3.3.2.1. Mô hình gây giảm chức năng tiểu cầu bằng thuốc kháng tiểu cầu
Nguyên tắc:
Dưới tác động của thromboxan A2, ADP … tiểu cầu được hoạt hóa, các GP trên màng tiểu cầu gắn tiểu cầu với nội mạc và với các tiểu cầu khác. Các thuốc kháng tiểu cầu làm ức chế hoạt động của các chất hoạt hóa tiểu cầu làm giảm chức năng của tiểu cầu trong cầm máu. Aspirin và các thuốc NSAID làm giảm tổng hợp thromboxan A2, clopidogrel ức chế gắn ADP vào receptor của nó trên màng tiểu cầu, cản trở hoạt hóa receptor GPIIb/IIIa dẫn đến giảm kết tập tiểu cầu [5], [10]. Trên lâm sàng, xuất huyết nội sọ xảy ra với một phần ba bệnh nhân sử dụng thuốc kháng tiểu cầu (Foerch và cộng sự (2006), Stead và cộng sự (2010)).
Dựa vào các hiểu biết trên, có thể tạo mô hình làm giảm chức năng kết tập của tiểu cầu bằng cách sử dụng một hoặc kết hợp các tác nhân kháng tiểu cầu sau đó, đánh giá trên các mô hình chảy máu, đặc biệt là mô hình ICH. Các mô hình này phù hợp với bệnh lý chảy máu do quá liều thuốc kháng tiểu cầu trên lâm sàng, được sử dụng trong nghiên cứu tác dụng cầm máu của các thuốc.
Tiến hành:
Động vật: chuột nhắt trắng cả 2 giống, trọng lượng (210 – 270g). Chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô:
+ Lô chứng trắng: không được dùng bất kỳ thuốc gì.
+ Lô chứng bệnh: cho dùng các thuốc kháng tiểu cầu, sau đó, cho dùng dung môi pha thuốc.
+ Lô thử: cho dùng các thuốc kháng tiểu cầu, sau đó, cho dùng thuốc thử nghiệm.
+ Lô so sánh: cho dùng các thuốc kháng tiểu cầu, sau đó, cho dùng thuốc cầm máu đã rõ cơ chế đảo ngược tác dụng thuốc kháng tiểu cầu (như antidote oligonucleotide 1 (AO1) và β – cyclodextrin-containing polycation (CDP)).
Gây giảm chức năng tiểu cầu: cho uống acid acetylsalicylic với liều 10 mg/ kg mỗi 24 giờ trong 4 ngày [45].
Giảm chức năng tiểu cầu trong mô hình gây xuất huyết nội sọ (ICH): sử dụng aspirin liều 60 mg/kg mỗi 24 giờ, hoặc clopidogrel liều 22.5 mg/kg mỗi 24 giờ, hoặc cả hai thuốc, thông qua đường uống trong 3 ngày. Với nồng độ aspirin 0.4 mg/ml; clopidogrel 0.15 mg/ml, cho dùng trong 72h, Moni và cộng sự (2005) đã nghiên cứu được rằng tăng nồng độ thuốc kháng tiểu cầu cũng không thể giảm hoạt động của tiểu cầu hơn nữa [49].
Gây ICH bằng tiêm collagenase: tiến hành theo phương pháp đã nêu ở mục 2.1.2.
Đánh giá kết quả:
Sau khi gây giảm tiểu cầu, tùy thuộc vào yêu cầu của mỗi nghiên cứu mà có thể đánh giá các thông số sau:
Thời gian máu chảy và khối lượng máu chảy: tiến hành đo thời gian chảy máu đuôi chuột theo phương pháp đã nêu ở mục 2.1.5 Lượng máu chảy được thu lại và đo hemoglobin bằng cách đo độ hấp thụ [45].
Tính % khối lượng máu chảy ở lô được điều trị so với các lô không được điều trị.
