3. Những đóng góp mới của đề tài
2.2.7.2. Tủa enzyme trong muối ammonisunfat
Chủng 118 được nuôi trên các môi trường dịch thể X2- sau 2 ngày- thu dịch và tủa enzyme bằng ammonisunfat bão hòa 30 đến 90%.
Cách tiến hành
- 20 ml dịch nuôi cấy enzyme đựng trong ống Falcon 50 đặt trên máy khuấy từ. Muối ammonisunfat được thêm vào ở các nồng độ từ 30 đến 90% với khối lượng như sau:
Phân đoạn (1): 0 -> 30%: 3.28 g ammonisunfat. Phân đoạn (2): 30 -> 40%: 1 12 g ammonisunfat. Phân đoạn (3): 40 -> 50%: 1.16 g ammonisunfat. Phân đoạn (4): 50 -> 60%: 1-2 g ammonisunfat. Phân đoạn (5): 60 -> 70%: 1.24 g ammonisunfat. Phân đoạn (6): 70 -> 80%: 1.3 g ammonisunfat. Phân đoạn (7): 80 -> 90%: 1.34 g ammonisunfat.
Ở mỗi phân đoạn, dịch enzyme đã hòa tan ammonisunfat được ủ trong đá 30 phút sau khi đã hòa tan hoàn toàn ammonisunfat. Ly tâm hỗn hợp ở 9500 g/10phút ở 4oC. Chuyển dịch trong sau ly tâm sang một ống falcon khác- sau đó tiếp tục bổ sung ammonisunfat vào dịch này đến các nồng độ tiếp theo. Cặn sau ly tâm được bổ sung 200 µl nước cất (dịch enzyme được cô đặc 100 lần). Dịch thu được sau khi hòa tan hoàn toàn cặn được dùng để xác định hoạt tính xylanase. Một phần dịch này được dùng làm mẫu để chạy điện di SDS-PAGE.
2.2.7.3. Sắc ký trao đổi ion
Dịch enzyme sau khi tủa trong dung môi hữu cơ được tra lên cột sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE với tổng thể tích 15 ml. Cột sắc ký có kích thước 16 x 200 mm được cân bằng với 20mM Tris- HCl, pH 8.0. Sau khi rửa cột bằng đệm 20mM
53
Tris- HCl, pH 8.0, enzyme xylanase được đẩy ra bằng gradient NaCl (từ 0 đến 1000 mM). Tốc độ dòng đi qua cột là 3 ml/phút. Thu 20 phân đoạn. Thể tích mỗi phân đoạn là 5 ml. Xác định hoạt độ xylanase và nồng độ protein ở mỗi phân đoạn. Ở các phân đoạn có hoạt độ xylanase cao thì được giữ lại và tiếp tục được tra lại lên cột sắc ký trao đổi ion DEAE để thu xylanase.
2.2.8. Điện di