4. Nội dung nghiên cứu
2.4.9.Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu trong báo cáo là kết quả trung bình của ba lần phân tích trình bày ở dạng trung bình ± SD. Sử dụng phần mềm SPSS 18 trong thiết kế thí nghiệm, xử lý số liệu thực nghiệm (Giá trị của p < 0,05 đƣợc coi là có ý nghĩa về mặt thống kê), vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft Excel, tối ƣu hóa đƣợc xử lý bằng phần mềm Design-Expert 8.0.2.
NaCl 0,5% (w/w) Bột đậu nành 5% (w/w)
Hàm lƣợng chất bổ sung tối ƣu Mật độ vi khuẩn lactic tối ƣu Hàm lƣợng ẩm
thí nghiệm 2.3.5.1
Sản phẩm bã sắn lên men dùng trong chăn nuôi Bã sắn khô
ح tối ƣu To = ?
pH tự nhiên của nguyên liệu Lên men
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phƣơng pháp xác định cyanua trong sắn và bã sắn
3.1.1. Xác định hoạt độ của linamarase thu được từ nhựa lá sắn non
Việc xác định hoạt độ linamarase thu đƣợc từ nhựa lá sắn non cho thấy: với 0,1 ml linamarase đƣợc thêm vào trong một ống chứa 1 ml linamarin ở 30 ± 2 o
C trong 15 phút thì giải phóng 75,6 µg cyanua tự do và giải phóng 156,2 µg cyanua tổng số. Nhƣ vậy, hoạt độ linamarase thu đƣợc từ nhựa và lá sắn trong nghiên cứu này là 1,87 U/ml. Giá trị này lớn hơn so với kết quả nghiên cứu của Rezaul Haque (1999) (1,2 U/ml [68]) và lớn hơn trong báo cáo của Ogbonnaya (2011) – trong đó hoạt độ linamarase thu đƣợc từ vi sinh vật là 1,41 U/ml. [63]
3.1.2. Xác định lượng linamarase thích hợp thủy phân hoàn toàn linamarin trong cơ chất
Kết quả xác định lƣợng linamarase thủy phân linamarin có trong cơ chất dƣ đƣợc thể hiện ở Hình 3.1
Hình 3.1: Hàm lƣợng HCN giải phóng khi sử dụng linamarase
Sử dụng linamarase thủy phân linamarin trong bã sắn tƣơi cho thấy: hàm lƣợng cyanua tự do trong mẫu bã sắn tƣơi là 103,18 mg/kg khối lƣợng chất khô. Hàm lƣợng cyanua tổng số đƣợc giải phóng là 249,92 mg/kg khối lƣợng chất khô. Nhƣ vậy, lƣợng cyanua tổng số gấp 2,4 lần so với lƣợng cyanua tự do. Kết quả trên cũng đã chỉ ra rằng
trên 1,3 đơn vị hoạt độ linamarase thì cyanua tổng số đƣợc giải phóng trong quá trình thủy phân thay đổi không đáng kể. Vì thế, trong nghiên cứu này tiến hành chọn một lƣợng linamarase lớn hơn 1,5 đơn vị/10 g khối lƣợng tƣơi (1,7 g chất khô) để định lƣợng cyanua tổng trong sắn và bã sắn.
