3. Những đóng góp mới của đề tài
2.2.9.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ enzyme
Nhỏ 50µl dịch enzyme vào các ống nghiệm. Thêm tiếp 10 µl dung dịch ion kim loại nồng độ 100 mM. Thêm 150µl cơ chất xylan 1% vào hỗn hợp phản ứng. Nồng độ ion kim loại trong hỗn hợp phản ứng 5mM. Sau đó đặt ống phản ứng vào bể ổn nhiệt ở 50oC, trong 10 phút. Xác định hoạt tính xylanase bằng phương pháp định lượng.
55
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN
3.1.1. Lựa chọn các chủng có hoạt độ xylanase cao
26 chủng được nuôi trên môi trường dịch thể. Sau 2 ngày thu dịch, xác định hoạt độ xylanase bằng phương pháp định lượng và định tính. Sau đó, chọn ra các chủng có hoạt độ xylanase cao.
Bảng 3.1. Hoạt tính xylanase của 26 chủng vi sinh vật nghiên cứu
Chủng Hoạt tính xylanase Chủng Hoạt tính xylanase
VPG (D-d) mm U/ml VPG (D-d) mm U/ml 16 27 115 442 25 93 20 12 13 444 27 102 36 20 13 458 21 54 76 21 71 523 23 25 118 28 184 525 19 45 153 17 12 598 26 67 226 19 47 E1 19 16 425 11 14 E2 24 98 426 22 57 I76 28 105 428 25 8 472 28 62 434 26 76 477 24 65 437 24 59 15.2 27 58 438 28 69 B2H2 29 171
Theo kết quả trong bảng trên, từ 26 chủng vi sinh vật ban đầu , chúng tôi đã chọn ra được 7 chủng có khả năng sinh xylanase mạnh, trong đó, 2 chủng vi khuẩn là: 16, B2H 2 và 5 chủng xạ khuẩn là: 118, 442, 444, E2, và I76. Dịch enzyme của 7 chủng này được dùng để xác định khả năng bền nhiệt.
3.1.2. Lựa chọn các chủng vi sinh vật bền nhiệt có hoạt tính xylanase cao
Từ 2 chủng vi khuẩn và 5 chủng xạ khuẩn có hoạt độ xylanase cao đã chọn, nuôi trên môi trường dịch thể, thu dịch enzyme, xử lý ở 60oC trong các khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút. Sau đó, tiến hành xác định hoạt tính xylanase bằng phương pháp định tính và định lượng, thu được kết quả như sau:
56
Bảng 3.2. Khả năng chịu nhiệt của các chủng vi sinh vật
STT Chủng Nhiệt độ (0C) Thời gian xử lý (phút) Hoạt tính xylanase
(D-d) mm U/ml 1 16 60 Đối chứng 30 60 10 24 4 20 22 1 30 20 0 2 118 60 Đối chứng 30 184 10 23 158 20 22 146 30 20 132 3 442 60 Đối chứng 30 40 10 29 15 20 27 11 30 24 9 4 444 60 Đối chứng 29 34 10 25 12 20 17 8 30 15 6 5 E2 60 Đối chứng 20 14 10 20 10 20 18 9 30 15 5 6 I76 60 Đối chứng 20 43 10 19 40 20 18 39 30 15 36 7 B2H2 60 Đối chứng 31 171 10 29 147 20 28 113 30 25 85
Mẫu đối chứng là mẫu sử dụng dịch enzyme không qua xử lý nhiệt. Từ kết quả ghi trong bảng 3.1 và bảng 3.2, chúng tôi chọn ra được hai chủng B2H2 và 118, là các chủng bền nhiệt có hoạt độ xylanase cao nhất để tiến hành nghiên cứu sâu hơn.
3.2. PHÂN LOẠI
3.2.1. Chủng B2H2
3.2.1.1. Phân tích trình tự ADNr 16S
ADN genome của chủng vi khuẩn B2H2được tách chiết và dùng làm khuôn để khuếch đại ADNr 16S bằng phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi 9F và 1525R. Trình
57
tự 1500 bp được xác định. Chương trình Blast được sử dụng để so sánh độ tương đồng với trình tự của các loài có quan hệ họ hàng gần. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 16S của các chủng nghiên cứu với 16 loài có quan hệ họ hàng gần thuộc chi Bacillus. Staphylococcus aureus_X68417 được sử dụng làm
nhóm ngoài (Hình 3.1).