Đánh giá kết tập tiểu cầu trên in vitro: sử dụng máy đo kết tập tiểu cầu tự động, nguyên lý là: khi cho chất kích hoạt tiểu cầu như ADP, collagen vào huyết
tương thì tiểu cầu sẽ bị kết tập không hồi phục, làm thay đổi giá trị mật độ quang hoặc điện trở của dòng điện. Mức độ kết tập tiểu cầu được phản ánh qua mức độ thay đổi mật độ quang hoặc điện trở. Các kết quả đầu ra bao gồm: độ kết tập tối đa, độ dốc của đường cong kết tập, thời gian xuất hiện kết tập, thời gian từ khi xuất hiện kết tập đến khi đạt kết tập tối đa. So sánh giá trị của nhóm thử và nhóm chứng [11].
Định lượng ATP giải phóng từ tiểu cầu: đo bằng phát quang sinh học (Ingerman - Wojenski và cộng sự (1983). Thêm vào mỗi mẫu 100 µl luciferin- luciferase ngay sau khi kết thúc thử nghiệm tập hợp. Luciferin là một chất sẽ phát ra ánh sáng khi có ATP trong dung dịch. Thay đổi ánh sáng phát xạ phát hiện ở nồng độ nhỏ nhất là 2 nM ATP, do đó, trong mỗi mẫu được cho thêm lượng 2 nM ATP. Lượng ATP do thuốc gây giải phóng từ tiểu cầu trong các mẫu được tính bằng cách so sánh với đường cong chuẩn của 2 nM ATP. Nồng độ ATP được đưa ra với đơn vị là nM. So sánh nồng độ ATP giữa các mẫu [25].
Định lượng serotonin (5-HT): sử dụng phương pháp ELISA. Các mẫu máu sau khi được lấy từ các chuột thử nghiệm được acyl hóa với acetic anhydrid trong aceton. Cho các mẫu vào đĩa 96 giếng. Thêm kháng huyết thanh thỏ (IgG thỏ) và ủ qua đêm ở 4oC. Mẫu được đọc ở 405 nm trên đầu đọc ELISA (Molecular Devices Union City, CA, USA). Số lượng 5-HT được định lượng theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất và phân tích bằng phần mềm Origin (Microcal software, Northampton, MA) [78].
Ngoài ra, tùy nghiên cứu mà có thể xác định thêm các thông số: hoạt tính enzyme cyclooxygenase, định lượng thromboxan A2, đo độ dính tiểu cầu [83].
So sánh sự khác nhau giữa các nhóm nghiên cứu.
Các mô hình khác: Hasgul và cộng sự (2012) cũng cho uống aspirin trong CMC liều 400 mg/ kg, sau 16 giờ nhịn ăn, cho uống trong 2 tuần, để gây chảy máu tiêu hóa, thử thuốc cầm máu [43].
3.3.2.2. Mô hình giảm chất lượng tiểu cầu do đột biến gen làm giảm yếu tố von- Willebrand.
Nguyên tắc:
Yếu tố von-Willebrand là một “chất keo sinh học” gắn tiểu cầu với collagen lớp tế bào nội mạc, và cũng là yếu tố vận chuyển FVIII trong huyết tương [21], [68]. Sự thiếu hụt về số lượng và chức năng của vWF gây bệnh von -Willebrand, thiếu hụt vWF sẽ kéo theo sự thiếu hụt của yếu tố VIII, do vậy, trong bệnh von Willebrand thì vWF và yếu tố VIII đều giảm.
Gen vWF lớn, có 52 exon, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể 12 ở vị trí 13.3. Đột biến bằng cách xóa các nucleotid trong gen vWF gây giảm số lượng hoặc hoạt tính của vWF. Có hơn 300 đột biến ở gen vWF đã được tìm thấy có thể gây bệnh von-Willebrand [21]. Trong đó, thường gây bệnh trên chó và chuột bằng các mô hình sau:
Chó bệnh von-Willebrand: chó Scotlan Terrier là một mô hình bệnh von- Willebrand được biết đến lần đầu tiên vào năm 1978. Đột biến gây bệnh được gây ra bằng cách xóa đơn nucleotid trong exon 4 của gen von-Willebrand dẫn đến không phát hiện được mRNA và protein của VWF. Sau đó, các con chó được nhân giống để tạo bệnh von- Willebrand nghiêm trọng (type 3) có thiếu hai alen, hoặc nhẹ (type 1) có thiếu một bản sao của gen.
