3. Những đóng góp mới của đề tài
1.4.3.2.Sắc ký trao đổi ion
Sắc ký trao đổi ion được sử dụng rộng rãi nhất, có thể bao gồm cả trao đổi cation và anion mạnh và yếu. Trong sắc ký trao đổi ion, các protein bị tách dựa trên sự khác nhau về điện tích. Các protein và enzyme nói chung được hấp phụ ở lực ion thấp hoặc ở các giá trị pH trong đó điện tích ion tổng số đủ mạnh để tương tác với điện tích đối của nhựa trao đổi ion. Sự tách rửa protein được thực hiện dễ dàng bằng cách thay đổi pH hoặc tăng lực ion của dung dịch rửa.
Quá trình phân tách trên cột bao gồm hai giai đoạn: - Hấp phụ thuận nghịch protein cần tinh sạch (và các protein có điện tích gần giống) vào nhựa trao đổi ion. - Khử hấp phụ các protein bằng cách: (1) thay đổi pH của dịch rửa sẽ dẫn đến thay đổi độ ion hóa và do đó thay đổi điện tích tổng của protein, (2) tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối cạnh tranh.
Trong sắc ký trao đổi ion, yếu tố quan trọng nhất là pH, khi pH môi trường đạt đến điểm đẳng điện của protein, protein trở thành chất tích điện âm bám vào chất trao đổi anion. Nếu pH môi trường chưa đạt đến điểm đẳng điện của protein thì protein trở thành tích điện dương và bám vào chất trao đổi cation. Bản chất của cột sắc ký trao đổi ion chính là một acid hoặc bazơ và nguyên tắc hoạt động của nó phụ
35
thuộc vào giá trị pH. Cột trao đổi ion mạnh chính là một acid hay base mạnh và chức năng của cột sẽ không thay đổi trong một khoảng pH rộng.
Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương , gọi là sắc ký trao đổi ion dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương thì tương tác với phân tử mang điện tích âm, gọi là sắc ký trao đổi ion âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích [33].
Trong sắc ký trao đổi ion, việc gắn một protein vào nhựa trao đổi ion sẽ phụ thuộc vào trạng thái ion hóa của nó, cũng như trạng thái ion hóa của nhựa trao đổi, pH, lực ion và nhiệt độ. Đối với những protein không bị biến tính ở pH cao hơn điểm đẳng điện của chúng thì có thể dùng DEAE-cellulose (nhựa trao đổi anion) còn đối với các protein không bị biến tính ở pH thấp hơn điểm đẳng điện của chúng thì có thể sử dụng ở CM-cellulose (nhựa trao đổi cation).