4. Nội dung nghiên cứu
3.7.1. Quytrìn hủ chua bã sắn tươi
Quy trình ủ chua bã sắn tƣơi sử dụng chế phẩm lactic LB2 đƣợc trình bày ở Hình 3.24.
Hình 3.24: Sơ đồ quy trình ủ chua bã sắn tƣơi sử dụng chế phẩm lactic LB2
Thời gian lên men (Giờ) Hàm lƣợng rỉ đƣờng % (w/w) Mật độ vi khuẩn lactic (CFU/g) Hàm lƣợng cyanua tổng số (mg/kg khối lƣợng khô) Giá trị tiên đoán 71,37 7,75 3,37 x 106 90
Giá trị thực nghiệm 71,37 7,75 3,37 x 106 95
Sản phẩm bã sắn lên men dùng trong chăn nuôi Bã sắn tƣơi Lên men ح = 72 h To = 30 ± 2 oC pH tự nhiên NaCl 0,5% (w/w) Rỉ đƣờng 7,75% (w/w) Chế phẩm (mật độ vi khuẩn lactic ≥ 2,6x 108 CFU/g): 1,3% (w/w)
3.7.2. Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu:
Bã sắn tƣơi đƣợc thu mua từ nhà máy chế biến sắn.
Rỉ đƣờng: đƣợc hấp 121 oC trong 15 phút để tránh nhiễm tạp.
Công đoạn lên men
Mục đích: ủ chua bã sắn tƣơi nhằm khử hàm lƣợng cyanua tổng xuống dƣới mức cho phép < 100 mg/kg khối lƣợng chất khô để sử dụng làm thức ăn cho gia súc. Tiến hành: bã sắn tƣơi đƣợc ủ kín với NaCl 0,5% (w/w), rỉ đƣờng 7,75% (w/w), chế phẩm (mật độ vi khuẩn lactic ≥ 2,6 x 108 CFU/g) 1,3% (w/w) ở nhiệt độ 30 ± 2 oC trong thời gian 72 h (3 ngày). Sau đó, sản phẩm đƣợc sử dụng làm thức ăn chăn nuôi.
3.8. Xác định hàm lƣợng cyanua bay hơi trong quá trình lên men:
Kết quả xác định hàm lƣợng cyanua trong quá trình lên men theo các thông số đã tối ƣu là 5,97 ± 0,12 mg/kg khối lƣợng chất khô, bằng 0,043% hàm lƣợng cyanua tổng đƣợc khử trong quá trình lên men. Chứng tỏ lƣợng cyanua bay hơi trong quá trình lên men là không đáng kể, ít ảnh hƣởng đến môi trƣờng và con ngƣời xung quanh. Tuy nhiên, cần có hệ thống hút khí cho khu vực ủ bã sắn, nhất là khi tiến hành ủ chua bã sắn với số lƣợng lớn.
3.9. Kết quả xác định các thông số xây dựng quy trình ủ chua bã sắn khô sử
dụng chế phẩm lactic LB2
3.9.1. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng khử cyanua của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men trình lên men
Hình 3.25: Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng khử cyanua tổngsố của vi khuẩn lactic
Tiến hành lên men có bổ sung bột đậu nành 5% (w/w), NaCl 0,5% (w/w), chế phẩm lactic (mật độ vi khuẩn lactic 106 CFU/g) vào bã sắn khô, bổ sung thêm nƣớc với các tỉ lệ khác nhau, tiến hành xác định độ ẩm và xác định hàm lƣợng cyanua tổng số còn lại trong bã sắn sau 48 h lên men. Kết quả đƣợc thể hiện trên Hình 3.25.
Dựa vào đồ thị ta thấy rằng hàm lƣợng cyanua tổng số cao nhất khi hàm lƣợng ẩm của bã sắn là 53% ứng với tỷ lệ (BSK+ĐN) : nƣớc là 1:1 và giảm dần khi hàm lƣợng ẩm tăng đến 82% ứng với tỷ lệ (BSK+ĐN) là 1:3,5. Ở độ ẩm 74% (1:2,5), 78% (1:3) và 82 % (1:3,5) thì hàm lƣợng cyanua tổng số không chênh lệch đáng kể. Nhƣ vậy, độ ẩm từ 74% trở lên thì vi khuẩn lactic phát triển tốt có khả năng khử cyanua tổng tốt (giảm 49%).
