PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3. Những đóng góp mới của đề tài

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phƣơng pháp xác định hoạt tính xylanase

2.2.1.1. Phương pháp định tính (khuếch tán trên thạch)

Vi khuẩn và xạ khuẩn được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút với các điều kiện nhiệt độ, môi trường và pH thích hợp. Sau các khoảng thời gian cần thiết, lấy dịch li tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút. Thu dịch enzyme nhỏ vào bản thạch chứa cơ chất đã khoan lỗ. Đặt trong tủ ấm (500C). Sau 24 giờ, dùng thuốc thử Công gô đỏ nhuộm bản thạch, sau đó rửa bằng dung dịch NaCl 1M và đọc kết quả.

42

Hoạt tính xylanase được xác định bằng kích thước vòng phân giải (VPG) (D-d, mm), trong đó, D là kích thước vòng phân giải, d là kích thước lỗ đục.

2.2.1.2. Phương pháp định lượng

Xác định hoạt độ xylanasebằng phương pháp DNS theo Miller (1999). Hoạt độ xylanase được xác định theo phương pháp của Bailey, 1992.

Phương pháp DNS

a. Chuẩn bị hóa chất

* Dung dịch DNS

- 10g Dinitrosalicylic axit hòa tan trong 400ml nước cất. - Bổ sung từ từ 150 ml dung dịch NaOH (1M), khuấy nhẹ.

- Bổ sung 1,87g crystal phenol, 0.5g Na2SO4 và K - Na tatrat tetrahydrat (Rochelle salt).

- Bổ sung nước cất đến 1000ml, lọc qua giấy và bảo quản trong bình tối màu ( dung dịch bền trong 2 tháng).

* Dung dịch cơ chất xylan 1% trong tris HCl 0.05 M, pH 7.0.

b. Cách tiến hành

Thực hiện phản ứng trong ống eppendoff.

- Nhỏ 225 μl dịch enzyme vào ống eppendoff, giữ 5 phút trong bể ổn nhiệt 50oC.

- Bổ sung 225 μl cơ chất 1% đã đạt nhiệt độ 50oC (ủ trong 30 phút ở 50oC) - Bổ sung 1350 μl dung dịch DNS, đun sôi 5 phút và làm lạnh nhanh dưới vòi nước chảy.

- Đo độ hấp phụ ở bước sóng 500nm.

- Đối chứng âm: bổ sung dung dịch DNS vào dịch enzyme để bất hoạt, sau đó thêm cơ chất.

c. Dựng đường chuẩn

- Đường xylose sấy khô trong 5 giờ ở 80oC.

- Làm dãy pha loãng dung dịch xylose trong nước ở các nồng độ(mg/l): 0,2; 0.4; 0.6; 0.8; 1; 1.2; 1.4; 1.6; 1.8 và 2.

- Hòa 300 μl mỗi dung dịch đường ở dãy pha loãng trên với 900 μl dung dịch DNS, đun sôi trong 5 phút và làm lạnh nhanh bằng nước đá để làm bền màu.

- Đo độ hấp phụ ở bước sóng 500nm (lấy nước cất làm giá trị blank 0,00). Với mỗi nồng độ lặp lại 2 lần.

43 Nồng độ

Xylose (mg/l) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

Độ hấp phụ 0 0.245 0.461 0.656 0.910 1.070 1.287 1.506 1.747 1.960 2.197 Từ kết quả trên ta dựng được đồ thị đường chuẩn độ hấp phụ OD theo nồng độ đường xylose,trong đó y là giá trị OD, x là nồng độ xylose (mg/l).

Xác định hoạt độ của xylanase

Một đơn vị hoạt độ của enzyme xylanase là lượng enzyme giải phóng đường khử với tốc độ 1μmol/ phút dưới điều kiện của thí nghiệm. Hoạt độ của enzyme được xác định theo công thức:

X × 1000 × 5 × 20 Hoạt độ U/ml hoặc (U/g) = ——————— 150 × 10

Trong đó: - X là lượng đường khử tính theo đường chuẩn

- X × 1000 là lượng đường khử theo đường chuẩn đổi ra µl (hoặc µg)

- 5 là lượng đường khử trong 1ml (hoặc 1g) phản ứng - 20 là hoạt độ xylanase tính theo 1ml enzyme

- 150 là khối lượng phân tử của xylose - 10 là thời gian ủ của phản ứng (phút)

44

Pha các dung dịch Na2CO3 2% (pha trong NaOH 0,1N), CuSO4 1%, K.Na.tartar.4H2O 1% theo tỷ lệ 98:1:1 (v:v:v), dung dịch tạo thành ký hiệu là WS1. Thuốc thử Foline được pha loãng 4 lần, gọi là dung dịch WS2.

Hỗn hợp phản ứng gồm:

0.2 ml mẫu enzyme (dịch trong sau ly tâm); 2.1 ml WS1; 0.2 ml WS2.

Trộn đều, đem ủ trong bể ổn nhiệt ở 37oC trong 15 phút, đo OD ở bước sóng 750nm. Tính đơn vị hoạt độ quốc tế U.