3.1.3. Hàm lƣợng cyanua tổng số trong sắn và bã sắn
3.1.3.1. Hàm lƣợng cyanua tổng số trong sắn tƣơi ở tỉnh Khánh Hòa
Hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do trong sắn tƣơi ở tỉnh Khánh Hòa đƣợc thể hiện ở Hình 3.2. Sắn tƣơi sử dụng làm thức ăn cho ngƣời và gia súc có hàm lƣợng cyanua cao, điều này dẫn đến khả năng ngộ độc cao khi dung nạp vào cơ thể một lƣợng quá lớn. Sắn tƣơi trồng ở huyện Khánh Vĩnh có hàm lƣợng cyanua tự do và cyanua tổng số cao nhất là 137 mg/kg khối lƣợng chất khô và 331 mg/kg khối lƣợng chất khô. Sắn tƣơi trồng ở huyện Diên Khánh có hàm lƣợng cyanua tự do và cyanua tổng số thấp nhất là 65 mg/kg khối lƣợng chất khô và 161,1 mg/kg khối lƣợng chất khô. Kết quả này phù hợp với kết quả của Cereda (1996), hàm lƣợng cyanua trong sắn dao động từ 30 ÷ 150 mg/kg khối lƣợng chất khô [33]; kết quả của Eric Mantey Obilie (2004), hàm lƣợng cyanua từ 63 ÷ 110 mg/kg khối lƣợng chất khô [42]; kết quả của Trần Thị Hoan (2012), hàm lƣợng cyanua từ 30 ÷ 400 mg/kg khối lƣợng chất khô. [6]
Hình 3.2: Hàm lƣợng cyanua trong sắn tƣơi tại một số huyện ở tỉnh Khánh Hòa
Nhìn vào biểu đồ cũng cho ta thấy, hàm lƣợng cyanua tự do dao động từ 41 ÷ 50% lƣợng cyanua tổng/khối lƣợng chất khô. Kết quả này phù hợp với báo cáo của Kobawila (2005), hàm lƣợng cyanua tự do chiếm 43% lƣợng cyanua tổng/khối lƣợng chất khô [55]. Điều đó chứng tỏ rằng nếu chỉ ngâm mẫu có mặt cyanua trong nƣớc và dùng nhiệt để lôi cuốn HCN theo hơi nƣớc thì chỉ có thể xác định đƣợc cyanua ở dạng tự do mà không thể xác định đƣợc cyanua ở dạng hợp chất. Do đó, không thể xác định đƣợc hàm lƣợng cyanua tổng.
3.1.3.2. Hàm lƣợng cyanua tổng số trong bã sắn tƣơi
Hình 3.3: Hàm lƣợng cyanua trong bã sắn tƣơi từ nhà máy chế biến sắn.
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu)
Hình 3.4: Hàm lƣợng cyanua trong bã sắn tƣơi từ các hộ chế biến sắn thủ công
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu) Để sử dụng bã sắn tƣơi qua quá trình chế biến tinh bột sắn làm thức ăn chăn nuôi thì hàm lƣợng acid cyanhydric phải nằm trong tiêu chuẩn cho phép 100 mg/kg khối lƣợng chất khô [12]. Nhìn vào biểu đồ ta thấy: chỉ có hàm lƣợng cyanua tự do trong bã sắn tƣơi từ nhà máy chế biến và từ hai hộ chế biến sắn thủ công thấp hơn 100 mg/kg khối lƣợng chất khô. Bã sắn tƣơi từ nhà máy chế biến sắn có hàm lƣợng cyanua tự do cao nhất là 100 mg/kg khối lƣợng chất khô, thấp nhất là 57 mg/kg khối lƣợng chất khô. Bã sắn tƣơi từ hộ chế biến sắn thủ công có hàm lƣợng cyanua tự do cao nhất 111,9 mg/kg khối lƣợng chất khô, thấp nhất là 61,3 mg/kg khối lƣợng chất khô. Hàm lƣợng cyanua tổng số của bã sắn tƣơi từ nhà máy chế biến sắn cao nhất là 241 mg/kg khối lƣợng chất khô, thấp nhất là 126 mg/kg khối lƣợng chất khô. Hàm
lƣợng cyanua tổng số của bã sắn tƣơi từ các hộ chế biến sắn thủ công cao nhất là 270,18 mg/kg khối lƣợng chất khô, thấp nhất là 142,6 mg/kg khối lƣợng chất khô. Kết quả này lớn hơn kết quả trong báo cáo của Bùi Quang Tuấn (2005), trong đó hàm lƣợng cyanua trong bã sắn tƣơi 200,35 mg/kg [21]. Nhìn chung, bã sắn tƣơi từ nhà máy có hàm lƣợng cyanua tổng số thấp hơn so với bã sắn tƣơi từ các hộ chế biến thủ công và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt này có thể do quá trình sản xuất tinh bột sắn ở nhà máy đƣợc xử lý qua nhiều công đoạn nhƣ: băm, mài, nghiền, tẩy màu, ép tách bã, cô đặc, ly tâm tách nƣớc, sấy khô nên hàm lƣợng cyanua tổng đã đƣợc loại bỏ trong các công đoạn đó. Nhƣ vậy, hàm lƣợng cyanua tổng số của bã sắn tƣơi từ nhà máy chế biến sắn hay từ các hộ chế biến thủ công đều vƣợt quá giới hạn cho phép khi sử dụng làm thức ăn chăn nuôi.
3.1.3.3. Hàm lƣợng cyanua tổng số trong bã sắn khô
Kết quả định lƣợng cyanua tổng số trong bã sắn khô từ nhà máy chế biến sắn đƣợc thể hiện ở Hình 3.5.
