3. Những đóng góp mới của đề tài
3.5. TINH SẠCH ENZYME
3.5.1. Tinh sạch enzyme xylanase chủng 118 theo phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion
Mặc dù trong lên men xốp hoạt độ xylanase thu được cao hơn gấp nhiều lần trong lên men dịch thể, tuy vậy, chúng tôi không sử dụng dịch enzyme thu được từ nuôi cấy xốp cho quá trình tinh sạch vì lý do trong dịch enzyme có lẫn nhiều tạp chất và có chứa một phức hợp nhiều loại enzyme khác nhau. Do đó, chúng tôi sử dụng dịch enzyme ngoại bào của quá trình lên men dịch thể cho quá trình tinh sạch xylanase từ chủng 118.
Chủng 118 được nuôi trên môi trường dịch thể X2. Sau 2 ngày, chúng tôi tiến hành thu dịch enzyme, ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút, 4oC và tủa aceton như đã nêu trong phần phương pháp.
Sử dụng mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa trong aceton, chúng tôi tra 2ml lên cột sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE. Sau khi rửa cột bằng đệm 20mM Tris-HCl pH 8.0 với thể tích gấp 5 lần thể tích cột, chúng tôi tiến hành thôi protein bằng dung dịch NaCl 1000mM. Các phân đoạn protein thu được đem xác định hoạt độ xylanase. Kết quả được thể hiện trong hình sau:
Hình 3.18. Sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE mẫu enzyme tủa aceton chủng 118
75
Kết quả trong hình 3.18 cho thấy, xylanase xuất hiện ở cả quá trình rửa cột (phân đoạn 4, 5, 6) và thôi cột (phân đoạn 28, 29, 30, 31). Như vậy, lượng enzyme tra lên cột có thể bị thừa hoặc chủng 118 sinh ra hai loại xylanase khác nhau, một loại xylanase không bám sepharose DEAE và một loại xylanase bám sepharose DEAE ở pH 8.0.
Để kiểm chứng lại điều này, chúng tôi tra lại dịch enzyme thu được ở các phân đoạn rửa cột có hoạt độ xylanase (phân đoạn 4, 5, 6) lên cột và chạy lại quá trình tinh sạch như đã mô tả. Kết quả thu được như sau:
Hình 3.19. Sắc ký trao đổi ion sử dụng dịch enzyme ở các phân đoạn có hoạt độ xylanase cao ở bước rửa cột
Kết quả thu được trong hình 3.19 chứng minh rằng, lượng enzyme xylanase tra lên cột ở lần chạy sắc ký đầu tiên không phải là do enzyme xylanase bị dư thừa. Dựa vào kết quả này chúng tôi dự đoán rằng chủng 118 có thể sinh 2 loại xylanase: một loại bám sepharose DEAE và một loại không bám sepharose DEAE.
Tiếp theo, chúng tôi tiến hành kiểm tra hoạt tính xylanase trên gel hoạt tính. Dịch enzyme xylanase thô và dịch enzyme tủa aceton được xử lý với 2- Mercaptoethanol (ME) hoặc không được xử lý với ME được tra vào các giếng điện di, các mẫu enzyme này không qua xử lý nhiệt. Kết quả được trình bày trong hình 3.20:
76
Hình 3.20. Điện di đồ trên gel hoạt tính các mẫu enzyme xylanase
1- Mẫu enzyme thô có ME; 2- Mẫu enzyme thô không có ME; 3- Mẫu enzyme tủa aceton có ME; 4- Mẫu enzyme tủa aceton không có ME.
Từ hình 3.20 ta thấy- ở cả mẫu xylanase có ME và không có ME- chúng tôi đều thấy xuất hiện 3 dải băng sáng giống nhau. Điều này cho thấy ME không ảnh hưởng đến xylanase của chủng 118.