Kết luận: ta có thể chọn độ ẩm cho quá trình lên men bã sắn nằm trong khoảng này, tuy nhiên để tiết kiệm nước ta lựa chọn hàm lượng ẩm là 74% để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
3.9.2. Kết quả xác định chất bổ sung trong quy trình ủ chua bã sắn khô
Bã sắn khô đƣợc trộn với bột đậu nành 5% (w/w), NaCl 0,5% (w/w) và chế phẩm lactic (mật độ vi khuẩn lactic 106 CFU/g) phối trộn hỗn hợp này với nƣớc theo tỉ lệ 1:2,5 (ẩm 74%), sau đó tiến hành thí nghiệm 2.3.5.2. Kết quả đƣợc chỉ ra ở Hình 3.26.
Hình 3.26: Kết quả xác định chất bổ sung thích hợp trong quy trình ủ chua bã sắn khô
Nhìn vào đồ thị ta thấy, khi bổ sung các chất cám gạo và rỉ đƣờng vào quá trình lên men thì hàm lƣợng cyanua tổng và hàm lƣợng cyanua tự do giảm so với quá trình lên men bã sắn chỉ với chế phẩm lactic và bột đậu nành. Cụ thể, hàm lƣợng cyanua tổng trong nguyên liệu ban đầu là 78 ± 5,2 mg/kg khối lƣợng chất khô, bã sắn ủ với đậu nành hàm lƣợng cyanua tổng giảm là 40 ± 2,3 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 48%). Bã sắn ủ với bột đậu nành và cám gạo, hàm lƣợng cyanua tổng giảm xuống là 33 ± 2,6 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 57%). Bã sắn ủ với bột đậu nành và rỉ đƣờng, hàm lƣợng cyanua tổng giảm xuống là 23 ± 2,6 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 70%). Hàm lƣợng cyanua tự do so với nguyên liệu bã sắn khô ban đầu giảm mạnh từ 39 ± 4,5 mg/kg xuống 13 ± 2,1 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 66%). Điều này có thể đƣợc giải thích là do ngoài hàm lƣợng protein và dƣỡng chất đƣợc cung cấp từ bột đậu nành thì trong rỉ đƣờng có hàm lƣợng đƣờng khử tƣơng đối cao, giàu khoáng và các nguyên tố vi lƣợng làm tăng cƣờng khả năng khử cyanua tổng.
Kết luận: trong thí nghiệm này, rỉ đường là chất bổ sung được lựa chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
3.9.3. Kết quả xác định hàm lượng rỉ đường trong quy trình ủ chua bã sắn khô
ình 3.27: Kết quả xác định hàm lƣợng rỉ đƣờng thích hợp trong quy trình ủ chua bã sắn khô
Kết quả thăm dò hàm lƣợng rỉ đƣờng bổ sung vào bã sắn khô lên men đƣợc trình bày ở Hình 3.27. Dựa vào đồ thị ta thấy, hàm lƣợng cyanua tổng số và hàm lƣợng cyanua tự do có xu hƣớng giảm khi hàm lƣợng rỉ đƣờng tăng từ 1% ÷ 5%. Tại hàm lƣợngrỉ đƣờng 5% thì khả năng khử lớn nhất, hàm lƣợng cyanua tổng số là 22 ± 2,5 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 71%), hàm lƣợng cyanua tự do là 13 ± 3,4 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 66%). Khi hàm lƣợngrỉ đƣờng tăng lên 7% và 9% thì khả năng khử cyanua lại giảm đi, hàm lƣợng cyanua tổng số là 32 ± 3,1 mg/kg (giảm 58%) và 43± 4,2 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 50%). Do đó, cần bổ sung một lƣợng rỉ đƣờng thích hợp, nếu hàm lƣợng rỉ đƣờng quá cao sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn lactic hạn chế khả năng khử cyanua của vi khuẩn lactic.
