3. Những đóng góp mới của đề tài
1.3.1. Khái niệm lên men xốp
Thuật ngữ lên mên xốp được dùng cho các quá trình mà trong đó vi sinh vật sinh trưởng bằng cách sử dụng các vật liệu không tan trong nước, trong quá trình lên men này độ ẩm không vượt quá hàm lượng bão hòa của cơ chất xốp. Nước là yếu tố thiết yếu cho sự sinh trưởng của vi sinh vật trong lên men xốp, mặc dù chỉ
27
cần một lớp nước mỏng và thông thường nước sẽ được hấp thụ vào bên trong cơ chất.
1.3.2. Ƣu điểm của kỹ thuật lên men xốp
Trước đây, ở các nước phương Tây, lên men xốp vẫn ít được chú ý so với lên men dịch thể. Sự khác nhau cơ bản nhất giữa các quá trình lên men này là ở một số yếu tố như độ ẩm tối ưu, sự hình thành gradient nhiệt độ, gradient dinh dưỡng, các sản phẩm lên men, cơ chế hình thành bào tử cũng như khả năng sinh enzyme và cơ chế hình thành các chất trao đổi thứ cấp trong quá trình lên men như các chất kháng sinh, acit citric và các chất tạo mùi.
Các cơ chất được sử dụng trong lên men xốp được thu thập từ các phế phẩm công nông nghiệp (ví dụ, trấu lúa mì hoặc lúa mì, bã mía, bã cà phê, bã nho, cùi dừa,…) hoặc các nguyên liệu trơ (các chất nhựa trong trao đổi ion) cũng được sử dụng. Cơ chất sử dụng gần như không phải xử lý trước khi dùng, trường hợp phải tiền xử lý thì chỉ cần rửa qua bằng nước.
Các ưu điểm chính của kỹ thuật lên men xốp:
-Môi trường nuôi cấy đơn giản. Một số cơ chất có thể được sử dụng trực tiếp làm môi trường xốp hoặc được cho thêm một số dưỡng chất trước khi sử dụng.
-Sản phẩm enzym thu được ở dạng đậm đặc.
-Độ ẩm tối ưu thấp và phần lớn giống cấy được sử dụng trong lên men xốp giảm được tối đa nguy cơ nhiễm độc vi sinh vật.
-Lượng chất thải sinh ra trong lên men xốp ít hơn so với lên men dịch thể -Enzyme tạo ra ít nhạy cảm với các chất kìm hãm hoặc ức chế trao đổi chất. Mặc dù có nhiều ưu điểm vượt trội nhưng kỹ thuật lên men xốp cũng vẫn tồn tại một số ít nhược điểm như sau:
-Vi sinh vật được dùng trong nghiên cứu bị giới hạn khả năng sinh trưởng vì độ ẩm của môi trường hạn chế.
-Việc xác định các thông số như độ ẩm, pH, hàm lượng oxy và CO2 tự do là một vấn đề khó khăn vì thiếu dụng cụ tiến hành.
-Phạm vi ứng dụng kỹ thuật lên men xốp còn chưa được nghiên cứu rộng rãi. Tuy vậy xét về tổng thể, kỹ thuật lên men xốp vẫn có nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với các loại hình lên men khác: thân thiện với môi trường sống tự nhiên của các vi sinh vật; năng suất cao hơn trong sản xuất một số loại enzyme nhất định (Babu & cộng sự, 1995; Jecu, 2000); tiết kiệm không gian sản xuất; môi trường
28
nuôi cấy chuẩn bị đơn giản; máy móc, hệ thống máy móc kiểm soát kỹ thuật và trang thiết bị không phức tạp; giảm được nguồn năng lượng đầu vào[1].
Trong những năm gần đây các nghiên cứu về enzyme (Pandey & cộng sự,1999), chất tạo hương vị (Ferron & cộng sự, 1996), chất tạo màu (Johns & cộng sự, 1991) và các chất cần thiết trong công nghiệp thực phẩm bằng lên men xốp đã chỉ ra rằng lên men xốp có thể tạo ra được năng suất cao hơn (Tsuchiya & cộng sự, 1994) hay chất lượng sản phẩm tạo ra tốt hơn (Arguelles & cộng sự, 1995) so với lên men dịch thể [28].
