ammonisunfat bão hòa từ 30 đến 90%
Qua hình 3.22 ta thấy, khi tủa bằng muối ammonisunfat ở nồng độ từ 30 đến 90%, enzyme xylanase chủng 118 không bị tủa theo một chiều hướng nhất định, hoạt độ xylanase thu hồi được ở phân đoạn 30 và 80% cao hơn so với các phân đoạn khác, cao nhất ở phân đoạn 30% (500 U), tiếp theo là phân đoạn 80% (460 U), thấp nhất ở phân đoạn 50% (80 U).
Sử dụng mẫu enzyme thu được sau khi tủa trong ammonisunfat bão hòa để tra vào giếng điện di trên gel SDS-PAGE và gel hoạt tính, chúng tôi thu được kết quả như trong hình 3.23:
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 E2 E1 E2 E1 (a) (b)
79
1-Mẫu enzyme tủa aceton- ủ nhiệt ở 950C trong 4 phút; 2- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 30%; 3- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 40%; 4- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 50%; 5- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 60% ; 6- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 70% ; 7- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80%; 8- Mẫu enzyme
tủa ammonisunfat 90%.
Kết quả trong hình 3.23 cho thấy, trên bản gel SDS-PAGE có xuất hiện hai vạch rõ trùng với vị trí hai vạch sáng tương ứng trên bản gel hoạt tính.
Ngoài ra, chúng tôi còn nhận thấy, khi xylanase được tủa ammonisunfat ở nồng độ bão hòa từ 30 đến 50% trên bản gel chỉ thấy xuất hiện vạch của E2, và khi tủa ở các nồng độ bão hòa từ 50 đến 90% trên bản gel xuất hiện vạch của cả hai enzyme E1 và E2. Do đó, bằng phương pháp tủa ammonisunfat bão hòa ở nồng độ 30 đến 50%, chúng tôi có thể tách được enzyme E2 và ở các nồng độ ammonisunfat bão hòa từ 60 đến 90% thu được hỗn hợp cả 2 enzyme E1 và E2.
Dùng dịch enzyme thu được khi tủa ammonisunfat bão hòa 30 đến 50% tra lên cột sắc ký trao đổi ion, chúng tôi thấy đa số xylanase bám được sepharose DEAE (phân đoạn 28, 29, 30, 31) và bị thôi ra khi nồng độ NaCl tăng dần. Kết quả chạy cột được thể hiện trong hình sau:
Hình 3.24. Sắc ký trao đổi ion dịch enzyme tủa ammonisunfat 50%
Kết quả trong hình 3.24 cho thấy, xylanase lớn (E2) được tách ra bằng tủa ammonisunfat bão hòa 30 đến 50% bám được sepharose DEAE và bị đẩy ra ở bước thôi cột. Tiếp tục, chúng tôi tiến hành tủa dịch enzyme bằng ammonisunfat bão hòa
80
ở nồng độ từ 60 đến 80% và dùng dịch enzyme thu được tra vào cột sắc ký trao đổi ion. Kết quả chúng tôi thu được như sau:
Hình 3.25. Kết quả sắc ký trao đổi ion mẫu enzyme tủa ammonisunfat bão hòa 60 đến 80%
Qua hình 3.25, chúng tôi có thể kết luận rằng xylanase không bám sepharose DEAE là xylanase có khối lượng phân tử nhỏ hơn bị đẩy ra ở bước rửa cột. Như vậy, chúng ta thấy rằng có thể tách được 2 loại xylanase từ chủng 118 bằng phương pháp tủa trong ammonisunfat bão hòa.
Để xác định trọng lượng phân tử của hai loại xylanase từ chủng 118, chúng tôi tiến hành thí nghiệm chạy điện di trên gel SDS-PAGE. Các mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80% và enzyme E1, E2 được tra vào giếng điện di (thứ tự như trong hình 3.26).
81
Như vậy, bằng phương pháp tủa ammonisunfat bão hòa 30 đến 80% kết hợp sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE chúng tôi đã tách được hai loại xylanase từ chủng 118: một loại xylanase bám sepharose DEAE có kích thước phân tử là 36 kDa và một loại xylanase không bám sepharose DEAE có kích thước phân tử là 22 kDa (hình 3.26)
3.5. ĐẶC TÍNH ENZYME
Sau khi tách được 2 loại xylanase từ chủng 118 chúng tôi tiến hành xác định đặc tính của 2 loại enzyme này.
3.6.1. Đặc tính enzyme xylanase từ chủng 118
3.6.1.1. pH thích hợp
Sau 2 ngày nuôi cấy chủng vi sinh vật trên môi trường dịch thể thích hợp- thu dịch enzyme và đem xác định hoạt độ xylanase bằng phương pháp định lượng. Cơ chất sử dụng trong các lần định lượng được pha trong đệm ở các giá trị pH từ 2 đến 9.