Hình 3.5: Hàm lƣợng cyanua trong bã sắn khô từ nhà máy chế biến sắn
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu)
Do quá trình phơi nắng dài ngày, hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do trong bã sắn khô giảm đi đáng kể nhƣng độc tố cyanua vẫn còn tồn tại bên trong bã sắn khô. Cụ thể là, hàm lƣợng cyanua tổng số cao nhất là 77,9 mg/kg khối lƣợng chất khô, thấp nhất là 40,44 mg/kg khối lƣợng chất khô. Hàm lƣợng cyanua tự do cao nhất
là 38,6 mg/kg khối lƣợng chất khô, thấp nhất là 26,3 mg/kg khối lƣợng chất khô. Kết quả này phù hợp với báo cáo của Bùi Quang Tuấn (2005), hàm lƣợng cyanua trong bã sắn khô là 78 mg/kg khối lƣợng chất khô [21] và đƣợc chứng minh bởi Muzanila (1999). [58]
3.2. Thành phần nguyên liệu
Thành phần nguyên liệu của bã sắn tƣơi và bã sắn khô sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc chỉ ra ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Thành phần nguyên liệu của bã sắn tƣơi và bã sắn khô
(*): Tính theo khối lượng chất khô tuyệt đối
So với các công trình nghiên cứu khác thì hàm lƣợng cyanua tự do, hàm lƣợng ẩm, hàm lƣợng protein tổng số của bã sắn tƣơi nhỏ hơn kết quả của Nguyễn Văn Hữu (2008) là 240 mg/kg, 3,6%, 89,8% [22]; kết quả của Bùi Quang Tuấn (2005) là 162,4 mg/kg, 85,65%, 2,02% [21] và lớn hơn kết quả của Aro, hàm lƣợng protein là 1,12% [28]. Hàm lƣợng khoáng tổng số nhỏ hơn kết quả của Bùi Quang Tuấn (2005) là 1,88% [21], Nguyễn Văn Hữu (2008) là 2,8% [22] và kết quả của Aro (2008) là 2,84% [28]. Nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau này có thể là do mỗi giống sắn có các thành phần khác nhau và điều kiện trồng trọt ở các vùng miền khác nhau. Kết quả phân tích cho thấy bã sắn tƣơi có hàm lƣợng ẩm cao nên dễ dàng bị hƣ hỏng do nấm men, nấm mốc, bị bốc mùi khó chịu trong thời gian dài. Hàm lƣợng protein, hàm lƣợng khoáng và hàm lƣợng acid thấp, hàm lƣợng cyanua tổng số cao (> 100 mg/kg khối lƣợng chất khô). Do đó, việc ủ chua để thực hiện quá trình lên men bã sắn nhằm giảm hàm lƣợng cyanua tổng, tăng độ chua sẽ nâng cao giá trị sử dụng và tạo mùi vị dễ chịu cho gia súc và góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng.
Kết quả nghiên cứu thành phần nguyên liệu của bã sắn khô thấp hơn kết quả của Bùi Quang Tuấn (2005), hàm lƣợng ẩm, hàm lƣợng protein, hàm lƣợng khoáng là
Thành phần Bã sắn tƣơi Bã sắn khô Protein tổng số * 1,15 ± 0,013% 1,76 ± 0,052% Khoáng tổng số* 0,113 ± 0,01% 0,311 ± 0,05% Ẩm 82,3 ± 0,95% 11,18 ± 0,92% Độ acid 0,28 ± 0,008%. là 0,115 ± 0,009% Cyanua tổng số* 241 ± 5,8 mg/kg 78 ± 5,24 mg/k Cyanua tự do* 120 ± 6,7 mg/kg 39 ± 5,54 mg/kg
14,7%, 2,29%, 2,07% [21]. Nhƣ vậy, bã sắn khô cũng là nguồn nguyên liệu nghèo dinh dƣỡng và do thời gian phơi nắng nhiều ngày nên hàm lƣợng ẩm giảm đi đồng thời hàm lƣợng cyanua cũng giảm đi dƣới tác dụng của ánh sáng mặt trời. Đây cũng là nguồn nguyên liệu dồi dào cho thức ăn gia súc và ngƣời nông dân thƣờng dự trữ nguồn nguyên liệu này cho mùa đông. Mặt khác, bã sắn tƣơi sau khi đƣợc tách ra từ quá trình làm tinh bột sắn thì không thể sử dụng hết ngay nên ngƣời nông dân thƣờng phơi khô để bảo quản và dự trữ.