Trong lên men xốp, do độ ẩm thấp nên chỉ có một số loài vi sinh vật nhất định có khả năng thích nghi, chủ yếu là nấm men và nấm, tuy nhiên một số ít loài vi khuẩn cũng được sử dụng trong quá trình này (Pandey & cộng sự, 2000). Một vài ví dụ điển hình về các vi sinh vật được dùng trong lên men xốp và ứng dụng của chúng được ghi trong bảng sau:
Bảng 1.3. Một số nhóm vi sinh vật được dùng trong lên men xốp (Raimbault, 1998)
Nhóm vi sinh vật Quá trình lên men xốp thực hiện/ Ứng dụng Vi khuẩn
Bacillus sp. Ủ phân bón, sinh amylase, xylanase
Pseudomonas sp. Ủ phân bón
Serratia sp. Ủ phân bón
Streptococcus sp. Ủ phân bón
Lactobacillus sp. Thực phẩm, thức ăn gia súc
Clostridium sp. Thực phẩm, thức ăn gia súc
Nấm men
Endomicopsis burtonii Lên men sắn, gạo
Saccharomyces cerevisiae Thực phẩm, rượu
Schwanniomyces castelli Lên men rượu
Nấm
Altemaria sp. Ủ phân bón
Aspergillus sp. Ủ phân bón, thực phẩm công nghiệp
Fusarium sp. Ủ phân bón
Monilia sp. Ủ phân bón
Mucor sp. Ủ phân bón, thực phẩm, enzyme
Rhizopus sp. Ủ phân bón, thực phẩm, enzyme, acid hữu cơ
Phanerochaete chrysosporium Ủ phân bón, phân hủy lignin
Trichoderma sp. Ủ phân bón, Kiểm soát sinh học, thuốc trừ sâu sinh học
Beauveria sp., Metharizium sp. Kiểm soát sinh học, thuốc trừ sâu sinh học
29
Aspergillus oryzae Koji, thực phẩm
Rhizopus oligosporus Lên men amylase, lipase, đậu tương
Aspergillus niger Thức ăn chăn nuôi, proteing, amylase và acid citric
Pleurotus oestreatus, sajor-caju Nấm
Lentinus edodes Nấm
Penicilium notatum, roquefortii Sản xuất penicilin, nấm
Quá trình lên men xốp sử dụng Aspergillus oryzae (thường được gọi là Koji) được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các loại đồ uống như rượu, bia và các thức uống có cồn, Penicillium roque-fortii được dùng trong sản xuất pho mát. Ở
Trung Quốc, lên men xốp được dùng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm pha chế (như rượu, nước tương, và giấm) từ những năm 1990 (Chen, 1992). Ở Nhật, lên men xốp trở thành một ngành thương mại sản xuất các enzyme công nghiệp (Suryanarayan, 2003). Từ năm 1986 ở Brazil, nhiều dự án nghiên cứu về giá trị của sản phẩm nông nghiệp ở các vùng nhiệt đới và các sản phẩm phụ nhờ lên men xốp được thực hiện quy mô lớn sử dụng các phế thải nông nghiệp của chính quốc gia này (Soccol & Vandenberghe, 2003).
Năm 2000, nhóm tác giả Maheswari & cộng sự thuộc Viện nghiên cứu công nghệ Ấn Độ đã tiến hành công trình nghiên cứu ―Sử dụng kỹ thuật lên men xốp trong sản xuất và nghiên cứu các ứng dụng của xylanase từ chủng xạ khuẩn
Streptomyces cuspidosporus”. Chủng xạ khuẩn này được phân lập từ các mẫu đất mùn ngay trong khuôn viên của Viện. Đây là một trong những công trình đầu tiên được công bố trong lĩnh vực sản xuất enzyme xylanase từ chủng Streptomyces cuspidosporus bằng lên men xốp [27].