E2 (36 kDa) E1 (22 kDa)
Hình 3.26. Điện di SDS-PAGE
M- marker (BSM0661; Biobasic); 1- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80%; 2- Dịch xylanase E1 và 3- Dịch Xylanase E2 thu được từ sắc ký trao đổi ion DEAE.
M 1 2 3 10 kDa 40 kDa 30 kDa 20 kDa 50 kDa 70 kDa 100 kDa
82
Hình 3.27. Dải pH thích hợp cho hoạt động của xylanase từ 118
Theo hình 3.27, xylanase thô không hoạt động khi pH môi trường dưới 4 và có hoạt động ở pH trong dải từ 4 đến 9 cao nhất ở pH6 và pH7. Đối với 2 enzyme xylanase tinh sạch (E1 và E2), E1 có dải pH rộng hơn E2 và hoạt độ xylanaseđạt cực đại ở pH 6, và giảm nhẹ ở giá trị pH7. Đối với các giá trị pH cao hơn (pH8 và pH9) hoạt độ của enzyme giảm mạnh, từ 92U/ml xuống 19 U/ml; Trong khi đó, hoạt độ của E2 cao nhất ở pH5. Ở pH6 và pH7 hoạt độ của enzyme giảm tuy nhiên không giảm mạnh như E1. Ở pH3 và dưới 3 enzyme E2 không có hoạt động.
3.6.1.2. Nhiệt độ thích hợp
Chủng 118 được nuôi cấy trong môi trường dịch thể thích hợp sau 2 ngày thu dịch enzyme và đem xác định hoạt độ. Hỗn hợp phản ứng enzyme được ủ ở các nhiệt độ tương ứng từ 35, 40, 45, 50, 55oC. Kết quả thu được như trong hình dưới đây:
83
Hình 3.28. Nhiệt độ phản ứng tối ưu của enzyme xylanase từ chủng 118
Như vậy, hoạt độ của xylanase thô và xylanase tinh sạch đều tăng dần khi nhiệt độ phản ứng tăng từ 35 đến 50oC, tuy nhiên nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động của cả 2 loại xylanase là 50oC, hay nói cách khác hiệu suất phân giải xylan của enzyme xylanase đạt cực đại ở nhiệt độ 50oC. Ở các nhiệt độ cao hơn nhiệt độ hoạt động tối ưu, hoạt độ của cả 3 enzyme đều giảm. Ngoài ra, chúng ta còn thấy đường biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ xylanase của hai loại xylanase tinh sạch E1 và E2 gần như trùng khít với nhau, có thể thấy rằng ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt động của 2 enzyme này gần như nhau.
3.6.1.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại
Dịch enzyme thu được sau khi nuôi cấy dịch thể 2 ngày được đem xác định hoạt độ sau khi bổ sung các ion kim loại. Trong hỗn hợp phản ứng enzyme, nồng độ ion kim loại thêm vào đạt 5mM. Kết quả được ghi trong hình 3.29:
84
Hình 3.29. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt động của enzyme xylanase từ 118
Kết quả hình 3.29 cho thấy, đối với enzyme xylanase thô, ion Fe2+ có khả năng làm tăng hoạt độ của xylanase (tăng 28% so với ban đầu), trong khi tất cả các ion kim loại khác đều ức chế hoạt động của enzyme này. Đối với 2 enzyme xylanase đã tinh sạch, Mn2+ và Fe2+ kích thích khả năng hoạt động của chúng. Đối với E1, ion Fe2+ tăng cường hoạt động của xylanase nhiều nhất, tiếp theo là Na+, Ca2+ và Mn2+, trong khi đó EDTA ức chế mạnh nhất. Đối với E2, ion Mn2+ tăng cường hoạt độ xylanase nhiều nhất, trong khi đó hầu hết các ion kim loại khác đều ức chế hoạt động của enzyme này, đặc biệt Cu2+ ức chế mạnh nhất.
85
Hình 3.30. Khả năng chịu nhiệt của các enzyme xylanase từ chủng 118 ở 600C
Theo hình 3.30 ta thấy, khi xử lý dịch enzyme xylanase từ chủng 118 ở 60oC trong các khoảng thời gian khác nhau 10 phút, 20 phút và 30 phút, hoạt độ của cả enzyme xylanase thô và tinh sạch đều giảm. Tuy nhiên, E2 có xu hướng bền nhiệt hơn so với enzyme xylanase thô và E1. Ở 60oC trong 10 phút, hoạt độ xylanase E2 còn 93%, trong khi enzyme E1 chỉ còn 50% và enzyme xylanase thô chỉ còn 70%. Như vậy, enzyme E2 gần như vẫn giữ được hoạt độ khá cao so với dịch enzyme ban đầu ở 60oC.
