3. Những đóng góp mới của đề tài
3.3. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
3.3.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống
3.3.1.1. Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng
Chủng vi khuẩn B2 H 2 được nuôi cấy trên 5 môi trường khác nhau: V1, V2, V3, V4, V5 và các chủng xạ khuẩn 118 được nuôi cấy trên 5 môi trường khác nhau: X1, X2, X3, X4, X5, ở nhiệt độ 40°C, trong 2 ngày, sau đó, xác định khả năng sinh trưởng và hoạt tính xylanase. Kết quả được thể hiện ở hình sau:
61
(a)
(b)
Hình 3.5. Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme
a- Chủng B2H2; b- Chủng 118
Kết quả cho thấy, cả hai chủng đều sinh trưởng trên cả 5 môi trường. Tuy nhiên, trên môi trường V5, chủng B2H2 sinh trưởng tốt nhất (OD sau nuôi: 1.917; VPG xylan: 26 mm) ; chủng 118 sinh trưởng tốt nhất trên môi trường X2 (Sinh khối: 9.05 g/l; VPG xylan: 28 mm). Trên 4 môi trường còn lại, hoạt độ xylanasecủa chủng B2H2 khá cao và đồng đều (hoạt độ từ 21 - 25), nhưng chủng 118 lại có sự chênh lệch lớn (VPG xylan từ 15 - 25mm). Từ đó, chúng tôi đã chọn được môi trường thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của 2 chủng là: môi trường V5 cho chủng
62
B2H2 và môi trường X2 cho chủng 118. Kết quả này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp sau.
3.3.1.2. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng
Các chủng được nuôi trên môi trường thích hợp và đặt ở các nhiệt độ từ 25, 30, 35, 45, 50, 55oC. Sau 2 ngày xác định khả năng sinh trưởng và hoạt độ enzyme.
(a)
(b)
Hình 3.6. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme
a- Chủng B2H2; b- Chủng 118
Kết quả trong hình 3.6 cho thấy, các chủng đều sinh trưởng được khi nuôi lắc ở dải nhiệt độ từ 25 đến 55oC, và sinh trưởng mạnh nhất ở nhiệt độ nuôi là 40oC. Do đó, nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của các chủng nghiên cứu là 40oC.
63
3.3.1.3. pH thích hợp cho sự sinh trưởng
Sau 2 ngày nuôi cấy chủng vi sinh vật trên môi trường dịch thể thích hợp, ở 40oC, thu dịch enzyme và xác định khả năng sinh trưởng và tổng hợp enzyme của 2 chủng.
(a)
(b)
Hình 3.7. pH thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme
a- Chủng B2H2; b- Chủng 118
Kết quả ở hình 3.7 cho thấy, xylanase do cả 2 chủng nghiên cứu sinh ra đều không hoạt động khi pH môi trường dưới 4 và có hoạt độ ở pH trong dải từ 4 đến
64
trên 9. Cả hai chủng B2H2 và 118 đều đạt hoạt độ cao nhất ở giá trị pH7 và giảm nhẹ ở pH 6. Hoạt độ xylanase giảm dần khi pH lớn hơn hoặc nhỏ hơn 7.
3.3.1.4. Thời gian thích hợp cho giống khởi động
Chủng B2H2 được nuôi khởi động trên môi trường canh thang, sau 8h nuôi lắc ở nhiệt độ và pH thích hợp, bắt đầu thu dịch, cứ sau 8h lại thu dịch một lần và đo OD sau nuôi để xác định mật độ tế bào. Chủng xạ khuẩn 118 được nuôi lắc khởi động trên môi trường YG ở nhiệt độ và pH thích hợp, sau 24h nuôi lắc bắt đầu thu dịch và cứ sau 6h lại thu dịch một lần và cân sinh khối.
(a)
(b)
Hình 3.8. Thời gian thích hợp cho giống khởi động
65
Kết quả trong hình 3.8 cho thấy, thời gian nuôi khởi động chủng B2H2 thích hợp nhất là 24h. Sau 24h mật độ tế bào giảm dần. Thời gian nuôi khởi động chủng 118 thích hợp nhất là 42h, tại đó sinh khối thu được là cao nhất. Sử dụng kết quả này cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp.