Hình 3.1. Vị trí phân loại của chủng B2H2 với các loài có quan hệ họ hàng gần
Quan sát trên cây phân loại cho thấy: chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với
Bacillus subtilis_AB042061 (giá trị lặp lại 96%) với mức độ tương đồng ở trình tự
ADNr 16S là 99,9% (1488/1490 bp).
3.2.1.2. Đặc điểm hình thái
Sau khi xác định được vị trí phân loại của chủng B2 H 2, chúng tôi tiến hành quan sát đặc điểm hình thái và tế bào.
Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus flexus_AB021185 Bacillus megaterium_D16273 Bacillus koreensis_AY667496 100 Bacillus weihenstephanensis_AB021199 93 Bacillus sonorensis_AF302118 Bacillus licheniformis_X68416 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus subtilis_AB042061 B2H2 Bacillus malacitensis_AY603656 Bacillus axarquiensis_AY603657 Bacillus mojavensis_AB021191 97 96 78 Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus velezensis_AY603658 Bacillus methylotrophicus_EU194897 Bacillus nematotocita_AY820954 59 Bacillus amyloliquefaciens_X60605 53 64 83 77 70 100 100 65 100 0.01
58
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng B2H2
Hình thái khuẩn lạc: Khuẩn lạc bề mặt xù xì, màu trắng, không tiết sắc tố ra môi trường, kích thước khuẩn lạc: 0.4-5 mm.
Hình thái tế bào: tế bào có dạng hình que, ngắn, có kích thước: 2.69-4.52 µm, chiều rộng: 0.43-0.92 µm.
Dựa vào đặc điểm hình thái và so sánh mức độ tương đồng ADN của chủng nghiên cứu và các loài có quan hệ họ hàng gần, chủng B2H2 được định danh là
Bacillus subtilis.
3.2.2. Chủng 118
3.2.1.2. Phân tích trình tự ADNr 16S
Chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường YS dịch thể, sau 2 ngày, ly tâm lấy phần sinh khối. ADN genome của chủng xạ khuẩn 118 được tách chiết và dùng làm khuôn để khuếch đại ADNr 16S bằng phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi 9F và 1525R. Trình tự 1500 bp được xác định. Chương trình Blast được sử dụng để so sánh độ tương đồng với trình tự của các loài có quan hệ họ hàng gần. Cây phát sinh chủng loại của chủng nghiên cứu với 24 loài thuộc chi Streptomyces đã được xây dựng dựa vào trình tự ADNr 16S. Kitasatosporia setalba được sử dụng làm nhóm ngoài.
59
Hình 3.3 .Vị trí phân loại của chủng XK-118 với các loài có quan hệ họ hàng gần
Quan sát cây phát sinh chủng loại cho thấy: Chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với Streptomyces misionensis. Trình tự ADNr 16S của chủng XK118 tương đồng
100 % (1300/1300 bp) với đoạn 16S của Streptomyces misionensis (hình 3.3).
3.2.1.3. Đặc điểm hình thái
Sau khi xác định được vị trí phân loại, chúng tôi tiến hành quan sát đặc điểm hình thái và cuống sinh bào tử của chủng 118.
Kitasatosporia setalba_U93332 Streptomyces padanus_AF455813 Streptomyces gougerotii_AB184742 Streptomyces phaeoluteichromatogenes_AJ391814 XK-118 Streptomyces misionensis_EF178678 Streptomyces rajshahiensis_GQ500975 Streptomyces owasiensis_AB184515 88 53 80 83 Streptomyces levis_DQ442517 Streptomyces purpurascens_AB045888 Streptomyces viridochromogenes_DQ442555 Streptomyces ambofaciens_AB184182 Streptomyces flaveolus_AB184764 71 Streptomyces tendae_D63873 Streptomyces tritolerans_DQ345779 Streptomyces violaceoruber_AF503492 Streptomyces coelescens_AF503496 Streptomyces humiferus_AF503491 99 79 99 Streptomyces violaceorubidus_AJ781374 64 64 96 Streptomyces glaucescens_AB184843 Streptomyces pharetrae_AY699792 58 100 Streptomyces brunneogriseus_AB184509 Streptomyces eurythermus_D63870 Streptomyces ansochromogenes_AB184448 65 Streptomyces nodosus_AF114033 Streptomyces achromogenes_AY999846 66 76 56 100 58 55 66 82 0.01
60
Hình 3.4 . Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng 118
Hình thái khuẩn lạc: khuẩn lạc xù xì, chia múi, khuẩn ty cơ chất màu nền trắng, khuẩn ty khí sinh màu trắng, kích thước khuẩn lạc: 1 - 7 mm.