Chuột bệnh von-Willebrand: không giống như người, nồng độ von- Willebrand ở chuột là rất khác nhau. Chủng chuột thuần RIIIs/J được nghiên cứu năm 1990 có mức VWF là ~50% mức bình thường đã được đề xuất làm mô hình bệnh von-Willebrand type 1 cho người. Người ta xác định được các locus Mvwf trên nhiễm sắc thể 11 liên quan đến nồng độ thấp của VWF. Locus này tạo nên tính đa hình trong gen Galgt, là một gen glycosyltransferaza. Gen Galgt bị đột biến làm bất thường tế bào nội mô, thay đổi glycosyl hóa đối với VWF gây ra giảm nồng độ của VWF trên giống RIIIS/J [71]. Chuột dòng RIIIS/J kéo dài thời gian chảy máu (hơn 15 phút) so với những con chuột C57BL/6J bình thường (1.8 phút) và các dòng khác của chuột. Nồng độ yếu tố VIII hoạt hóa và kháng nguyên von-
Willebrand chiếm 1/3 – 1/2 mức độ bình thường. Huyết tương chuột RIIIS/J chứa đầy đủ các multimer của yếu tố von Willebrand, mặc dù nồng độ mỗi multimer đều thấp hơn so với chuột bình thường [87].
Những con vật này được lưu giữ giống trong phòng thí nghiệm để thực hiện các nghiên cứu đánh giá tác dụng của thuốc lên động vật mắc bệnh von-Willebrand. Tiến hành:
Sử dụng chuột dòng RIIIS/J đã bị bệnh von-Willebrand, từ 2 – 8 tháng. Các con vật được chia ngẫu nhiên vào các lô:
+ Lô chứng: cho dùng nước muối sinh lý. + Lô thử: cho dùng thuốc nghiên cứu.
+ Lô so sánh: cho dùng thuốc đã biết rõ cơ chế là làm tăng vWF (như interleukin 11).
Lấy máu: gây mê chuột, lấy máu chuột từ đám rối tĩnh mạch sau hố mắt vào ống nghiệm chứa sẵn chất chống đông. Tiến hành đánh giá một số chỉ tiêu.
Đánh giá kết quả:
Xác định thời gian chảy máu và khối lượng máu chảy: thời gian chảy máu đuôi chuột được tiến hành theo mô tả của Novak và cộng sự (như mục 2.2.5) [87], và thời gian chảy máu da chuột (tiến hành theo mô hình mục 2.1.4).
Xác định công thức máu [21] và các xét nghiệm đông máu (aPTT, PT) [87]. Đo mức độ kết tập tiểu cầu: như mô hình ức chế kết tập tiểu cầu bằng thuốc kháng tiểu cầu [53].
Nồng độ kháng nguyên vWF: ly tâm máu trong 15 phút tại 2500g ở nhiệt độ phòng để lấy huyết tương. Sử dụng xét nghiệm miễn dịch liên kết enzym (ELISA) để xác định nồng độ vWF, đo quang ở bước sóng 490 nm, sử dụng mẫu chuẩn là huyết tương gộp từ 10 con chuột bình thường [21], [22].
Xác định hoạt độ của FVIII: chống đông cho huyết tương bằng EDTA. Pha loãng huyết tương với tỉ lệ 1:40. Cho huyết tương vào ống nghiệm 37oC, sau 5 phút, khởi động quá trình đông máu bằng việc cho thêm CaCl2. Theo dõi quá trình đông máu trực quan (ở 37o
FVIII trong các mẫu được xác định bằng phương pháp đường chuẩn (trục tung là thời gian đông máu, trục hoành là hoạt độ yếu tố VIII). Sử dụng mẫu thử là huyết tương có hoạt độ yếu tố VIII đã biết rõ (mức bình thường) [2], [21].