Mặt khác, quan sát bản gel điện di ta thấy, các băng sáng rất rộng, không tạo thành vạch rõ rệt. Điều này có thể giải thích là do mẫu enzyme tra vào các giếng điện di không được xử lý nhiệt nên protein chưa bị biến tính hoàn toàn, do đó, cùng một phân tử protein có thể tồn tại dưới các dạng cấu trúc không gian khác nhau, mỗi cấu trúc không gian này tích điện âm khác nhau trong môi trường có SDS. Vì vậy, khi điện di các cấu trúc không gian này sẽ bị phân tán nên không nhìn rõ vạch trên bản gel.
Tiếp theo, để biến tính hoàn toàn protein và kiểm tra hoạt tính xylanase, chúng tôi tiến hành xử lý nhiệt các mẫu enzyme tủa aceton ở các nhiệt độ khác nhau, từ 55, 65, 75, 85 và 95oC trong 4 phút. Mẫu enzyme sau đó được xử lý tiếp với ME và tra vào các giếng điện di trên gel hoạt tính. Kết quả thu được như trong hình 3.21:
77
Hình 3.21. Điện di trên gel hoạt tính mẫu enzyme xylanase tủa aceton
1- không xử lý nhiệt; 2- xử lý nhiệt ở 55oC; 3- xử lý nhiệt ở 65oC; 4- xử lý nhiệt ở 75 oC; 5- xử lý nhiệt ở 85oC; 6- xử lý nhiệt ở 95oC.
Theo kết quả hình 3.21 ta thấy, ở giếng 1, khi mẫu xylanase tủa aceton không qua xử lý nhiệt, kết quả thu được giống như trong hình 3.20. Ở các giếng 2, 3, 4, khi các mẫu enzyme được xử lý ở nhiệt độ thấp hơn (55, 65, 75oC), chúng ta thấy các băng sáng rộng không còn nữa mà chỉ thấy các dải băng mờ, điều này có thể giải thích là do protein chưa hoàn toàn bị biến tính.
Ở các giếng 5 và 6, khi mẫu enzyme có ME được xử lý ở nhiệt độ cao hơn 85 và 95oC (mẫu được chuẩn bị giống như trong điện di SDS-PAGE), chúng ta thấy xuất hiện 2 vạch sáng rõ ở mỗi giếng.
Từ kết quả chạy sắc ký trao đổi ion (hình 3.18) và kết quả chạy điện di (hình 3.21), chúng tôi có thể kết luận rằng chủng 118 sinh ra 2 loại xylanase: một loại xylanase có kích thước phân tử nhỏ hơn (E1) và một loại xylanase có kích thước phân tử lớn hơn (E2).
3.5.2. Tinh sạch xylanase của chủng 118 bằng phƣơng pháp tủa trong muối ammonisunfat bão hòa kết hợp với sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE.
Như chúng ta đã biết, mỗi protein sẽ bị tủa ở một nồng độ muối ammonisunfat bão hòa nhất định. Do đó, chúng tôi tiến hành tủa xylanase chủng 118 bằng muối ammonisunfat bão hòa ở các nồng độ khác nhau. Kết quả xác định hoạt độ xylanase sau khi tủa được trình bày trong hình sau:
1 2 3 4 5 6
E2 E1
78
Hình 3.22. Hoạt độ xylanase chủng 118 thu hồi được khi tủa trong muối ammonisunfat bão hòa từ 30 đến 90% ammonisunfat bão hòa từ 30 đến 90%
Qua hình 3.22 ta thấy, khi tủa bằng muối ammonisunfat ở nồng độ từ 30 đến 90%, enzyme xylanase chủng 118 không bị tủa theo một chiều hướng nhất định, hoạt độ xylanase thu hồi được ở phân đoạn 30 và 80% cao hơn so với các phân đoạn khác, cao nhất ở phân đoạn 30% (500 U), tiếp theo là phân đoạn 80% (460 U), thấp nhất ở phân đoạn 50% (80 U).