2.2.2. Tuyển chọn chủng

26 chủng vi sinh vật được nuôi trên môi trường dịch thể. Sau 2 ngày thu dịch, xác định hoạt độ bằng phương pháp định lượng và định tính. Sau đó, chọn ra các chủng có hoạt độ xylanase cao.

Dịch enzyme của các chủng có hoạt độ xylanase cao được xử lý ở 600C trong các khoảng thời gian là 10, 20 và 30 phút. Sau đó, xác định hoạt độ còn lại của dịch enzyme và chọn ra các chủng bền nhiệt nhất.

2.2.3. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh trƣởng

- Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được xác định bằng mật độ tế bào trong dịch nuôi: Vi khuẩn được nuôi cấy dịch thể với các điều kiện thí nghiệm thích hợp. Thu dịch nuôi cấy đo OD ở bước sóng 600nm.

- Khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn được xác định bằng sinh khối khô: Cân giấy lọc đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi (ở nhiệt độ 105oC trong 2 giờ). Lọc 20 ml dịch nuôi cấy qua gi ấy lọc, đem sấy khô giấy lọc đến trọng lượng không đổi, cân lại giấy lọc. Trọng lượng khô của tế bào được xác đi ̣nh b ằng công thức:

P(g/l)= (P2- P1) × 50

Trong đó, P: Trọng lượng khô của sinh khối; P1: Trọng lượng khô của giấy lọc; P2: Tổng trọng lượng khô của giấy lọc và sinh khối; 20 ml dịch nuôi cấy/bình nuôi cấy nên phải nhân với 50 để ra trọng lượng khô của tế bào trong 1 lít dịch nuôi cấy.

2.2.4. Phƣơng pháp phân loại

2.2.4.1. Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN

a. Tách chiết ADN của vi khuẩn

Thực hiện theo phương pháp của Sakiyama và cộng sự (2009) - Nuôi vi khuẩn và xạ khuẩn trên môi trường dịch thể thích hợp. - Thu dịch, ly tâm 1.5ml dịch nuôi lấy sinh khối tế bào.

45

- Thêm 0,4 mg lysozyme. Trộn đều, ủ 370C trong 1 giờ. Trộn đều 3 phút. - Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 370C/30 phút. - Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều. Ly tâm 15.000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

- Thêm 8 l ARNse 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 370C trong 30 phút. - Thêm 12 l proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 560C.

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều. Ly tâm 15.000v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

- Thêm 1 thể tích tương ứng chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15.000v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

- Thêm 1/10 V Natri acetat 3M và 1ml Ethanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30 phút.

- Ly tâm 15.000v/p trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên. - Rửa tủa bằng ethanol 70%.

- Làm khô ADN bằng máy cô quay chân không. - Hoà tan ADN trong 50-100l nước hoặc TE. - Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di.

Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.

b. Phản ứng khuếch đại ADN

Thành phần phản ứng

Thành phần Thể tích (l)

10X buffer 10

dNTP 2.0 mM 10

Mồi xuôi (10 pmol/l) 2 Mồi ngược (10 pmol/l) 2 Taq polymerase (5u/l) 2 ADN khuôn (50-100g/l) 1-2

46 Chu trình nhiệt: 950C - 3 phút 950C - 30giây 560C - 15 giây 30 chu kỳ 720C - 1 phút 720C - 5 phút 400C -  Mồi

Mồi xuôi 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. Mồi ngược 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3' - Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.

c. Tinh sạch sản phẩm PCR.

Sử dụng bộ kit QIAgen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

-Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1. Trộn đều.

-Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút .

-Đổ bỏ dịch phía dưới cột.

-Bổ sung 750 l đệm PE lên cột. Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

-Đổ bỏ dịch dưới cột.

-Ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút.

-Chuyển cột sang ống Eppendoft mới.

-Thêm 30l nước. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút.

-Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút.

-Lấy dịch phía dưới.

Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:

Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh sạch : OD 260/OD 280 > 1,7

47 -Terminator Ready Reaction Mix (Termix): Buffer 5X 9l Bigdye Ready Reaction premix 18l H2O 9l -Thành phần phản ứng PCR cho đọc trình tự:

Termix 8l

Mồi (*) 1l

ADN khuôn 1l (nồng độ ADN là 40-60 g/ml)

H2O 10l (*) Các loại mồi đã sử dụng: 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'. 780F: 5'-GAATTGATACCCTGGTAG-3.' 350R: 5'-CTGCTGCCTCCCGTAG-3'. 1100F: 5'-GCAACGAGCGCAACCC-3'. 920R: 5'-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'. -Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen: 960C - 1phút

960C - 10giây 25 chu kỳ 500C - 5 giây

600C - 4 phút

e. Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự

-Chuyển 20l sản phẩm sang ống Eppendoft sạch

-Thêm 5l EDTA 125mM và 60l ethanol 100%. Để khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng.

-Ly tâm 15.000v/p, 15phút.

-Bỏ dịch, thêm 60l ethanol 70% để rửa, ly tâm 15.000v/p, 10 phút. -Làm khô.

-Thêm 10l HiDi Formamide. -Để ở 96oC trong 2 phút.

-Cho ngay mẫu vào nước đá lạnh.

-Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự. Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant.

48

f. Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Trình tự của rDNA 16S được xác định theo phương pháp của Kurtman và Robnett (1997), sử dụng phần mềm CLUSTAL W ver 1.83 của Thompson và đồng tác giả (1994). Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987).

2.2.4.2. Quan sát hình thái

a. Hình thái tế bào và khuẩn lạc vi khuẩn

 Quan sát hình dạng khuẩn lạc: Vi khuẩn được cấy ria trên môi trường canh thang, sau 2 ngày, quan sát hình thái bề mặt, màu sắc, kích thước…

 Quan sát hình thái tế bào: Vi khuẩn nuôi trong môi trường canh thang 24 giờ, quan sát tế bào.

 Nhuộm Gram

- Dung dịch tím kết tinh: 2g tím kết tinh hòa tan trong 20ml ethanol 95%; 0,8g ammoni oxalate hòa tan trong 80ml nước cất. Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối màu, sử dụng trong vài tháng.

- Dung dịch Lugol: hòa tan 2g KI trong 30ml nước cất, thêm 1g iodine, khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối màu.

- Dung dịch tẩy màu: ethanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml ethanol 95% với 30ml acetone.

- Dung dịch nhuộm bổ sung: chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5% trước khi dung pha với nước cất theo tỉ lệ 1:5 để có dung dịch 0,5%.

* Cách tiến hành

 Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào một giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.  Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần.

 Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.  Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.

 Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.

 Nhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin trong 2 – 3 phút, rửa nước, để khô trong không khí.

49

b. Quan sát hình thái xạ khuẩn

- Quan sát hình dạng khuẩn lạc: Xạ khuẩn được cấy ria trên môi trường thạch YG, sau 2 - 5 ngày lấy ra quan sát hình thái bề mặt, màu sắc, kích thước khuẩn lạc. - Quan sát hình dạng cuống sinh bào tử: xạ khuẩn được nuôi trên môi trường YG, cắm lamen nghiêng. Sau 2-5 ngày lấy lamen quan sát hình dạng cuống sinh bào tử và đếm số lượng bào tử trên kính hiển vi quang học.

2.2.5 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng vi sinh vật nghiên cứu ở các chủng vi sinh vật nghiên cứu

2.2.5.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu xylanase ở các chủng nghiên cứu

a. Môi trường thích hợp

Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, 40oC trong 5 môi trường dịch thể kí hiệu là: V1, V2, V3, V4, V5. Sau 2 ngày thu dịch và xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng.

Xạ khuẩn được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, 40oC trong 5 môi trường dịch thể ký hiệu là: X1, X2, X3, X4, X5. Dịch nuôi cấy sau 2 ngày được xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng.

b. Nhiệt độ thích hợp

Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy trong môi trường thích hợp ở nhiệt độ 25, 30, 35, 40, 50 và 55oC trên máy lắc ổn nhiệt. Sau 2 ngày, thu dịch, xác định hoạt tính xylanase và khả năng sinh trưởng.

c. pH thích hợp

Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trên môi trường thích hợp, pH được chỉnh ở các giá trị: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. Sau 2 ngày, thu dịch, xác định hoạt tính xylanase và khả năng sinh trưởng.

d. Thời gian thích hợp cho giống khởi động

Chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc trong môi trường canh thang ở nhiệt độ thích hợp. Thu dịch nuôi cấy sau 8, 16, 24, 32, 40 giờ và xác định mật độ tế bào ở OD 600.

Chủng xạ khuẩn được nuôi cấy lắc trong môi trường YG ở nhiệt độ thích hợp. Thu dịch nuôi cấy sau 24, 30, 36, 42, 48 giờ, lọc qua giấy lọc và xác định sinh khối.

2.2.5.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu xylanase ở các chủng nghiên cứu

50

a. Lựa chọn cơ chất

Các chủng vi sinh vật được nuôi trên các cơ chất xốp khác nhau, ủ 3 ngày ở 40oC, sau đó được chiết bằng nước theo tỷ lê ̣ 1 cơ chất: 3 nước, lắc 200 vòng/phút trong 3 giờ. Chiết dịch enzyme bằng ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút và xác định hoạt độ enzyme.

b. Lựa chọn thời gian nuôi cấy

Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn được nuôi cấy xốp trên cơ chất thích hợp, ở 400C với thời gian từ 1 - 7 ngày. Chiết dịch, xác định hoạt độ xylanase.

c. Lựa chọn độ ẩm

Các chủng vi sinh vật được nuôi trên các cơ chất xốp thích hợp ở các độ ẩm lần lượt là 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80%. Ủ trong 3 ngày ở 40oC, chiết bằng nước và xác định hoạt độ xylanase.

d. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy

Các chủng vi sinh vật được cấy vào các cơ chất xốp thích hợp với các tỷ lệ 5, 10, 15, 20 và 25%. Ủ 3 ngày, thu dịch và xác định hoạt độ xylanase.

e. Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung

Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên cơ chất xốp có bổ sung thêm 4% nguồn carbon là glucose, sacarose, D-lactose, D-Mannitol, xylose trên. Sau 3 ngày,