So sánh giá trị giữa các nhóm nghiên cứu.
3.3.2.3. Mô hình giảm các hạt trong tiểu cầu. Nguyên tắc:
Năm 1988, Novak và cộng sự đã nghiên cứu được có mối tương quan giữa giảm sắc tố và thiếu hụt các hạt của tiểu cầu. Tám trong 26 đột biến sắc tố có giảm các hạt của tiểu cầu làm thời gian chảy máu kéo dài. Trong số đó, có 2 con chuột được miêu tả kỹ càng là Sandy và Cocoa.
Sandy có đột biến làm giảm độ đậm sắc, xảy ra trên dòng DBA/2J. Kiểm tra di truyền cho thấy nguyên nhân là do đột biến gen lặn trên NST số 13 gần locus của gen cr và Xt. Đây là kiểu đột biến thứ 10 trong các đột biến sắc tố chuột kèm các khuyết tật trong melasosom, lysosom và các hạt của tiểu cầu [86].
Cocoa có đột biến làm nhạt màu lông, xảy ra trên dòng C57BL/10J thuần, được tạo ra ở phòng thí nghiệm Jackson vào năm 1978. Đột biến gen ở Cocoa là đột biến gen lặn nằm ở cuối tâm động của nhiễm sắc thể số 3 gần locus Car-2 [62].
Đột biến làm chuột Sandy và Cocoa giảm sắc tố ở mắt và lông đồng thời kéo dài thời gian chảy máu do thiếu các hạt trong tiểu cầu (giảm serotonin tiểu cầu, giảm tần suất các hạt khi quan sát dưới kính hiển vi). Mức độ serotonin của tiểu cầu rất thấp mặc dù hoạt động của ATP là bình thường. Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, số lượng các hạt của tiểu cầu giảm đáng kể [62], [86].
Chuột đột biến Sandy và Cocoa có tình trạng bệnh lý tương tự hội chứng Hermansky-Pudlak trên người, chúng cũng là mô hình thích hợp cho hội chứng này. Novak (1984, 1988) [62], [62], Reddington (1987), Lages (1987), Witkop (1989), Weiss (1979), đều cho rằng gây đột biến giảm các hạt của tiểu cầu ở chuột và ở người là đồng nhất. Các con chuột này được nuôi và giữ giống trong phòng thí nghiệm.
Động vật: sử dụng một trong hai dòng chuột sau để nghiên cứu tác dụng của thuốc lên tiểu cầu đã giảm chức năng (giảm các hạt trong tiểu cầu):
Chuột Sandy (SDY), chủng DBA/2J, được tạo ra trong phòng thí nghiệm Jackson năm 1983, con giống được duy trì trong ngân hàng giống của phòng thí nghiệm Jackson.
Chuột C57BL/10J từ 2 – 5 tháng tuổi, có đột biến trên gen coa, dạng đồng hợp tử (coa/coa).
Các con chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô:
+ Lô chứng: cho sử dụng dung môi pha thuốc hoặc nước muối sinh lý. + Lô thử: cho sử dụng thuốc nghiên cứu.
Đánh giá kết quả: [61], [62], [86]
Thời gian chảy máu: xác định thời gian chảy máu đuôi theo mô hình cắt đuôi ở mục 2.1.5.
Xác định số lượng tiểu cầu: tiểu cầu được đếm sau khi pha loãng với dung dịch amoni oxalat 1% theo phương pháp của Brecher và Cronkite.
Định lượng serotonin chứa trong tiểu cầu: Tiểu cầu được cho vào 1 ml nước cất và ly giải. Nồng độ serotonin được xác định theo phương pháp huỳnh quang theo Crosti & Luchelli (1962) (sử dụng bước sóng kích hoạt tại 295 nm và phát xạ tại 540 nm, định lượng bằng cách so sánh huỳnh quang của chất chuẩn serotonin creatine sulfat) [61].