3.3.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp
3.3.2.1. Lựa chọn cơ chất
Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn sau 4 ngày nuôi trên các cơ chất g ạo, ngô, cám, malt, bột đâ ̣u tương (BĐT) tại 40oC, dịch chiết enzyme thô đươ ̣c đi ̣nh tính và đi ̣nh lượng để xác đi ̣nh khả năng sinh enzyme . Kết quả được thể hiê ̣n trong hình 3.9:
Hình 3.9. Cơ chất thích hợp cho quá trình tổng hợp xylanase của 2 chủng 118 và B2H2
Kết quả trong hình 3.9 cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn đều sinh trưởng được trên 5 cơ chất xốp. Đối với chủng vi khuẩn B2H2, hoạt độ xylanasethu được đạt cao nhất trên cơ chất malt (2154 U/g), tiếp theo là trên cơ chất gạo (587 U/g). Đối với chủng xạ khuẩn 118, hoạt độ xylanase thu được cao nhất trên cơ chất gạo (2386 U/g ), và thấp nhất trên cám gạo (184 U/g).
3.3.2.2. Lựa chọn độ ẩm thích hợp
Chủng vi khuẩn được nuôi trên xốp malt và chủng xạ khuẩn được nuôi trên xốp gạo ở các độ ẩm từ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70%. Sau 3 ngày, chiết dịch enzyme, tiến hành định tính và định lượng.
66
Theo kết quả hình 3.10 ta thấy, cả hai chủng vi khuẩn và xạ khuẩn đều tổng hợp enzyme xylanase tốt nhất ở độ ẩm 50%. Tuy nhiên ở chủng 118, khi độ ẩm đạt 40 và 60%, hoạt độ xylanase thu được vẫn khá cao và xấp xỉ bằng hoạt độ ở độ ẩm 50%, còn chủng B2H2 thì hoạt độ xylanase chênh lệch khá nhiều, khi độ ẩm là 40% hoạt độ xylanase thu được chỉ bằng 61% so với ở độ ẩm 50%.
(a)
(b)
Hình 3.10. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tổng hợp enzyme xylanase
67
3.3.2.3. Lựa chọn thời gian nuôi cấy
Chủng vi khuẩn B2H2 và chủng xạ khuẩn 118 được nuôi xốp trên cơ chất thích hợp, ủ ở 40oC. Thu dịch và xác định hoạt độ xylanase sau thời gian nuôi lần lượt từ 1 đến 7 ngày. Kết quả được thể hiện trong hình 3.11:
(a)
(b)
Hình 3.11. Thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase
68
Theo kết quả của hình 3.11 ta thấy, đối với cả hai chủng thời gian nuôi cấy tốt nhất là 3 ngày, chủng B2H2 đạt hoạt tính 2154 U/g còn chủng 118 đạt hoạt tính cao nhất ở ngày nuôi cấy thứ 3 là 2181 U/g.
Ashwani S. & cộng sự (2008) trong nghiên cứu “Tối ưu hóa điều kiện lên men xốp trong sản xuất xylanase sử dụng các phế thải nông nghiệp từ chủng Bacillus subtilis ASH” tại Ấn Độ, với thời gian nuôi cấy xốp là 3 ngày hoạt độ
xylanasedo chủng Bacillus subtilis ASH sinh ra trên cơ chất malt xấp xỉ 8000 U/g và giảm mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 5 chỉ còn hơn 2000 U/g [27].
3.3.2.4. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp
Các chủng vi sinh vâ ̣t được cấy trên môi trường thích hợp v ới các tỷ lệ giống khác nhau, ủ ở 40oC trong 3 ngày, chiết di ̣ch và xác định hoạt độ xylanase. Kết quả đươ ̣c thể hiê ̣n trong hình 3.12:
Hình 3.12. Tỷ lệ giốngcấy thích hợp cho khả năng sinh xylanase của chủng B2H2 và 118
Kết quả trong hình 3.12 cho thấy, tỷ lệ giống cấy thích hợp nhất cho cả hai chủng vi khuẩn và xạ khuẩn là ở 15%. Với tỷ lệ giống cấy lớn hơn hoặc nhỏ hơn, hoạt độ xylanase đều giảm.