Hình thái cuống sinh bào tử: là chuỗi dài cuộn lại ở đầu chuỗi, có từ 5 đến 25 bào tử trên mỗi cuống.
Dựa vào đặc điểm hình thái và quan sát cây phát sinh chủng loại cho thấy: Chủng 118 được định danh là Streptomyces misionensis.
3.3. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 3.3.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống 3.3.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống
3.3.1.1. Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng
Chủng vi khuẩn B2 H 2 được nuôi cấy trên 5 môi trường khác nhau: V1, V2, V3, V4, V5 và các chủng xạ khuẩn 118 được nuôi cấy trên 5 môi trường khác nhau: X1, X2, X3, X4, X5, ở nhiệt độ 40°C, trong 2 ngày, sau đó, xác định khả năng sinh trưởng và hoạt tính xylanase. Kết quả được thể hiện ở hình sau:
61
(a)
(b)
Hình 3.5. Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme
a- Chủng B2H2; b- Chủng 118
Kết quả cho thấy, cả hai chủng đều sinh trưởng trên cả 5 môi trường. Tuy nhiên, trên môi trường V5, chủng B2H2 sinh trưởng tốt nhất (OD sau nuôi: 1.917; VPG xylan: 26 mm) ; chủng 118 sinh trưởng tốt nhất trên môi trường X2 (Sinh khối: 9.05 g/l; VPG xylan: 28 mm). Trên 4 môi trường còn lại, hoạt độ xylanasecủa chủng B2H2 khá cao và đồng đều (hoạt độ từ 21 - 25), nhưng chủng 118 lại có sự chênh lệch lớn (VPG xylan từ 15 - 25mm). Từ đó, chúng tôi đã chọn được môi trường thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của 2 chủng là: môi trường V5 cho chủng
62
B2H2 và môi trường X2 cho chủng 118. Kết quả này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp sau.
3.3.1.2. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng
Các chủng được nuôi trên môi trường thích hợp và đặt ở các nhiệt độ từ 25, 30, 35, 45, 50, 55oC. Sau 2 ngày xác định khả năng sinh trưởng và hoạt độ enzyme.
(a)
(b)
Hình 3.6. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme
a- Chủng B2H2; b- Chủng 118
Kết quả trong hình 3.6 cho thấy, các chủng đều sinh trưởng được khi nuôi lắc ở dải nhiệt độ từ 25 đến 55oC, và sinh trưởng mạnh nhất ở nhiệt độ nuôi là 40oC. Do đó, nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của các chủng nghiên cứu là 40oC.
63
3.3.1.3. pH thích hợp cho sự sinh trưởng
Sau 2 ngày nuôi cấy chủng vi sinh vật trên môi trường dịch thể thích hợp, ở 40oC, thu dịch enzyme và xác định khả năng sinh trưởng và tổng hợp enzyme của 2 chủng.
(a)
(b)
Hình 3.7. pH thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme
a- Chủng B2H2; b- Chủng 118
Kết quả ở hình 3.7 cho thấy, xylanase do cả 2 chủng nghiên cứu sinh ra đều không hoạt động khi pH môi trường dưới 4 và có hoạt độ ở pH trong dải từ 4 đến
64
trên 9. Cả hai chủng B2H2 và 118 đều đạt hoạt độ cao nhất ở giá trị pH7 và giảm nhẹ ở pH 6. Hoạt độ xylanase giảm dần khi pH lớn hơn hoặc nhỏ hơn 7.