Đo kết tập tiểu cầu: lấy máu, sử dụng các chất gây kết tập tiểu cầu là collagen và ristocetin, đo kết tập tiểu cầu tại 37o
C, bằng phương pháp đo điện trở sử dụng máy đo kết tập tiểu cầu trong máu toàn phần, model 500. Đo ATP được tiết ra từ tiểu cầu bằng cách kết hợp với luciferin – luciferase, đo quang và so sánh với dãy các nồng độ ATP chuẩn.
Đếm số lượng hạt trong tiểu cầu: tiểu cầu không nhuộm màu, làm khô trên lưới carbon. Kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử Hitachi H-600 tại 50kV, chụp ảnh tiểu cầu phóng đại lên 12000 lần. Đếm số lượng hạt chứa trong tiểu cầu có kích thước > 50 nm. Tính giá trị trung bình.
So sánh giá trị giữa các nhóm nghiên cứu.
3.4. Mô hình gây rối loạn các yếu tố đông máu huyết tƣơng
Đông máu là một quá trình toàn vẹn, yêu cầu sự có mặt và tham gia của tất cả các yếu tố đông máu, vậy nên, thiếu hụt các yếu tố đông máu làm máu không đông được, dẫn đến chảy máu kéo dài. Dựa trên nguyên tắc này, các nghiên cứu gây thiếu hụt một hoặc nhiều yếu tố đông máu để đánh giá tác dụng của thuốc cầm máu.
3.4.1. Mô hình giảm các yếu tố đông máu huyết tương bằng heparin.
Nguyên tắc:
Heparin có tác dụng chống đông máu nhanh cả in vitro và in vivo. Bình thường trong máu antithrombin III có tác dụng chống đông máu do làm mất hiệu lực của thrombin III và các yếu tố đông máu IX, X, XI, XII hoạt hóa. Khi có mặt heparin thì nó sẽ tạo phức với antithrombin III làm tăng tác dụng của antithrombin III lên 1000 lần, do đó, các yếu tố đông máu và thrombin mất nhanh hiệu lực làm máu không đông được [5], [10].
Heparin phân tử lượng thấp (LMWHs) không ức chế thrombin mà chỉ ức chế yếu tố X hoạt hóa, do đó, trong các xét nghiệm đông máu, LMWHs không làm thay đổi aPTT, nhiều, chỉ thay đổi hoạt tính của anti-Xa [10].
Dựa vào các nguyên tắc trên, các nghiên cứu đã sử dụng heparin cả dạng UFH và LMWHs tạo ra các mô hình thiếu hụt các yếu tố đông máu, sử dụng nghiên cứu tác dụng của thuốc.
Cách tiến hành:
Động vật: sử dụng chuột đực Sprague-Dawley có trọng lượng khoảng 250 - 274g. Chuột được chia ngẫu nhiên vào các lô: [47]
+ Lô chứng bệnh: gây giảm yếu tố đông máu bằng UFH/LMWH và cho dùng nước muối sinh lý.
+ Lô thử: gây giảm yếu tố đông máu bằng UFH/LMWH và cho dùng thuốc thử nghiệm.
+ Lô so sánh: gây giảm yếu tố đông máu bằng UFH/LMWH và cho dùng thuốc cầm máu đã biết cơ chế làm tăng các yếu tố đông máu trên (như protamin, yếu tố X).
Gây giảm các yếu tố đông máu bằng heparin: tiêm tĩnh mạch đuôi một trong hai chất gây giảm yếu tố đông máu sau:
+ Heparin (UFH) liều 2.0 mg/kg duy nhất + Enoxaparin liều 2.0 mg/kg duy nhất.
Năm phút sau, cho dùng thuốc hoặc nước muối sinh lý, và tiến hành các thử nghiệm sau: [47]
Gây chảy máu bằng cắt đuôi chuột: kỹ thuật như mục 2.1.5.
Gây chảy máu bằng kẹp tĩnh mạch: sau khi hoàn thành thử nghiệm chảy máu đuôi chuột, bộc lộ tĩnh mạch chủ bụng bên phải. Đo lưu lượng máu bằng một đầu dò Doppler. Sau đó, kẹp các tĩnh mạch trong 1 phút và phục hồi ít nhất 5 phút trước