3.3.2.5. Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung
Các nguồn nitơ khác nhau đư ợc sử dụng trong thí nghiệm gồm: Nitrate, ure, nitrite, ammonium, cao thi ̣t và cao men. Bình nuôi cấy được ủ ở 400C, trong 3 ngày. Thu dịch enzyme và xác đ ịnh hoa ̣t đ ộ xylanase. Kết quả đư ợc thể hiện trong hình 3.13 :
69
Hình 3.13. Nguồn nitơ bổ sung thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase của chủng B2H2 và chủng 118
Từ hình 3.13 ta thấy, việc bổ sung thêm nguồn nitơ có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh trưởng và tổng hợp enzyme xylanase. So sánh với mẫu đối chứng (mẫu không bổ sung thêm nguồn nitơ), đối với chủng vi khuẩn B2H2, tất cả các nguồn nitơ vô cơ như nitrat, nitrit, (NH4)2SO4 đều làm giảm khả năng sinh xylanase ; ngược lại, hầu hết nguồn nitơ hữu cơ peptone, cao thịt, cao men được chọn nghiên cứu (ngoại trừ ure) đều tăng cường khả năng sinh xylanase của chủng (tăng khoảng 18%). Trong các nguồn nitơ được chọn thì cao thịt giúp tăng khả năng tổng hợp enzyme xylanase cao nhất , tiếp đó là cao men; Nitrat và nitrit ức chế mạnh nhất khả năng sinh trưởng và sinh enzyme của chủng này.
Đối với chủng xạ khuẩn 118, khả năng tổng hợp xylanase không chênh lệch nhiều khi bổ sung thêm các nguồn nitơ khác nhau vào cơ chất nuôi cấy. Các nguồn nitơ tăng cường khả năng sinh xylanase của chủng 118 là (NH4)2SO4, cao men, pepton và ure. Hoạt độ xylanase đạt được cao nhất khi bổ sung nguồn nitơ là urê (tăng 20%), tiếp đó là cao thịt (tăng 19%); Tuy nhiên, khi bổ sung 4% các nguồn nitơ khác như nitrat, nitrit, cao thịt thì hoạt độ xylanase đều bị giảm, khoảng 15%.
Tiếp tục thí nghiệm với cao thịt. Bổ sung cao thịt vào cơ chất nuôi cấy chủng B2H2 với tỷ lệ lần lượt là: 1, 2, 4, 6, 8 và 10% theo khối lượng. Sau 3 ngày, tiến hành thu dịch enzyme và xác định hoạt độ enzyme. Kết quả thu được như sau:
70
Hình 3.14. Mức độ ảnh hưởng của cao thịt đến khả năng tổng hợp xylanase của chủng B2H2
Như vậy, khi bổ sung 4% cao thịt vào cơ chất nuôi cấy, hoạt độ xylanasethu được tăng 18% so với ban đầu. Với lượng cao thịt bổ sung ít hơn hoặc nhiều hơn 4%, hoạt độ xylanase của chủng sẽ giảm.
Hình 3.15. Mức độ ảnh hưởng của urea đến khả năng tổng hợp xylanase của chủng 118
Tiếp tục thí nghiệm với urea. Bổ sung urea vào cơ chất nuôi cấy chủng 118 với tỷ lệ lần lượt là: 1, 2, 4, 6, 8 và 10% theo khối lượng. Sau đó thu dịch và tiến
71
hành xác định hoạt độ xylanase. Theo kết quả trong hình 3.15, với lượng urea bổ sung là 4% thì hoạt độ xylanase do chủng 118 tạo ra tăng lên 16%. Tiếp tục tăng lượng urea thêm vào thì hoạt độ xylanase của chủng 118 sẽ giảm dần.
3.3.2.6. Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung
Các chủng v i sinh vâ ̣t được cấy trên cơ ch ất xốp thích hợp nhất có bổ sung 4% (w/w) các nguồn cac bon khác nhau là : đường glucose, sacarose, D-Lactose, D- Malnitol và xylose. Bình nuôi cấy được ủ ở nhiê ̣t đô ̣ 40oC, trong 3 ngày. Sau đó, chiết dịch enzyme và xác định hoạt độ enzyme. Kết quả được thể hiê ̣n trong hình 3.16:
.