Tiếp tục thí nghiệm xử lý nhiệt 2 enzyme E1, E2 ở các nhiệt độ cao hơn 70oC, 80oC, 90oC và 100oC chúng tôi thu được kết quả như sau:
86
Hình 3.31. Khả năng bền nhiệt của hai loại xylanase tinh sạch từ chủng 118
Qua hình 3.31 chúng ta nhận thấy rằng, hoạt độ của cả 2 enzyme khi được xử lý ở các nhiệt độ 70oC, 80oC, 90oC và 100oC giảm đi đáng kể. Ở 70oC, hoạt độ xylanase E1 và E2 còn lại lần lượt là 20% và 38% so với mẫu enzyme không xử lý nhiệt. Hoạt độ cả hai enzyme gần như không còn ở 100oC. Tuy nhiên, xét tổng thể thì khả năng bền nhiệt của enzyme tinh sạch E2 cao hơn so với E1.
3.6.2. Đặc tính xylanase từ B2H2
3.6.2.1. pH thích hợp
Sau 2 ngày nuôi cấy chủng B2H2 trên môi trường dịch thể thích hợp, thu dịch enzyme và nhỏ vào các lỗ thạch cơ chất được chuẩn bị ở các giá trị pH khác nhau, đồng thời tiến hành định lượng xác định hoạt độ của enzyme. Cơ chất sử dụng trong các lần định lượng được pha trong đệm ở các giá trị pH từ 2 đến 9.
87
Hình 3.32. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ xylanase của chủng B2H2
Theo hình 3.32 ta thấy, xylanase do chủng B2H2 sinh ra không hoạt động ở pH dưới 4 và có hoạt động ở pH trong dải từ 5 đến trên 9, và hoạt động tốt nhất ở pH 6. Nhìn chung, xylanase của chủng B2H2 hoạt động được trong dải pH từ 5 đến 9.
3.5.2.2. Nhiệt độ
Chủng vi khuẩn B2H2 được nuôi cấy trong môi trường dịch thể thích hợp sau 2 ngày thu dịch enzyme. Dịch enzyme được nhỏ vào các lỗ thạch chứa cơ chất rồi đặt ở các nhiệt độ từ 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70oC, sau một ngày đo vòng phân giải xylan. Đồng thời cũng sử dụng dịch enzyme đó, tiến hành định lượng. Hỗn hợp phản ứng enzyme được ủ ở dải nhiệt độ tương ứng như trong định tính. từ 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70oC. Kết quả đo được thể hiện trong hình 3.33:
88
Như vậy, nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động của enzyme xylanase của chủng B2H2 khi định tính và định lượng đều là 50oC (Định tính: 33 mm, hoạt độ: 232 U/ml), hay nói cách khác enzyme xylanase hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 50oC.
3.5.2.3. Bền nhiệt
Sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường dịch thể thích hợp, thu dịch enzyme và đem xử lý nhiệt ở 50, 60, 70, 80oC trong thời gian là 10 phút. Dịch enzyme sau khi xử lý nhiệt được xác định hoạt độ.
Hình 3.34. Khả năng chịu nhiệt của enzyme xylanase từ chủng B2H2
Theo hình 3.34 ta thấy, khi xử lý enzyme ở 60oC trong 10 phút, hoạt độ xylanase của chủng B2H2 giảm 10% so với hoạt độ xylanaseban đầu. Tuy nhiên, hoạt độ của enzyme giảm mạnh khi xử lý ở nhiệt độ cao hơn 70oC. Ở 80oC, hoạt độ xylanase giảm hơn 70% so với hoạt độ xylanase ban đầu. Ở 100oC hoạt độ xylanase gần như không còn.
3.5.2.4. Ảnh hưởng của ion kim loại
Dịch enzyme thu được sau khi nuôi cấy xốp 3 ngày được dùng trong phản ứng định lượng. Nồng độ ion kim loại trong hỗn hợp phản ứng enzyme là 5 mM.
89
Hình 3.35. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ xylanase của chủng B2H2 của chủng B2H2
Kết quả từ hình 3.35 cho thấy, một số ion kim loại có khả năng tăng cường hoạt động của enzyme xylanase trong khi một số lại ức chế. Ion Ca2+ tăng cường mạnh nhất hoạt độ xylanase (tăng 66% so với dịch enzyme ban đầu), tiếp đó là Mn2+ và ion Fe2+, ion Mg2+ làm giảm hoạt độ của enzyme mạnh nhất (giảm 44%).
90
KẾT LUẬN
1. Từ 26 chủng vi sinh vật được lưu giữ ở Bảo tàng giống Vi sinh vật đã chọn được 2 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng sinh xylanase cao.
