Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN

3. Những đóng góp mới của đề tài

2.2.4.1. Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN

a. Tách chiết ADN của vi khuẩn

Thực hiện theo phương pháp của Sakiyama và cộng sự (2009) - Nuôi vi khuẩn và xạ khuẩn trên môi trường dịch thể thích hợp. - Thu dịch, ly tâm 1.5ml dịch nuôi lấy sinh khối tế bào.

45

- Thêm 0,4 mg lysozyme. Trộn đều, ủ 370C trong 1 giờ. Trộn đều 3 phút. - Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 370C/30 phút. - Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều. Ly tâm 15.000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

- Thêm 8 l ARNse 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 370C trong 30 phút. - Thêm 12 l proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 560C.

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều. Ly tâm 15.000v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

- Thêm 1 thể tích tương ứng chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15.000v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

- Thêm 1/10 V Natri acetat 3M và 1ml Ethanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30 phút.

- Ly tâm 15.000v/p trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên. - Rửa tủa bằng ethanol 70%.

- Làm khô ADN bằng máy cô quay chân không. - Hoà tan ADN trong 50-100l nước hoặc TE. - Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di.

Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.

b. Phản ứng khuếch đại ADN

Thành phần phản ứng

Thành phần Thể tích (l)

10X buffer 10

dNTP 2.0 mM 10

Mồi xuôi (10 pmol/l) 2 Mồi ngược (10 pmol/l) 2 Taq polymerase (5u/l) 2 ADN khuôn (50-100g/l) 1-2

46 Chu trình nhiệt: 950C - 3 phút 950C - 30giây 560C - 15 giây 30 chu kỳ 720C - 1 phút 720C - 5 phút 400C -  Mồi

Mồi xuôi 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. Mồi ngược 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3' - Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.

c. Tinh sạch sản phẩm PCR.

Sử dụng bộ kit QIAgen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

-Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1. Trộn đều.

-Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút .

-Đổ bỏ dịch phía dưới cột.

-Bổ sung 750 l đệm PE lên cột. Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

-Đổ bỏ dịch dưới cột.

-Ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút.

-Chuyển cột sang ống Eppendoft mới.

-Thêm 30l nước. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút.

-Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút.

-Lấy dịch phía dưới.

Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:

Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh sạch : OD 260/OD 280 > 1,7

47 -Terminator Ready Reaction Mix (Termix): Buffer 5X 9l Bigdye Ready Reaction premix 18l H2O 9l -Thành phần phản ứng PCR cho đọc trình tự:

Termix 8l

Mồi (*) 1l

ADN khuôn 1l (nồng độ ADN là 40-60 g/ml)

H2O 10l (*) Các loại mồi đã sử dụng: 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'. 780F: 5'-GAATTGATACCCTGGTAG-3.' 350R: 5'-CTGCTGCCTCCCGTAG-3'. 1100F: 5'-GCAACGAGCGCAACCC-3'. 920R: 5'-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'. -Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen: 960C - 1phút

960C - 10giây 25 chu kỳ 500C - 5 giây

600C - 4 phút

e. Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự

-Chuyển 20l sản phẩm sang ống Eppendoft sạch

-Thêm 5l EDTA 125mM và 60l ethanol 100%. Để khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng.

-Ly tâm 15.000v/p, 15phút.

-Bỏ dịch, thêm 60l ethanol 70% để rửa, ly tâm 15.000v/p, 10 phút. -Làm khô.

-Thêm 10l HiDi Formamide. -Để ở 96oC trong 2 phút.

-Cho ngay mẫu vào nước đá lạnh.

-Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự. Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant.

48

f. Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Trình tự của rDNA 16S được xác định theo phương pháp của Kurtman và Robnett (1997), sử dụng phần mềm CLUSTAL W ver 1.83 của Thompson và đồng tác giả (1994). Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987).