết thương được thu vào dụng cụ đặt bên dưới tĩnh mạch [17].
Gây tổn thương động mạch chủ bụng trên chuột:
Rạch đường giữa bụng bằng kỹ thuật vô trùng, bộc lộ các phần sau phúc mạc và tiếp xúc động mạch chủ bụng. Tạo vết thương bằng các sử dụng một mũi dao phẫu thuật đâm vào động mạch chủ bụng, gần đến vị trí phân nhánh xương chậu [38].
Gây tổn thương động mạch đùi chuột: bộc lộc động mạch đùi. Cắt động mạch đùi bằng dao mổ, tiến hành cầm máu tại chỗ và đánh giá [96].
Gây tổn thương động mạch mạc treo: đặt chuột lên bàn ấm ở 37oC. Mổ bụng, nâng mạc treo ruột được lên để bộc lộ các động mạch mạc treo. Mạc treo được đặt trên trên một tấm nhựa và cung cấp liên tục dung dịch Tyrode ở 37oC. Dùng kim tiêm 25 gauge chọc một lỗ thủng trên động mạch. Xác định thời gian chảy máu đối với động mạch mạc treo nhỏ (đường kính ngoài 125 - 250μm) ở đường nối của mạc treo ruột với ruột [91].
Trong trường hợp không cầm máu được (máu vẫn chảy sau khi đã tiến hành dùng thuốc tại vết thương), cần phải khâu vết thương để đạt được yêu cầu cầm máu. Các con vật được cho ăn và uống nước đầy đủ để kiểm tra hình ảnh mạch máu sau một thời gian.
Đánh giá kết quả:
Tùy theo từng nghiên cứu, có thể đánh giá kết quả qua các thông số sau: Thời gian chảy máu của các con vật trong mỗi nhóm: thời gian chảy máu được đo bằng một đồng hồ bấm giờ, được định nghĩa là thời gian từ khi làm thủng mạch máu đến khi máu ngừng chảy [38]. Đối với các động mạch mạc treo: quan sát chảy máu qua kính hiển vi ở mức độ khuyếch đại 40x [91].
Khối lượng máu chảy: đặt giấy lọc dưới các vị trí tổn thương để thấm máu chảy xuống. Thay thế giấy lọc mỗi 15 giây một lần. Cân chính xác giấy lọc trước và sau phẫu thuật để tính toán khối lượng máu mất (như mô hình chảy máu tạng) [96].
Đánh giá tình trạng hẹp mạch và huyết khối trên thỏ: một tháng sau khi dùng thuốc, chụp x-quang máu lưu thông qua một đoạn tĩnh mạch nhất định (tiêm chất cản quang iodid thông qua các tĩnh mạch đùi phải). Đánh giá qua hình ảnh x-quang [32].
Đánh giá mô bệnh học: giết chuột vào ngày thứ 7 của nghiên cứu. Cắt mẫu 1 mm động mạch chủ bụng quanh vị trí vết thương để đánh giá. Cố định mẫu trong dung dịch formaldehyd đệm phosphat 10% trong 24h ở nhiệt độ phòng. Xử lý mô bệnh học, nhuộm màu và kiểm tra dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 40x.
Các tiêu chí đánh giá: mạch máu (viêm, hoại tử trung gian, hình thành nút fibrin, tập hợp hồng cầu), quanh mạch máu (viêm, hemosiderin, mô hạt). So sánh hình ảnh mô bệnh học dưới kính hiển vi của lô thử và lô chứng.