3.3. Tuyển chủng lactic có khả năng khử cyanua tốt nhất
3.3.1. Khảo sát sự khử cyanua của vi khuẩn lactic từ các nguồn thực phẩm lên men lactic trên môi trường bã sắn
Kết quả khảo sát sự khử cyanua tổng số của vi khuẩn lactic từ các nguồn thực phẩm lên men lactic trên môi trƣờng bã sắn tƣơi đƣợc thể hiện ở Hình 3.6. Kết quả cho thấy: Sau 48 h lên men hàm lƣợng cyanua tổng số trong các mẫu bã sắn giảm đáng kể và hàm lƣợng cyanua tổng số trong mẫu bã sắn ủ với nguồn vi sinh giảm mạnh hơn mẫu bã sắn ủ tự nhiên không bổ sung nguồn vi sinh.
Hình 3.6: Hàm lƣợng cyanua trong các mẫu bã sắn tƣơi ủ với thực phẩm lên men lactic
Cụ thể là, hàm lƣợng cyanua tổng số trong nguyên liệu bã sắn tƣơi là 241 mg/kg khối lƣợng chất khô. Bã sắn ủ tự nhiên hàm lƣợng cyanua tổng số giảm xuống 213 mg/kg khối lƣợng chất khô. Bã sắn ủ với nguồn vi sinh hàm lƣợng cyanua tổng số giảm xuống thấp dao động từ 126 đến 168 mg/kg khối lƣợng chất khô. Nhƣ vậy, quá trình lên men chua làm giảm hàm lƣợng cyanua tổng số. Điều đó chứng tỏ rằng, các chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn lên men lactic phát triển thích hợp trên môi trƣờng bã sắn và có khả năng khử cyanua tổng số để tồn tại và phát triển. Đây chính là cơ sở để tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn lactic thích hợp trên môi trƣờng bã sắn nhằm khử hàm lƣợng cyanua tổng số của bã sắn đến mức an toàn cho vật nuôi.
3.3.2. Phân lập chủng lactic từ bã sắn lên men lactic có giảm cyanua tổng số
Phân lập vi khuẩn lactic trên môi trƣờng đặc trƣng MRS nhận đƣợc 27 chủng vi khuẩn lactic từ các mẫu bã sắn ủ với các nguồn lên men lactic, trong đó 10 chủng từ bã sắn ủ với kim chi chiếm 37%, 4 chủng từ bã sắn ủ với tôm chua chiếm 15%, 5 chủng từ bã sắn ủ với nem chua chiếm 19%, 3 chủng từ bã sắn ủ với dƣa chua chiếm 11%, 2 chủng từ bã sắn ủ với sữa chua chiếm 7%, 3 chủng từ bã sắn ủ tự nhiên chiếm 11%. Trong số tất cả các chủng vi khuẩn lactic đã phân lập những chủng vi khuẩn lactic có tốc độ phát triển mạnh sẽ đƣợc lựa chọn. Đặc điểm hình dạng của 8 chủng vi khuẩn lactic đƣợc lựa chọn thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Đặc điểm hình dạng của 8 chủng vi khuẩn lactic đƣợc lựa chọn
Nguồn gốc Chủng Hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào Chủng vi khuẩn lactic
do phòng thí nghiệm cung cấp
Lactobacillus
plantarum Tròn, trắng sữa. Trực khuẩn nhỏ, kết đôi
Lactobacillus acidophilus
Tròn, trắng đục, có
màng nhầy. Trực khuẩn, kết chuỗi Bã sắn ủ tự nhiên LB16 Nhỏ, tròn, trắng đục. Trực khuẩn ngắn, kết
chuỗi dài. Bã sắn ủ với kim chi LB2 To, tròn, bóng, màu
trắng sữa.