Sử dụng mẫu enzyme thu được sau khi tủa trong ammonisunfat bão hòa để tra vào giếng điện di trên gel SDS-PAGE và gel hoạt tính, chúng tôi thu được kết quả như trong hình 3.23:
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 E2 E1 E2 E1 (a) (b)
79
1-Mẫu enzyme tủa aceton- ủ nhiệt ở 950C trong 4 phút; 2- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 30%; 3- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 40%; 4- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 50%; 5- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 60% ; 6- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 70% ; 7- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80%; 8- Mẫu enzyme
tủa ammonisunfat 90%.
Kết quả trong hình 3.23 cho thấy, trên bản gel SDS-PAGE có xuất hiện hai vạch rõ trùng với vị trí hai vạch sáng tương ứng trên bản gel hoạt tính.
Ngoài ra, chúng tôi còn nhận thấy, khi xylanase được tủa ammonisunfat ở nồng độ bão hòa từ 30 đến 50% trên bản gel chỉ thấy xuất hiện vạch của E2, và khi tủa ở các nồng độ bão hòa từ 50 đến 90% trên bản gel xuất hiện vạch của cả hai enzyme E1 và E2. Do đó, bằng phương pháp tủa ammonisunfat bão hòa ở nồng độ 30 đến 50%, chúng tôi có thể tách được enzyme E2 và ở các nồng độ ammonisunfat bão hòa từ 60 đến 90% thu được hỗn hợp cả 2 enzyme E1 và E2.
Dùng dịch enzyme thu được khi tủa ammonisunfat bão hòa 30 đến 50% tra lên cột sắc ký trao đổi ion, chúng tôi thấy đa số xylanase bám được sepharose DEAE (phân đoạn 28, 29, 30, 31) và bị thôi ra khi nồng độ NaCl tăng dần. Kết quả chạy cột được thể hiện trong hình sau:
Hình 3.24. Sắc ký trao đổi ion dịch enzyme tủa ammonisunfat 50%
Kết quả trong hình 3.24 cho thấy, xylanase lớn (E2) được tách ra bằng tủa ammonisunfat bão hòa 30 đến 50% bám được sepharose DEAE và bị đẩy ra ở bước thôi cột. Tiếp tục, chúng tôi tiến hành tủa dịch enzyme bằng ammonisunfat bão hòa
80
ở nồng độ từ 60 đến 80% và dùng dịch enzyme thu được tra vào cột sắc ký trao đổi ion. Kết quả chúng tôi thu được như sau:
Hình 3.25. Kết quả sắc ký trao đổi ion mẫu enzyme tủa ammonisunfat bão hòa 60 đến 80%
Qua hình 3.25, chúng tôi có thể kết luận rằng xylanase không bám sepharose DEAE là xylanase có khối lượng phân tử nhỏ hơn bị đẩy ra ở bước rửa cột. Như vậy, chúng ta thấy rằng có thể tách được 2 loại xylanase từ chủng 118 bằng phương pháp tủa trong ammonisunfat bão hòa.
Để xác định trọng lượng phân tử của hai loại xylanase từ chủng 118, chúng tôi tiến hành thí nghiệm chạy điện di trên gel SDS-PAGE. Các mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80% và enzyme E1, E2 được tra vào giếng điện di (thứ tự như trong hình 3.26).
81
Như vậy, bằng phương pháp tủa ammonisunfat bão hòa 30 đến 80% kết hợp sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE chúng tôi đã tách được hai loại xylanase từ chủng 118: một loại xylanase bám sepharose DEAE có kích thước phân tử là 36 kDa và một loại xylanase không bám sepharose DEAE có kích thước phân tử là 22 kDa (hình 3.26)
3.5. ĐẶC TÍNH ENZYME
Sau khi tách được 2 loại xylanase từ chủng 118 chúng tôi tiến hành xác định đặc tính của 2 loại enzyme này.