2. Kết hợp phân tích trình tự DNAr 16S và đặc điểm hình thái, chủng B2H2 thuô ̣c loài Bacillus subtilis và chủng 118 thuộc loài Streptomyces misionensis.
3. Môi trường nuôi di ̣ch thể thích hợp cho gi ống khởi động của chủng B2H2 là V5 và chủng 118 là môi trường X2. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho cả hai chủng nghiên cứu là 40oC; pH 7.0; thời gian nuôi thích hợp cho giống khởi động của chủng B2H2 là 24h và chủng 118 là 42h.
4. Cơ chất thích hợp cho chủng B2H2 nuôi xốp là malt và chủng 118 là gạo. Độ ẩm nuôi cấy thích hợp cho cả hai chủng là 50%, thời gian 3 ngày, tỷ lệ giống cấy 15%. Nguồn nitơ bổ sung phù hợp nhất cho chủng B2H2 là cao thịt và urea cho chủng 118. Hỗn hợp khoáng thích hợp nhất là MA1 cho chủng B2H2 và MA3 cho chủng 118. Dung dịch thích hợp cho chiết rút enzyme là đệm 50mM phosphat pH 7.0 cho chủng B2H2 và nước cho chủng 118. Hiệu quả thu hồi enzyme cao nhất cho cả hai chủng đạt được khi sử dụng aceton lạnh.
5. Tinh sạch và tách chiết được hai loại xylanase từ chủng 118 sử dụng phương pháp kết tủa trong muối (NH4)2SO4 và sắc ký trao đổi ion Sepharose DEAE và bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE, xác định được trọng lượng phân tử của hai loại xylanase tinh sạch là 22 kDa cho E1 và 36kDa cho E2.
6. pH thích hợp cho hoạt độ xylanase của chủng 118 là pH6 cho enzyme thô và E1; pH5 cho E2. Nhiệt độ phản ứng thích hợp cho cả enzyme thô và tinh sạch là 50oC. Độ bền nhiệt là 60oC. Fe2+ tăng cường hoạt độ xylanase cho enzyme thô và E1; Mn2+ kích thích cho E2.
7. pH thích hợp cho enzyme xylanase của chủng B2H2 là pH6. Nhiệt độ phản ứng tối ưu là 50oC. Độ bền nhiệt là 600C. Ion kim loại làm tăng hoạt độ xylanase mạnh nhất là Ca2+.
91
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về đặc tính enzyme từ chủng 118
2. Tiếp tục tách chiết và tinh sạch xylanase từ chủng B2H2 và nghiên cứu đặc tính của enzyme xylanase tinh sạch sinh ra từ chủng này.
92
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học Enzym và ứng
dụng, Nhà xuất bản Giáo dục (16).
2. Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2009), ―Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa xylanase từ A. niger DSM1957”, Báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học
toàn quốc, Nhà xuất bản Đại học Thái Nguyên, tr. 701 – 704 (6).
3. Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn (2007), ―Nghiên cứu hoạt độ enzym ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải‖, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 25 (2009), tr. 101-106.
4. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ Enzyme, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
5. Trần Đinh Toa ̣i , Trần Thị Hồng, Lê Minh Trí, Đỗ Trung Sỹ, Hoàng Thị Bích, Nguyễn Thị Hà Giang (2008), ―Nghiên cứu sử du ̣ng cellulase tách từ actinomycetes để xử lý phế thải nông nghiệp‖ , Hóa sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y
học và công nghệ thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa ho ̣c và Kỹ thuâ ̣t , Hà Nội, tr. 901 – 903.
6. Nguyễn Quốc Trị, Nguyễn Văn Hải (2001), ―Tóm tắt những nghiên cứu về enzyme trong thức ăn cho lợn‖, Viện chăn nuôi - Bộ nông nghiệp và Phát triển nông thôn. 7. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Lợi, Lê
Doãn Diên (2005), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
TIẾNG ANH
8. Amani M.D., El A. and Amany S. Y. (2007), ―Xylanase production by Bacillus pumilus: Optimization by Statistical and Immobilization Methods‖, Journal of Agriculture and Biological Sciences, 3(6), pp. 727-732.
9. Annane T., Anu H. and Juha R. (1994), ―Three – dimensional structure of endo– 1,4–β –xylanase II from Trichoderma reesei: two conformational states in the active site‖, The Excellence in the Life Sciences Journal, 13 (11), pp. 2493-2501
10.Ashwani S., Neelam G., Jitender S., Kalika K., Ramesh C. K., Vijay K. G. (2007), ―Optimization of xylanase production using inexpensive agro-residues by alkalophilic Bacillus subtilis ASH in solid-state fermentation‖, World Journal of Microbiology and Technology, 24, pp. 633-640.
93