3.3.1.4. Thời gian thích hợp cho giống khởi động
Chủng B2H2 được nuôi khởi động trên môi trường canh thang, sau 8h nuôi lắc ở nhiệt độ và pH thích hợp, bắt đầu thu dịch, cứ sau 8h lại thu dịch một lần và đo OD sau nuôi để xác định mật độ tế bào. Chủng xạ khuẩn 118 được nuôi lắc khởi động trên môi trường YG ở nhiệt độ và pH thích hợp, sau 24h nuôi lắc bắt đầu thu dịch và cứ sau 6h lại thu dịch một lần và cân sinh khối.
(a)
(b)
Hình 3.8. Thời gian thích hợp cho giống khởi động
65
Kết quả trong hình 3.8 cho thấy, thời gian nuôi khởi động chủng B2H2 thích hợp nhất là 24h. Sau 24h mật độ tế bào giảm dần. Thời gian nuôi khởi động chủng 118 thích hợp nhất là 42h, tại đó sinh khối thu được là cao nhất. Sử dụng kết quả này cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp.
3.3.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp
3.3.2.1. Lựa chọn cơ chất
Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn sau 4 ngày nuôi trên các cơ chất g ạo, ngô, cám, malt, bột đâ ̣u tương (BĐT) tại 40oC, dịch chiết enzyme thô đươ ̣c đi ̣nh tính và đi ̣nh lượng để xác đi ̣nh khả năng sinh enzyme . Kết quả được thể hiê ̣n trong hình 3.9:
Hình 3.9. Cơ chất thích hợp cho quá trình tổng hợp xylanase của 2 chủng 118 và B2H2
Kết quả trong hình 3.9 cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn đều sinh trưởng được trên 5 cơ chất xốp. Đối với chủng vi khuẩn B2H2, hoạt độ xylanasethu được đạt cao nhất trên cơ chất malt (2154 U/g), tiếp theo là trên cơ chất gạo (587 U/g). Đối với chủng xạ khuẩn 118, hoạt độ xylanase thu được cao nhất trên cơ chất gạo (2386 U/g ), và thấp nhất trên cám gạo (184 U/g).
3.3.2.2. Lựa chọn độ ẩm thích hợp
Chủng vi khuẩn được nuôi trên xốp malt và chủng xạ khuẩn được nuôi trên xốp gạo ở các độ ẩm từ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70%. Sau 3 ngày, chiết dịch enzyme, tiến hành định tính và định lượng.
66
Theo kết quả hình 3.10 ta thấy, cả hai chủng vi khuẩn và xạ khuẩn đều tổng hợp enzyme xylanase tốt nhất ở độ ẩm 50%. Tuy nhiên ở chủng 118, khi độ ẩm đạt 40 và 60%, hoạt độ xylanase thu được vẫn khá cao và xấp xỉ bằng hoạt độ ở độ ẩm 50%, còn chủng B2H2 thì hoạt độ xylanase chênh lệch khá nhiều, khi độ ẩm là 40% hoạt độ xylanase thu được chỉ bằng 61% so với ở độ ẩm 50%.
(a)
(b)
Hình 3.10. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tổng hợp enzyme xylanase
67
3.3.2.3. Lựa chọn thời gian nuôi cấy
Chủng vi khuẩn B2H2 và chủng xạ khuẩn 118 được nuôi xốp trên cơ chất thích hợp, ủ ở 40oC. Thu dịch và xác định hoạt độ xylanase sau thời gian nuôi lần lượt từ 1 đến 7 ngày. Kết quả được thể hiện trong hình 3.11:
(a)
(b)
Hình 3.11. Thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase
68
Theo kết quả của hình 3.11 ta thấy, đối với cả hai chủng thời gian nuôi cấy tốt nhất là 3 ngày, chủng B2H2 đạt hoạt tính 2154 U/g còn chủng 118 đạt hoạt tính cao nhất ở ngày nuôi cấy thứ 3 là 2181 U/g.