3.6.1. Đặc tính enzyme xylanase từ chủng 118
3.6.1.1. pH thích hợp
Sau 2 ngày nuôi cấy chủng vi sinh vật trên môi trường dịch thể thích hợp- thu dịch enzyme và đem xác định hoạt độ xylanase bằng phương pháp định lượng. Cơ chất sử dụng trong các lần định lượng được pha trong đệm ở các giá trị pH từ 2 đến 9.
E2 (36 kDa) E1 (22 kDa)
Hình 3.26. Điện di SDS-PAGE
M- marker (BSM0661; Biobasic); 1- Mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80%; 2- Dịch xylanase E1 và 3- Dịch Xylanase E2 thu được từ sắc ký trao đổi ion DEAE.
M 1 2 3 10 kDa 40 kDa 30 kDa 20 kDa 50 kDa 70 kDa 100 kDa
82
Hình 3.27. Dải pH thích hợp cho hoạt động của xylanase từ 118
Theo hình 3.27, xylanase thô không hoạt động khi pH môi trường dưới 4 và có hoạt động ở pH trong dải từ 4 đến 9 cao nhất ở pH6 và pH7. Đối với 2 enzyme xylanase tinh sạch (E1 và E2), E1 có dải pH rộng hơn E2 và hoạt độ xylanaseđạt cực đại ở pH 6, và giảm nhẹ ở giá trị pH7. Đối với các giá trị pH cao hơn (pH8 và pH9) hoạt độ của enzyme giảm mạnh, từ 92U/ml xuống 19 U/ml; Trong khi đó, hoạt độ của E2 cao nhất ở pH5. Ở pH6 và pH7 hoạt độ của enzyme giảm tuy nhiên không giảm mạnh như E1. Ở pH3 và dưới 3 enzyme E2 không có hoạt động.
3.6.1.2. Nhiệt độ thích hợp
Chủng 118 được nuôi cấy trong môi trường dịch thể thích hợp sau 2 ngày thu dịch enzyme và đem xác định hoạt độ. Hỗn hợp phản ứng enzyme được ủ ở các nhiệt độ tương ứng từ 35, 40, 45, 50, 55oC. Kết quả thu được như trong hình dưới đây:
83
Hình 3.28. Nhiệt độ phản ứng tối ưu của enzyme xylanase từ chủng 118
Như vậy, hoạt độ của xylanase thô và xylanase tinh sạch đều tăng dần khi nhiệt độ phản ứng tăng từ 35 đến 50oC, tuy nhiên nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động của cả 2 loại xylanase là 50oC, hay nói cách khác hiệu suất phân giải xylan của enzyme xylanase đạt cực đại ở nhiệt độ 50oC. Ở các nhiệt độ cao hơn nhiệt độ hoạt động tối ưu, hoạt độ của cả 3 enzyme đều giảm. Ngoài ra, chúng ta còn thấy đường biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ xylanase của hai loại xylanase tinh sạch E1 và E2 gần như trùng khít với nhau, có thể thấy rằng ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt động của 2 enzyme này gần như nhau.
3.6.1.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại
Dịch enzyme thu được sau khi nuôi cấy dịch thể 2 ngày được đem xác định hoạt độ sau khi bổ sung các ion kim loại. Trong hỗn hợp phản ứng enzyme, nồng độ ion kim loại thêm vào đạt 5mM. Kết quả được ghi trong hình 3.29:
84
Hình 3.29. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt động của enzyme xylanase từ 118
Kết quả hình 3.29 cho thấy, đối với enzyme xylanase thô, ion Fe2+ có khả năng làm tăng hoạt độ của xylanase (tăng 28% so với ban đầu), trong khi tất cả các ion kim loại khác đều ức chế hoạt động của enzyme này. Đối với 2 enzyme xylanase đã tinh sạch, Mn2+ và Fe2+ kích thích khả năng hoạt động của chúng. Đối với E1, ion Fe2+ tăng cường hoạt động của xylanase nhiều nhất, tiếp theo là Na+, Ca2+ và Mn2+, trong khi đó EDTA ức chế mạnh nhất. Đối với E2, ion Mn2+ tăng cường hoạt độ xylanase nhiều nhất, trong khi đó hầu hết các ion kim loại khác đều ức chế hoạt động của enzyme này, đặc biệt Cu2+ ức chế mạnh nhất.