Năm 2007, Sanghi & cộng sự đã sử dụng kỹ thuật lên men xốp để sản xuất xylanase từ Bacillus subtilis ASH sử dụng cơ chất là phế thải trong nông nghiệp.
Theo kết quả của nhóm tác giả, hoạt độ xylanase đạt được lên đến 7482 ± 45.21 U/g. Công trình nghiên cứu này không chỉ có ứng dụng rộng rãi trong xử lý môi trường, xử lý rác thải mà còn chứng minh được ưu điểm vượt trội của lên men xốp trong công nghệ sản xuất enzyme [26].
Aguilar & cộng sự (2008) đã công bố công trình nghiên cứu về những ưu điểm của lên men xốp trong lĩnh vực sản xuất enzyme thực phẩm. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã so sánh hiệu quả của lên men xốp so với các loại hình lên men khác. Kết quả cho thấy, lên men xốp có nhiều ưu điểm hơn cả và có thể tạo ra hiệu suất sản xuất enzyme cao nhất trong các kỹ thuật lên men sản xuất.
30
Cho đến nay, các nghiên cứu về việc sản xuất và ứng dụng của các loại enzyme được sinh ra nhờ lên men xốp được công bố ngày càng nhiều. Việc sử dụng kỹ thuật lên men xốp để sản xuất một lượng lớn các loại enzyme trở nên phổ biến trên toàn thế giới. Nhìn chung, các nghiên cứu về lên men xốp hiện nay vẫn đang tiếp tục được các nhà khoa học tiến hành ở các quy mô lớn nhỏ sử dụng các chủng vi sinh vật khác nhau nhằm phục vụ cho nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng tăng cao.
1.4. TINH SẠCH ENZYME XYLANASE
Trong các tổ chức của cơ thể sống, protein có thể ở dưới dạng tự do trong các dịch sinh vật hoặc dưới dạng kết hợp, hoặc bị giữ trong các tế bào. Hơn nữa, trong tế bào có chứa hàng nghìn loại protein khác nhau, nên khi chúng ta cần nghiên cứu từng loại protein, trước hết phải chiết rút và tinh sạch chúng. Chính vì vậy, các kỹ thuật chiết rút, tinh sạch và nghiên cứu protein luôn ở vị trí trung tâm của các nghiên cứu hóa sinh và luôn được cập nhật và hiện đại hóa [38].
Tinh sạch enzyme là một chuỗi các quá trình liên tiếp nhằm tách riêng một loại enzyme từ hỗn hợp ban đầu. Tinh sạch enzyme là quá trình thiết yếu để xác định được các đặc tính về cấu trúc - chức năng, động lực học, cơ chế xúc tác và sự tương tác giữa các loại enzyme quan trọng. Nguyên liệu khởi đầu được sử dụng cho quá trình tinh sạch thường là một loại mô sinh học hoặc dịch nuôi cấy vi sinh vật. Quá trình tinh sạch enzyme cho phép tách chiết một loại enzyme từ một hỗn hợp ban đầu có chứa loại enzyme đó, tách riêng các phần có bản chất là protein và phần không có bản chất là protein trong hỗn hợp. Quá trình tách chiết này là một quá trình khá phức tạp. Các bước tách chiết này dựa vào kích thước phân tử, đặc tính lý hóa, khả năng bám dính và hoạt độ sinh học của từng loại enzyme.
Mục đích của việc tinh sạch enzyme nhằm tối ưu hóa hoạt độ xúc tác của enzyme, tinh sạch tối đa được enzyme và nghiên cứu các đặc tính của chúng. Tinh sạch enzyme còn được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y tế và công nghiệp.
Muốn tinh sạch được enzyme mà vẫn giữ nguyên được đặc tính của nó thì chúng ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, dựa vào nhiệt độ, nồng độ proton (pH), hoặc các tác nhân hóa học (các muối trung tính (NH4)2SO4, Na2SO4, …).
Để tinh sạch được enzyme, người ta thường sử dụng kết hợp đồng thời nhiều kỹ thuật khác nhau: thu hồi enzyme bằng muối ammonisunfat, sắc ký trao đổi ion, điện di SDS-PAGE và điện di trên gel hoạt tính.
