88
Như vậy, nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động của enzyme xylanase của chủng B2H2 khi định tính và định lượng đều là 50oC (Định tính: 33 mm, hoạt độ: 232 U/ml), hay nói cách khác enzyme xylanase hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 50oC.
3.5.2.3. Bền nhiệt
Sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường dịch thể thích hợp, thu dịch enzyme và đem xử lý nhiệt ở 50, 60, 70, 80oC trong thời gian là 10 phút. Dịch enzyme sau khi xử lý nhiệt được xác định hoạt độ.
Hình 3.34. Khả năng chịu nhiệt của enzyme xylanase từ chủng B2H2
Theo hình 3.34 ta thấy, khi xử lý enzyme ở 60oC trong 10 phút, hoạt độ xylanase của chủng B2H2 giảm 10% so với hoạt độ xylanaseban đầu. Tuy nhiên, hoạt độ của enzyme giảm mạnh khi xử lý ở nhiệt độ cao hơn 70oC. Ở 80oC, hoạt độ xylanase giảm hơn 70% so với hoạt độ xylanase ban đầu. Ở 100oC hoạt độ xylanase gần như không còn.
3.5.2.4. Ảnh hưởng của ion kim loại
Dịch enzyme thu được sau khi nuôi cấy xốp 3 ngày được dùng trong phản ứng định lượng. Nồng độ ion kim loại trong hỗn hợp phản ứng enzyme là 5 mM.
89
Hình 3.35. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ xylanase của chủng B2H2 của chủng B2H2
Kết quả từ hình 3.35 cho thấy, một số ion kim loại có khả năng tăng cường hoạt động của enzyme xylanase trong khi một số lại ức chế. Ion Ca2+ tăng cường mạnh nhất hoạt độ xylanase (tăng 66% so với dịch enzyme ban đầu), tiếp đó là Mn2+ và ion Fe2+, ion Mg2+ làm giảm hoạt độ của enzyme mạnh nhất (giảm 44%).
90
KẾT LUẬN
1. Từ 26 chủng vi sinh vật được lưu giữ ở Bảo tàng giống Vi sinh vật đã chọn được 2 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng sinh xylanase cao.
2. Kết hợp phân tích trình tự DNAr 16S và đặc điểm hình thái, chủng B2H2 thuô ̣c loài Bacillus subtilis và chủng 118 thuộc loài Streptomyces misionensis.
3. Môi trường nuôi di ̣ch thể thích hợp cho gi ống khởi động của chủng B2H2 là V5 và chủng 118 là môi trường X2. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho cả hai chủng nghiên cứu là 40oC; pH 7.0; thời gian nuôi thích hợp cho giống khởi động của chủng B2H2 là 24h và chủng 118 là 42h.
4. Cơ chất thích hợp cho chủng B2H2 nuôi xốp là malt và chủng 118 là gạo. Độ ẩm nuôi cấy thích hợp cho cả hai chủng là 50%, thời gian 3 ngày, tỷ lệ giống cấy 15%. Nguồn nitơ bổ sung phù hợp nhất cho chủng B2H2 là cao thịt và urea cho chủng 118. Hỗn hợp khoáng thích hợp nhất là MA1 cho chủng B2H2 và MA3 cho chủng 118. Dung dịch thích hợp cho chiết rút enzyme là đệm 50mM phosphat pH 7.0 cho chủng B2H2 và nước cho chủng 118. Hiệu quả thu hồi enzyme cao nhất cho cả hai chủng đạt được khi sử dụng aceton lạnh.
5. Tinh sạch và tách chiết được hai loại xylanase từ chủng 118 sử dụng phương pháp kết tủa trong muối (NH4)2SO4 và sắc ký trao đổi ion Sepharose DEAE và bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE, xác định được trọng lượng phân tử của hai loại xylanase tinh sạch là 22 kDa cho E1 và 36kDa cho E2.
6. pH thích hợp cho hoạt độ xylanase của chủng 118 là pH6 cho enzyme thô và E1; pH5 cho E2. Nhiệt độ phản ứng thích hợp cho cả enzyme thô và tinh sạch là 50oC. Độ bền nhiệt là 60oC. Fe2+ tăng cường hoạt độ xylanase cho enzyme thô và E1; Mn2+ kích thích cho E2.
7. pH thích hợp cho enzyme xylanase của chủng B2H2 là pH6. Nhiệt độ phản ứng tối ưu là 50oC. Độ bền nhiệt là 600C. Ion kim loại làm tăng hoạt độ xylanase mạnh nhất là Ca2+.