85
Hình 3.30. Khả năng chịu nhiệt của các enzyme xylanase từ chủng 118 ở 600C
Theo hình 3.30 ta thấy, khi xử lý dịch enzyme xylanase từ chủng 118 ở 60oC trong các khoảng thời gian khác nhau 10 phút, 20 phút và 30 phút, hoạt độ của cả enzyme xylanase thô và tinh sạch đều giảm. Tuy nhiên, E2 có xu hướng bền nhiệt hơn so với enzyme xylanase thô và E1. Ở 60oC trong 10 phút, hoạt độ xylanase E2 còn 93%, trong khi enzyme E1 chỉ còn 50% và enzyme xylanase thô chỉ còn 70%. Như vậy, enzyme E2 gần như vẫn giữ được hoạt độ khá cao so với dịch enzyme ban đầu ở 60oC.
Tiếp tục thí nghiệm xử lý nhiệt 2 enzyme E1, E2 ở các nhiệt độ cao hơn 70oC, 80oC, 90oC và 100oC chúng tôi thu được kết quả như sau:
86
Hình 3.31. Khả năng bền nhiệt của hai loại xylanase tinh sạch từ chủng 118
Qua hình 3.31 chúng ta nhận thấy rằng, hoạt độ của cả 2 enzyme khi được xử lý ở các nhiệt độ 70oC, 80oC, 90oC và 100oC giảm đi đáng kể. Ở 70oC, hoạt độ xylanase E1 và E2 còn lại lần lượt là 20% và 38% so với mẫu enzyme không xử lý nhiệt. Hoạt độ cả hai enzyme gần như không còn ở 100oC. Tuy nhiên, xét tổng thể thì khả năng bền nhiệt của enzyme tinh sạch E2 cao hơn so với E1.
3.6.2. Đặc tính xylanase từ B2H2
3.6.2.1. pH thích hợp
Sau 2 ngày nuôi cấy chủng B2H2 trên môi trường dịch thể thích hợp, thu dịch enzyme và nhỏ vào các lỗ thạch cơ chất được chuẩn bị ở các giá trị pH khác nhau, đồng thời tiến hành định lượng xác định hoạt độ của enzyme. Cơ chất sử dụng trong các lần định lượng được pha trong đệm ở các giá trị pH từ 2 đến 9.
87
Hình 3.32. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ xylanase của chủng B2H2
Theo hình 3.32 ta thấy, xylanase do chủng B2H2 sinh ra không hoạt động ở pH dưới 4 và có hoạt động ở pH trong dải từ 5 đến trên 9, và hoạt động tốt nhất ở pH 6. Nhìn chung, xylanase của chủng B2H2 hoạt động được trong dải pH từ 5 đến 9.
3.5.2.2. Nhiệt độ
Chủng vi khuẩn B2H2 được nuôi cấy trong môi trường dịch thể thích hợp sau 2 ngày thu dịch enzyme. Dịch enzyme được nhỏ vào các lỗ thạch chứa cơ chất rồi đặt ở các nhiệt độ từ 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70oC, sau một ngày đo vòng phân giải xylan. Đồng thời cũng sử dụng dịch enzyme đó, tiến hành định lượng. Hỗn hợp phản ứng enzyme được ủ ở dải nhiệt độ tương ứng như trong định tính. từ 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70oC. Kết quả đo được thể hiện trong hình 3.33:
88
Như vậy, nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động của enzyme xylanase của chủng B2H2 khi định tính và định lượng đều là 50oC (Định tính: 33 mm, hoạt độ: 232 U/ml), hay nói cách khác enzyme xylanase hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 50oC.
3.5.2.3. Bền nhiệt
Sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường dịch thể thích hợp, thu dịch enzyme và