3. Những đóng góp mới của đề tài
2.2.1.2. Phương pháp định lượng
Xác định hoạt độ xylanasebằng phương pháp DNS theo Miller (1999). Hoạt độ xylanase được xác định theo phương pháp của Bailey, 1992.
Phương pháp DNS
a. Chuẩn bị hóa chất
* Dung dịch DNS
- 10g Dinitrosalicylic axit hòa tan trong 400ml nước cất. - Bổ sung từ từ 150 ml dung dịch NaOH (1M), khuấy nhẹ.
- Bổ sung 1,87g crystal phenol, 0.5g Na2SO4 và K - Na tatrat tetrahydrat (Rochelle salt).
- Bổ sung nước cất đến 1000ml, lọc qua giấy và bảo quản trong bình tối màu ( dung dịch bền trong 2 tháng).
* Dung dịch cơ chất xylan 1% trong tris HCl 0.05 M, pH 7.0.
b. Cách tiến hành
Thực hiện phản ứng trong ống eppendoff.
- Nhỏ 225 μl dịch enzyme vào ống eppendoff, giữ 5 phút trong bể ổn nhiệt 50oC.
- Bổ sung 225 μl cơ chất 1% đã đạt nhiệt độ 50oC (ủ trong 30 phút ở 50oC) - Bổ sung 1350 μl dung dịch DNS, đun sôi 5 phút và làm lạnh nhanh dưới vòi nước chảy.
- Đo độ hấp phụ ở bước sóng 500nm.
- Đối chứng âm: bổ sung dung dịch DNS vào dịch enzyme để bất hoạt, sau đó thêm cơ chất.
c. Dựng đường chuẩn
- Đường xylose sấy khô trong 5 giờ ở 80oC.
- Làm dãy pha loãng dung dịch xylose trong nước ở các nồng độ(mg/l): 0,2; 0.4; 0.6; 0.8; 1; 1.2; 1.4; 1.6; 1.8 và 2.
- Hòa 300 μl mỗi dung dịch đường ở dãy pha loãng trên với 900 μl dung dịch DNS, đun sôi trong 5 phút và làm lạnh nhanh bằng nước đá để làm bền màu.
- Đo độ hấp phụ ở bước sóng 500nm (lấy nước cất làm giá trị blank 0,00). Với mỗi nồng độ lặp lại 2 lần.
43 Nồng độ
Xylose (mg/l) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
Độ hấp phụ 0 0.245 0.461 0.656 0.910 1.070 1.287 1.506 1.747 1.960 2.197 Từ kết quả trên ta dựng được đồ thị đường chuẩn độ hấp phụ OD theo nồng độ đường xylose,trong đó y là giá trị OD, x là nồng độ xylose (mg/l).
Xác định hoạt độ của xylanase
Một đơn vị hoạt độ của enzyme xylanase là lượng enzyme giải phóng đường khử với tốc độ 1μmol/ phút dưới điều kiện của thí nghiệm. Hoạt độ của enzyme được xác định theo công thức:
X × 1000 × 5 × 20 Hoạt độ U/ml hoặc (U/g) = ——————— 150 × 10
Trong đó: - X là lượng đường khử tính theo đường chuẩn
- X × 1000 là lượng đường khử theo đường chuẩn đổi ra µl (hoặc µg)
- 5 là lượng đường khử trong 1ml (hoặc 1g) phản ứng - 20 là hoạt độ xylanase tính theo 1ml enzyme
- 150 là khối lượng phân tử của xylose - 10 là thời gian ủ của phản ứng (phút)
44
Pha các dung dịch Na2CO3 2% (pha trong NaOH 0,1N), CuSO4 1%, K.Na.tartar.4H2O 1% theo tỷ lệ 98:1:1 (v:v:v), dung dịch tạo thành ký hiệu là WS1. Thuốc thử Foline được pha loãng 4 lần, gọi là dung dịch WS2.
Hỗn hợp phản ứng gồm:
0.2 ml mẫu enzyme (dịch trong sau ly tâm); 2.1 ml WS1; 0.2 ml WS2.
Trộn đều, đem ủ trong bể ổn nhiệt ở 37oC trong 15 phút, đo OD ở bước sóng 750nm. Tính đơn vị hoạt độ quốc tế U.