91
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về đặc tính enzyme từ chủng 118
2. Tiếp tục tách chiết và tinh sạch xylanase từ chủng B2H2 và nghiên cứu đặc tính của enzyme xylanase tinh sạch sinh ra từ chủng này.
92
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học Enzym và ứng
dụng, Nhà xuất bản Giáo dục (16).
2. Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2009), ―Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa xylanase từ A. niger DSM1957”, Báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học
toàn quốc, Nhà xuất bản Đại học Thái Nguyên, tr. 701 – 704 (6).
3. Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn (2007), ―Nghiên cứu hoạt độ enzym ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải‖, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 25 (2009), tr. 101-106.
4. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ Enzyme, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
5. Trần Đinh Toa ̣i , Trần Thị Hồng, Lê Minh Trí, Đỗ Trung Sỹ, Hoàng Thị Bích, Nguyễn Thị Hà Giang (2008), ―Nghiên cứu sử du ̣ng cellulase tách từ actinomycetes để xử lý phế thải nông nghiệp‖ , Hóa sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y
học và công nghệ thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa ho ̣c và Kỹ thuâ ̣t , Hà Nội, tr. 901 – 903.
6. Nguyễn Quốc Trị, Nguyễn Văn Hải (2001), ―Tóm tắt những nghiên cứu về enzyme trong thức ăn cho lợn‖, Viện chăn nuôi - Bộ nông nghiệp và Phát triển nông thôn. 7. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Lợi, Lê
Doãn Diên (2005), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
TIẾNG ANH
8. Amani M.D., El A. and Amany S. Y. (2007), ―Xylanase production by Bacillus pumilus: Optimization by Statistical and Immobilization Methods‖, Journal of Agriculture and Biological Sciences, 3(6), pp. 727-732.
9. Annane T., Anu H. and Juha R. (1994), ―Three – dimensional structure of endo– 1,4–β –xylanase II from Trichoderma reesei: two conformational states in the active site‖, The Excellence in the Life Sciences Journal, 13 (11), pp. 2493-2501
10.Ashwani S., Neelam G., Jitender S., Kalika K., Ramesh C. K., Vijay K. G. (2007), ―Optimization of xylanase production using inexpensive agro-residues by alkalophilic Bacillus subtilis ASH in solid-state fermentation‖, World Journal of Microbiology and Technology, 24, pp. 633-640.
93
11. Chantasingh D., Pootanakit K., Champreda V., Kanokratana P., Eurwilaichitr L. (2005), ―Cloning, expression, and characterization of a xylanase 10 from
Aspergillus terreus (BCC129) in Pichia pastoris‖, Protein Expression and Purification, 46, pp. 143 – 149.
12. Chenyan Z., Yongtao W., Zhenhua L., Guanhua F., Duan L., Weiyun G., Huigen F.and Wu W. (2009), ―Acidic xylanase II from Aspergillus usamii: Efficient
expression in Pichia pastoris and mutational analysis‖, Life Science and Technology, 9, pp. 1472-6750.
13.Cohen M.F., Hideo Y., and Mark M. (2004), ―Bioremediation of soils by plant– microbe systems‖, International Journal of Green energy, 1, pp. 301–312.
14.Cristobal N. A., Gerardo G. S., PLilia A. B., Raul R. H., Jose L. M. H. and Juan C. C. E. (2008),‖ Perspectives of Solid State Fermentation for Production of Food Enzymes‖, American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 4 (4), pp. 354-
366.
15. Degefu Y. (2003), Cloning and characterization of xylanase gene from phytopathogenetic fungi with a special reference to Helminthosporium turcicum, the cause of the northern leaf blight of maize, University of Helsinki.
16. Frederic D. L. E., Virgine R., Josette L. B., Brirgit Q., and Jean M. P. (2004), ―Acidophilic adaptation of family 11 endo-β-1,4-xylanase: Modiling and mutational analysic‖, Protein Science, 13, pp. 1209-1218.
17. Ghose T. K. (1987), ―Measurement of cellulase activities‖, Pure and Applied Chemistry, 59(2), pp. 257-268.
18. Jane F.S. (2006), ―Mapping of residues involved in the interaction between the
Bacillus subtilis xylanase A and proteinaceous wheat xylanase inhibitors‖, Protein
Engineering, Design & Selection. 19, pp. 205-210.