31
1.4.1. Tủa enzyme bằng muối ammonisunfat
Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng này gọi là tủa bằng muối (salting out). Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ muối nhất định. Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạn protein. Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ để thu hồi các protein enzyme. Phương pháp này được tiến hành dựa trện cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước. Người ta có thể dùng các muối trung tính để tủa protein vì các muối này vừa làm trung hòa điện tích (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng.
Hầu hết enzyme tồn tại trong dịch tế bào đều là những protein ở dạng hoà tan. Độ hoà tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác có cực của protein với dung môi, sự tương tác ion của protein với các phân tử muối hiện diện trong dung dịch và sự tương tác tĩnh điện giữa phân tử mang điện tích hay những nhóm phân tử mang điện tích của protein kết dính lại với nhau.
Quá trình kết tủa protein bằng dung dịch muối có nồng độ cao phụ thuộc rất lớn vào tính kỵ nước của phân tử protein. Trong dung dịch các gốc kỵ nước của phân tử protein tập trung trên bề mặt, tiếp xúc trực tiếp với các phân tử nước. Các phân tử nước này ngăn cản quá trình hình thành liên kết tạo kết tủa giữa các phân tử protein như nhau. Khi nồng độ dung dịch muối tăng các phân tử muối bị solvate hoá làm giảm số phân tử nước xung quanh bề mặt các phân tử protein tạo điều kiện cho các bề mặt kỵ nước tiến đến gần nhau và kết tủa xuống.
Mặc dù quá trình kết tủa bằng dung dịch muối có nồng độ cao phụ thuộc nhiều vào các phần tử kỵ nước của protein nhưng các yếu tố khác như pH, nhiệt độ cũng gây ảnh hưởng đến quá trình này. Ở pH gần điểm đẳng điện pI thì quá trình kết tủa xảy ra dễ dàng hơn và khi nồng độ muối cao thì độ hoà tan của protein giảm. Ngoài ra, trong quá trình kết tủa protein bằng muối có nồng độ cao cần lưu ý đến bản chất của muối dùng kết tủa những loại muối có gốc anion tích điện tích âm như: SO42-, PO43-,... là những loại muối làm tăng hiệu quả của quá trình kết tủa. Gốc cation tuy không ảnh hưởng nhiều nhưng lưu ý không sử dụng các ion phức hoặc các ion có khả năng hình thành liên kết với phân tử protein. Dó đó những ion NH4+, Na+, K+ thường được sử dụng.
32
Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4... Tuy nhiên, muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm bền hầu hết các loại protein enzyme. Loại muối này lại rẻ tiền và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 250C). Nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa protein enzyme khác nhau là khác nhau.
Có thể dùng (NH4)2SO4 ở cả 2 dạng: dạng bột và dạng dung dịch bảo hòa. Khi dùng bột, người ta cho từng ít một vào dịch chiết protein enzyme. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein enzyme. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối. Nếu thêm từng phần các dung môi hữu cơ hoặc từng phần muối (NH4)2SO4 thì ta có thể tách từng phần hỗn hợp protein. Tuy nhiên, để phân chia hoàn toàn những hỗn hợp phức tạp, phương pháp này không cho kết quả tốt vì độ hòa tan của một số protein bị tăng lên. Mặc dầu vậy, cách kết tủa từng phần này cũng rất có lợi, đặc biệt là đối với giai đoạn đầu của việc tách chiết và làm sạch protein emzyme, vì phương pháp khá đơn giản[34].
1.4.2. Tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol,…) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường. Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nước như aceton vào dung dịch chứa protein.
Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp. Thường các protein bị biến tính bởi các dung môi hữu cơ nên cần thiết làm việc ở nhiệt độ dưới 0oC.
Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ như cồn và aceton là sự kết tủa thuận nghịch, do đó khi không còn tác nhân gây kết tủa nữa thì protein lại trở lại trạng thái hoà tan bình thường. Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol có nhiều thuận lợi hơn so với
33
các dung môi hữu cơ khác vì chi phí tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió. Do bản chất dễ cháy của các dung môi hữu cơ nên cần phải sử dụng