Hình 3.16. Nguồn cacbon bổ sung thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase của các chủng B2H2 và chủng 118
Kết quả ở hình 3.16 cho thấy, khi bổ sung các nguồn cacbon khác nhau vào cơ chất nuôi cấy của cả 2 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn đã gây ra sự ức chế khả năng tổng hợp enzyme xylanase của 2 chủng này. Hoạt độ xylanase của chủng vi khuẩn B2H2 giảm từ 2147 U/g xuống còn 1711 U/g khi thêm 4% glucose vào cơ chất nuôi cấy. Đối với chủng xạ khuẩn 118, khi bổ sung thêm nguồn cacbon hoạt độ xylanase thu được giảm mạnh (hoạt độ xylanasegiảm từ 2379 U/g xuống thấp nhất còn 1679 (U/g).
72
3.3.2.7. Lựa chọn loại khoáng thích hợp
Cơ chất nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn được làm ẩm 50% bằng các dung dịch khoáng khác nhau. Hoạt độ xylanase được xác định sau thời gian ủ 3 ngày ở nhiệt độ 40oC. Kết quả thể hiện trong hình 3.17:
Hình 3.17. Lựa chọn hỗn hợp khoáng thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp xylanase của chủng B2H2 và chủng 118 xylanase của chủng B2H2 và chủng 118
Qua hình 3.17 ta thấy, chủng vi khuẩn B2H2 tổng hợp xylanase hiệu quả nhất khi sử dụng khoáng MA1 (hoạt độ 3637 U/g) và thấp nhất khi sử dụng nước cất (hoạt độ đạt 1027 U/g). Chủng 118 tổng hợp xylanase tốt nhất khi sử dụng khoáng MA3 (hoạt độ đạt 2609 U/g) và thấp nhất khi sử dụng khoáng MA4 (1417 U/g).
3.4. THU HỒI ENZYME
3.4.1. Điều kiện thích hợp cho chiết enzyme
Sử dụng các loại đệm khác nhau nồng độ 0.05 M, ở pH 7 (đệm citrate, phosphat, tris-HCl), nước và dung dịch NaCl 0.9% để chiết xuất enzyme sau thời gian nuôi cấy 3 ngày.
Qua bảng 3.3 ta thấy, trong 5 loại dịch chiết được sử dụng, hiệu quả chiết cao nhất ở lần chiết đầu tiên cho chủng B2H2 và 118 lần lượt là đệm phosphat 0.05M, pH7 (90.58%) và nước (81.12 %) hoặc đệm citrate 0.05 M, pH 7 (78.94%) đối với chủng 118. Tiến hành chiết dịch enzyme lần 2, lần 3 bằng các dịch chiết trên chúng tôi thấy rằng kết quả sau 3 lần chiết tương tự kết quả sau lần chiết thứ nhất, loại dịch chiết cho hiệu quả cao nhất ở lần chiết 1 sẽ cho kết quả cao nhất sau cả 3 lần chiết.
73
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các loại dịch chiết đến hiệu quả thu hồi enzyme xylanase
Loại dịch chiết Hoạt độ xylanase Lần chiết Chủng B2H2 Chủng 118 U/g % U/g % Citrate lần 1 1771.7 65.83 1411.36 78.94 lần 2 322.47 12.45 296.54 15.08 lần 3 52.84 2.02 66.91 3.74 Tris-HCl lần 1 1810.6 71.11 1248.4 69.83 lần 2 480.62 18.88 142.84 7.99 lần 3 255.06 10.02 31.73 1.77 Nước lần 1 2139.5 66.12 2374 81.12 lần 2 261.7 8.05 469 16.17 lần 3 73 3.41 64.17 2.71 Phosphat lần 1 2438 90.58 368.77 20.63 lần 2 218.77 8.45 65.06 3.64 lần 3 34.69 1.33 48.4 2.71 Dung dịch NaCl 0.9% lần 1 2336.9 86.83 515.06 28.81 lần 2 239.51 9.25 142.84 7.99 lần 3 65.8 2.52 31.73 1.77
Tuy nhiên, trong quá trình nghiên cứu, khi thu dịch enzyme chúng tôi sử dụng nước để chiết enzyme cho cả 2 chủng nghiên cứu và chỉ tiến hành chiết một lần. Theo kết quả bảng 3.3, khi sử dụng đệm phosphat để chiết enzyme của chủng cho B2H2 thì hiệu suất chiết enzyme sẽ đạt 114%, tăng 14% so với chiết enzyme bằng nước. Đối với chủng 118, sử dụng nước cho hiệu suất chiết cao nhất (100%). Trong sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp, sử dụng dịch chiết là nước sẽ tiết kiệm được một chi phí khá lớn so với sử dụng đệm.