Ashwani S. & cộng sự (2008) trong nghiên cứu “Tối ưu hóa điều kiện lên men xốp trong sản xuất xylanase sử dụng các phế thải nông nghiệp từ chủng Bacillus subtilis ASH” tại Ấn Độ, với thời gian nuôi cấy xốp là 3 ngày hoạt độ
xylanasedo chủng Bacillus subtilis ASH sinh ra trên cơ chất malt xấp xỉ 8000 U/g và giảm mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 5 chỉ còn hơn 2000 U/g [27].
3.3.2.4. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp
Các chủng vi sinh vâ ̣t được cấy trên môi trường thích hợp v ới các tỷ lệ giống khác nhau, ủ ở 40oC trong 3 ngày, chiết di ̣ch và xác định hoạt độ xylanase. Kết quả đươ ̣c thể hiê ̣n trong hình 3.12:
Hình 3.12. Tỷ lệ giốngcấy thích hợp cho khả năng sinh xylanase của chủng B2H2 và 118
Kết quả trong hình 3.12 cho thấy, tỷ lệ giống cấy thích hợp nhất cho cả hai chủng vi khuẩn và xạ khuẩn là ở 15%. Với tỷ lệ giống cấy lớn hơn hoặc nhỏ hơn, hoạt độ xylanase đều giảm.
3.3.2.5. Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung
Các nguồn nitơ khác nhau đư ợc sử dụng trong thí nghiệm gồm: Nitrate, ure, nitrite, ammonium, cao thi ̣t và cao men. Bình nuôi cấy được ủ ở 400C, trong 3 ngày. Thu dịch enzyme và xác đ ịnh hoa ̣t đ ộ xylanase. Kết quả đư ợc thể hiện trong hình 3.13 :
69
Hình 3.13. Nguồn nitơ bổ sung thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase của chủng B2H2 và chủng 118
Từ hình 3.13 ta thấy, việc bổ sung thêm nguồn nitơ có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh trưởng và tổng hợp enzyme xylanase. So sánh với mẫu đối chứng (mẫu không bổ sung thêm nguồn nitơ), đối với chủng vi khuẩn B2H2, tất cả các nguồn nitơ vô cơ như nitrat, nitrit, (NH4)2SO4 đều làm giảm khả năng sinh xylanase ; ngược lại, hầu hết nguồn nitơ hữu cơ peptone, cao thịt, cao men được chọn nghiên cứu (ngoại trừ ure) đều tăng cường khả năng sinh xylanase của chủng (tăng khoảng 18%). Trong các nguồn nitơ được chọn thì cao thịt giúp tăng khả năng tổng hợp enzyme xylanase cao nhất , tiếp đó là cao men; Nitrat và nitrit ức chế mạnh nhất khả năng sinh trưởng và sinh enzyme của chủng này.
Đối với chủng xạ khuẩn 118, khả năng tổng hợp xylanase không chênh lệch nhiều khi bổ sung thêm các nguồn nitơ khác nhau vào cơ chất nuôi cấy. Các nguồn nitơ tăng cường khả năng sinh xylanase của chủng 118 là (NH4)2SO4, cao men, pepton và ure. Hoạt độ xylanase đạt được cao nhất khi bổ sung nguồn nitơ là urê (tăng 20%), tiếp đó là cao thịt (tăng 19%); Tuy nhiên, khi bổ sung 4% các nguồn nitơ khác như nitrat, nitrit, cao thịt thì hoạt độ xylanase đều bị giảm, khoảng 15%.
Tiếp tục thí nghiệm với cao thịt. Bổ sung cao thịt vào cơ chất nuôi cấy chủng B2H2 với tỷ lệ lần lượt là: 1, 2, 4, 6, 8 và 10% theo khối lượng. Sau 3 ngày, tiến hành thu dịch enzyme và xác định hoạt độ enzyme. Kết quả thu được như sau:
70
Hình 3.14. Mức độ ảnh hưởng của cao thịt đến khả năng tổng hợp xylanase của chủng B2H2
Như vậy, khi bổ sung 4% cao thịt vào cơ chất nuôi cấy, hoạt độ xylanasethu được tăng 18% so với ban đầu. Với lượng cao thịt bổ sung ít hơn hoặc nhiều hơn 4%, hoạt độ xylanase của chủng sẽ giảm.
Hình 3.15. Mức độ ảnh hưởng của urea đến khả năng tổng hợp xylanase