Trực khuẩn ngắn (mập), kết đôi, kết chuỗi
Bã sắn ủ với tôm chua LB5 Nhỏ, tròn, trắng sữa Trực khuẩn dài, kết chuỗi Bã sắn ủ với nem chua LB18 Tròn, trằng đục. Trực khuẩn, kết chuỗi Bã sắn ủ với dƣa chua LB23 Tròn, trắng sữa, trong Trực khuẩn đôi, kết chuỗi dài Bã sắn ủ với sữa chua LB27 Tròn, trằng sữa. Cầu khuẩn đôi, kết chuỗi
3.3.3. Đánh giá khả năng khử cyanua và tốc độ sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic được chọn trên môi trường bã sắn lactic được chọn trên môi trường bã sắn
Khả năng khử cyanua tổng số và chuyển hóa cyanua tự do của các chủng vi khuẩn lactic trên môi trƣờng bã sắn tƣơi sau 72 h ở 30 ± 2 o
C trong quá trình lên men đƣợc trình bày ở Hình 3.7
Hình 3.7: Khả năng khử cyanua tổng của các chủng vi khuẩn lactic
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu)
Kết quả này cho thấy, hàm lƣợng cyanua tổng và cyanua tự do giảm trong quá trình lên men so với nguyên liệu ban đầu lên đến 69%. Quá trình khử cyanua tổng trong quá trình lên men chính là sự cắt đứt mạch của hợp chất cyanua ở dạng liên kết (cyanua tổng số cyanua tự do) chủ yếu là linamarin, chiếm 80 đến 96% và cuối quá trình lên men không phải là sự hiện diện của hợp chất này mà sản phẩm là acetone cyanohydrin và acid cyanhydric, sau đó chúng sẽ đƣợc vi khuẩn chuyển hóa tạo thành CO2 và NH3. Hiệu suất của hai quá trình này tƣơng đƣơng nhau. Nhƣ vậy, tất cả các chủng vi khuẩn lactic đƣợc phân lập đều có khả năng sinh ra enzyme linamarase để phá vỡ liên kết của cyanogenic glucoside và chuyển hóa acid cyanhydric trong quá trình lên men.
Chủng Lactobacillus plantarum, LB2, LB5, LB18, LB23, LB27 có khả năng khử cyanua tƣơng đối tốt. Tuy nhiên, chủng LB2 có khả năng khử cyanua vƣợt trội nhất. Hàm lƣợng cyanua tổng và cyanua tự do trong bã sắn giảm còn 73,52 mg/kg và 32 mg/kg khối lƣợng chất khô. Cả hai chỉ tiêu này đều nằm trong giới hạn cho phép đối với thức ăn chăn nuôi, nhỏ hơn 100 mg/kg khối lƣợng chất khô.
Mặt khác, trên môi trƣờng bã sắn các chủng vi khuẩn lactic còn sinh trƣởng và phát triển mạnh (105
– 109 CFU/g). Mật độ tế bào vi khuẩn lactic của 8 chủng vi khuẩn lactic trên môi trƣờng dịch thể MRS và bã sắn tƣơi ở 30 ± 2 o
C tại các thời gian lên men khác nhau thể hiện ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Mật độ tế bào vi khuẩn lactic trên môi trƣờng bã sắn (CFU/g)
Chủng Dịch thể MRS
Lên men trên môi trƣờng bã sắn
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h Lactobacillus plantarum 4,5x10 9 2,0x107 1,2x109 1,4x109 1,8x109 1,8x109 1,5x109 Lactobacillus acidophilus 1,4x10 7 1,0x106 1,2x106 2,0x107 1,4x107 1,2x107 1,0x107 LB2 2,2x109 3,5x107 1,6x109 2,0x109 2,5x109 2,0x109 1,3x109 LB5 5,7x108 2,1x107 3,1x108 2,0x108 5,9x108 7,4x108 7,1x108 LB16 6,0x105 3,0x104 3,8x105 1,7x105 6,5x105 6,1x105 5,2x105 LB18 1,5x107 1,0x106 2,2x107 1,5x108 2,8x108 2,1x108 2,5x108 LB23 2,0x109 4,6x107 1,2x109 1,8x109 2,0x109 1,1x109 1,2x108 LB27 1,0x109 1,0x107 4,6x108 5,9x108 8,9x108 7,3x108 7,2x108
Các chủng vi khuẩn lactic đƣợc phân lập từ bã sắn ủ với thực phẩm lên men lactic có mật độ tế bào lớn hơn chủng lactic phân lập từ bã sắn ủ tự nhiên. Chủng vi khuẩn lactic có mật độ tế bào càng lớn thì khả năng sinh trƣởng và phát triển càng mạnh. Từ 24 h ÷ 72 h chủng lactic phát triển tăng nhanh về sinh khối và đạt cực đại, sau 72 h thì tốc độ phát triển bắt đầu suy yếu. Chủng LB2 là chủng không chỉ có khả