Nguyên tắc:
Dựa trên nguyên tắc như mô hình gây chảy máu các mạch máu. Sử dụng một vết rạch tiêu chuẩn bằng các thiết bị đảm bảo sự chính xác về chiều dài và chiều rộng của vết rạch vào niêm mạc của con vật sẽ phát hiện được bất thường của hiện tượng đông máu hoặc tác dụng của một thuốc lên quá trình đông máu [58].
Klement và cộng sự (1998) đã mô tả một mô hình chảy máu ở tai thỏ được gây mê, kiểm tra lượng máu mất bằng cách ly giải hồng cầu và định lượng hemoglobin [41]. Forsythe và Willis (1989) đã mô tả phương pháp sử dụng mô hình tạo vết rạch trên niêm mạc chó để nghiên cứu các thuốc cầm máu trên cơ sở phân tích thời gian chảy máu niêm mạc.
Cách tiến hành
Động vật: sử dụng chó ở các độ tuổi khác nhau, cả 2 giống [58], hoặc thỏ trắng New Zealand ở cả hai giống, trọng lượng khoảng 2.9 – 3.8 kg [39], [41]. Chia ngẫu nhiên các con vật thành các lô:
+ Lô chứng: dùng nước muối sinh lý và gây tổn thương. + Lô thử: dùng thuốc thử nghiệm và gây tổn thương.
+ Lô so sánh: dùng thuốc cầm máu đã rõ cơ chế và gây tổn thương.
Mô hình này có thể sử dụng nghiên cứu tác dụng toàn thân hay tại chỗ của thuốc. Trong trường hợp thử tác dụng toàn thân, cho con vật uống/ tiêm thuốc trước khi gây tổn thương. Trường hợp thử tác dụng tại chỗ, dùng thuốc lên vị trí đã rạch. Phương pháp gây tổn thương:
Gây tổn thương niêm mạc mũi thỏ: sau khi gây mê, sử dụng một lưỡi dao sắc, rạch đường rạch dài khoảng 1 cm trên niêm mạc của vách ngăn trong mũi của thỏ [39].
Gây tổn thương niêm mạc lưỡi chó: đặt con vật nằm bên hoặc vị trí xương ức, môi trên được lộn ra ngoài. Gắn miếng gạc xung quanh cả hàm dưới và hàm trên mõm. Dùng một lưỡi dao rạch một vết rạch tiêu chuẩn vuông góc với môi, ngay phía trên răng hàm trên, hoặc sử dụng thiết bị Simplate (được Forsythe và
Willis miêu tả năm 1989): đặt thiết bị lên niêm mạc, song song với lề môi, kích hoạt thiết bị [58], [91].
Gây tổn thương trên tai thỏ: cạo lông vùng tai và nhúng tai trong một cốc thủy tinh có chứa 1 lít dung dịch nước muối, duy trì ở 37oC và luôn được khuấy duy trì nhiệt độ. Đưa tai ra khỏi nước và dùng lưỡi dao Bard-Parker số 11, rạch 5 vết rạch sâu lên tai (qua tất cả các lớp của da). Ngay lập tức cho tai vào cốc đựng nước muối [41].
Gây tổn thương trên da: đối với chuột, gây mê, cạo phần lông dưới chân. Thực hiện một vết rạch tiêu chuẩn (dài 5mm, sâu 1mm) bằng một thiết bị tự động. Mỗi 15s, áp 1 giấy lọc vào vết thương trong 5s, cho đến khi máu không còn chảy nữa. Thời gian chảy máu được xác định sau 15s áp miếng giấy lọc cuối cùng [68]. Đối với thỏ: gây mê, tạo 4 vết rạch lên vùng da lưng thỏ, mỗi vết dài 10 cm, tiến hành cầm máu tại chỗ [97].
Gây tổn thương mô mềm: tạo vết thương trên đùi chuột cống trắng bằng cách dùng dao mổ cắt, rạch cơ đùi chuột cống một vết thương sâu 0.5 cm, dài 1.5 cm [8]. Đánh giá kết quả
Thời gian chảy máu: có hai cách hay dùng: hoặc sử dụng đồng hồ bấm giờ, bấm thời gian từ khi rạch đến khi vết rạch chấm dứt chảy máu [91], hoặc thấm máu vào một vòng giấy lọc đặt dưới vết rạch 1-2 mm cho đến khi máu ngừng chảy, thay đổi vị trí của giấy lọc mỗi 15s. Thời điểm được xác định là kết thúc chảy máu khi mà giấy lọc không còn thêm vết màu đỏ của máu [58]. Thời gian bình thường của cháy máu niêm mạc lưỡi chó từ 2 – 4 phút [91].
Khối lượng máu chảy: sau thời gian 5, 10, 20 và 30 phút từ khi gây tổn thương, mỗi thời điểm lấy 10 ml dung dịch nước muối (chứa máu). Tách hồng cầu bằng cách ly tâm ở 2000g trong 10 phút ở 23oC, bỏ phần dịch bên trên. Cho nước muối vào phần tế bào máu này tạo hỗn dịch thể tích 1 ml, cho 10 µl zapaglobin vào để ly giải các tế bào, chuyển hemoglobin thành cyanmethemoglobin. Đo quang các mẫu tại bước sóng 540 để định lượng hemoglobin. So sánh các giá trị khối lượng máu mất tại mỗi thời điểm giữa các lô [41].
Kiểm tra mô bệnh học: một mẫu sinh thiết khoảng 0.5 cm, chứa cả chỗ rạch được lấy sau 10 phút kể từ khi chấm dứt chảy máu. Cố định các mẫu trong dung dịch formaldehyd 10%. Cắt 2 mẫu với độ dày mỗi mẫu là 5mm. Nhuộm và kiểm tra các mẫu dưới kính hiển vi ánh sáng. Đánh giá về: fibrin trên vết rạch và hồng cầu thoát mạch. So sánh hình ảnh giữa lô thử và lô chứng [39], [97].
So sánh giá trị thu được giữa các lô thỏ nghiên cứu, phân tích thống kê dựa trên Student’s t-test.