3.4.2. Thu hồi enzyme
Sau khi chiết dịch enzyme, tiến hành thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ và bằng muối ammonisunfat. Các loại dung môi hữu cơ được sử dụng là cồn 100%, aceton lạnh. Thu cặn, hòa tan cặn bằng nước, và xác định hoạt độ xylanase thu được. Mẫu đối chứng là dịch nuôi cấy enzyme ban đầu. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.4. Kết quả tủa enzyme xylanase của chủng 118 và B2H2 bằng các dung môi hữu cơ
Mẫu
Hoạt độ xylanase (%)
Nuôi cấy dịch thể Nuôi cấy xốp
Chủng 118 Chủng B2H2 Chủng 118 Chủng B2H2
Đối chứng 100 100 100 100
Cồn 66 68.5 67.32 62.3
Aceton 88.21 74.15 88.17 64.15
74
Theo kết quả bảng 3.4 ta thấy, khi sử dụng cồn 100%, aceton lạnh và muối ammonisunfat để tủa dịch enzyme của 2 chủng vi sinh vật nuôi cấy trên dịch thể và trên xốp, hoạt độ xylanase thu được cao nhất khi dịch enzyme được tủa trong aceton. Do đó, chúng tôi sẽ sử dụng aceton để tủa xylanase từ 2 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn. Dịch enzyme sau khi tủa sẽ được dùng cho quá trình tinh sạch.
3.5. TINH SẠCH ENZYME
3.5.1. Tinh sạch enzyme xylanase chủng 118 theo phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion
Mặc dù trong lên men xốp hoạt độ xylanase thu được cao hơn gấp nhiều lần trong lên men dịch thể, tuy vậy, chúng tôi không sử dụng dịch enzyme thu được từ nuôi cấy xốp cho quá trình tinh sạch vì lý do trong dịch enzyme có lẫn nhiều tạp chất và có chứa một phức hợp nhiều loại enzyme khác nhau. Do đó, chúng tôi sử dụng dịch enzyme ngoại bào của quá trình lên men dịch thể cho quá trình tinh sạch xylanase từ chủng 118.
Chủng 118 được nuôi trên môi trường dịch thể X2. Sau 2 ngày, chúng tôi tiến hành thu dịch enzyme, ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút, 4oC và tủa aceton như đã nêu trong phần phương pháp.
Sử dụng mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa trong aceton, chúng tôi tra 2ml lên cột sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE. Sau khi rửa cột bằng đệm 20mM Tris-HCl pH 8.0 với thể tích gấp 5 lần thể tích cột, chúng tôi tiến hành thôi protein bằng dung dịch NaCl 1000mM. Các phân đoạn protein thu được đem xác định hoạt độ xylanase. Kết quả được thể hiện trong hình sau:
Hình 3.18. Sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE mẫu enzyme tủa aceton chủng 118
75
Kết quả trong hình 3.18 cho thấy, xylanase xuất hiện ở cả quá trình rửa cột (phân đoạn 4, 5, 6) và thôi cột (phân đoạn 28, 29, 30, 31). Như vậy, lượng enzyme tra lên cột có thể bị thừa hoặc chủng 118 sinh ra hai loại xylanase khác nhau, một loại xylanase không bám sepharose DEAE và một loại xylanase bám sepharose