19.Jiang Z. Q., Deng W., Li X. T., Ai Z. L., and Kusakebe L. T. (2005), ―Structure, Function and Applications of Industrial enzymes‖, Industrial enzymes, 4, pp. 67- 69.
20.Julio P., Andrew P. M. (2007), Industrial Enzymes: Structure, Function and Applications , University of Helsinki, pp. 65-97.
21.Ken K. Y. W., Larry U. L. T, and John N.S. (1988), ―Multiplicity of β-1,4-xylanase in microorganisms: Functions and application‖, Microbiological reviews, pp. 305-
94
22. Lee Y. E., Pyung O. L. (2004), ―Purification and Characterization of Two Thermostable Xylanases from Paenibacillus sp. DG , 22‖, Journal of Microbiology
and Biotechnology, 14 (5), pp. 1014 - 1021.
23.Maheswari M. U., Chandra T. S. (2000), ―Production and potential applications of a xylanase from a new strain of Streptomyces cuspidosporus‖, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 16, 257 - 263.
24. Masood S. M., Tahir N., Zulfiqar A. and Muhammad T. S. (2008), ―Xylanases and their application in baking industry‖, Food technology and Biotechnology, 46, p.
22-31.
25. Nicemol J. and Parukuttyamma P. (2006), ―Influence of mode of fermentation on production of polygalacturonase by a novel strain of Streptomyces lydicus‖, Food Technology and Biotechnology, 44, pp. 263–267.
26. Nyilas I., Acs K., Papp T., Nagy E., Vagvolgyi C. (2005), ―Agrobacterium
tumefaciens – mediated transformation of Mucor circinellnoides‖, Fonia Microbiology, 50 (5), pp. 415 – 420.
27. Sapre M.P., Jha H. and Patil M.B. (2005), ―Purification and characterization of a thermoalkalophilic xylanase from Bacillus sp.”, World Journal of Microbiology & Biotechnology, 21, pp. 649 - 654.
28. Susana R. C., Sanroman M. A. (2006), ―Application of solid-state fermentation to food industry—A review‖, Journal of Food Engineering, 76, pp. 291 - 302.
29. Taechowisan T., Peberdy J.F., Lumyong S. (2003), ―Chitinase production by endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 and its antagonism against
phytopathogenic fungi‖, Annals of Microbiology, 53 (4), pp. 447-461.
30.Ufuk B., Sebnem Y., Ferda G., Aysegul E. (2001), ―An endo-1,4-xylanase from
Rhizopus oryzae: production, partial purification and biochemical characterization‖, Journal of Applied Sciences Research, 6 (9), pp. 1373-1378.
31.Yin et al., Agric J. (2010), Food Chemistry, 58, pp. 557–562 .
32. Waksman S. A. (1961), The Actinomycetes : Classification, identification and
95 33.www.bioclub.forumotion.com/t22,topic 34.www.mt.lhu.edu.vn 35.www.ncfar.org 36.www.sciencedirect.com/science 37.www.sigmaaldrich.com 38.www.tailieu.vn 39.www.vi.wikipedia.org 40.www.wattpad.com
96
PHỤ LỤC 1. Trình tự ADN 16S của 2 chủng nghiên cứu
a. Trình tự rDNA 16S của chủng XK118 GATTCTGGCTCAGGACGAACGCGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCG AACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACA CGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCT AATACCGGATATGACCATCTTGGGCATCCTTGATGGTGTAAAGCTCCGG CGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGC TCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACA CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA ATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGA TGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGT GACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAG CTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCC GGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGG AATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGT GGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCG TGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGT GGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACG CATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAA GGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCG ACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCAT TAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGT CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA CCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGG GAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCA TCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACA ATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCA GTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGAC b. Trình tự ADNr 16S của chủng B2H2 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAG CGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTA
97 ACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGG GGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGT GGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGG TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGG TGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG CAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG CCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGA AGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGG CAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCT TAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAA CTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCG GTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCT CTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTA GGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACgcaTTAAGCACTCCGCCT GGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCC GCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACC TTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTT CGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTG AGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGC CAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG AAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACA CACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAA GCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGA CTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTG AATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTT GTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAG GTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGT
98
2. Vòng phân giải cơ chất xylan của 2 chủng B2H2 và 118
Vòng phân giải cơ chất xylan của chủng B2H2
Vòng phân giải cơ chất xylan của chủng 118