Qua kết quả khảo sát ta chọn hàm lƣợngrỉ đƣờng cho quá trình tối ƣu công đoạn lên men là 3% đến 7%. Để đảm bảo tính kinh tế thì hàm lƣợng rỉ đƣờng 5% đƣợc chọn để thực hiện các thí nghiệm thăm dò tiếp theo.
3.9.4. Kết quả xác định mật độ vi khuẩn lactic LB2 trong quy trình ủ chua bã sắn khô
Đồ thị Hình 3.28 cho thấy rằng, so với nguyên liệu ban đầu ở mật độ vi khuẩn lactic 104 CFU/g, hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do còn lại trong bã sắn sau lên men lớn nhất 61 ± 3,9 mg/kg (giảm 21%) và 29 ± 3,3 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 22%).
Hình 3.28: Kết quả lựa chọn mật độ vi khuẩn lactic LB2 thích hợp trong quy trình ủ chua bã sắn khô
Ở mật độ vi khuẩn lactic 107
CFU/g, hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do là thấp nhất là 22 ± 2,6 mg/kg (giảm 71%), 13 ± 2,1 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 68%). Tuy nhiên giữa mật độ vi khuẩn lactic 106 CFU/g và mật độ 107 CFU/g thì hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do không có sự khác nhau về ý nghĩa thống kê. Khi tăng mật độ vi khuẩn lactic lên 108
CFU/g thì khả năng khử cyanua kém hơn.
Kết luận: Qua kết quả khảo sát ta chọn mật độ vi khuẩn lactic LB2 cho quá trình tối ưu công đoạn lên men là 105
CFU/g đến 107 CFU/g. Mật độ vi khuẩn lactic thích hợp là 106
CFU/g để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
3.9.5. Kết quả xác định thời gian và nhiệt độ lên men trong quy trình ủ chua bã sắn khô
Tiến hành lên men bã sắn khô ở các nhiệt độ khác nhau 24 ± 2 oC, 30 ± 2 oC và 36 ± 2 o
C trong khoảng thời gian 24 h ÷ 96 h để xác định nhiệt độ, thời gian lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic khử cyanua cao nhất tạo sự an toàn đối với gia súc khi làm thức ăn chăn nuôi và rút ngắn quá trình ủ. Kết quả đƣợc chỉ ra ở Hình 3.29, Hình 3.30 và Hình 3.31 cho thấy hàm lƣợng cyanua tổng số, cyanua tự do đều giảm dần theo sự tăng của thời gian và nhiệt độ.
Ở 24 ± 2 oC, hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do giảm dần theo thời gian lên men. Quá trình này diễn ra chậm, sau 72 h mới có sự giảm rõ rệt, hàm lƣợng cyanua tổng giảm mạnh hơn 43,5 ± 0,8 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 45%). Quá trình lên men này kéo dài đến 96 h thì hàm lƣợng cyanua tổng số giảm 55%. Nhƣ vậy, ở nhiệt độ 24 ± 2 oC thì khả năng sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactic chậm do đó hạn chế khả năng giải độc cynua trong bã sắn.
Ở 30 ± 2 o
C, quá trình khử cyanua tổng số và cyanua tự do diễn ra mạnh hơn so với ở nhiệt độ 24 ± 2 oC. Hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do giảm mạnh trong suốt quá trình lên men từ 78 ± 5,2 mg/kg đến 22 ± 4,5 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 72%) và từ 39 ± 4,5 đến 13 ± 1,4 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 67%, Hình 3.30). Hàm lƣợng cyanua tổng và hàm lƣợng cyanua tự do giảm nhanh trong 24 h đầu tiên, sau 48 h hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do không có sự thay đổi đáng kể. Điều này có thể đƣợc giải thích là do nhiệt độ lên men thích hợp với nhiệt độ hoạt động của vi sinh vật là tăng khả năng giải độc sắn.
Hình 3.29: Kết quả xác định thời gian lên men bã sắn khô ở nhiệt độ 24 ± 2 o
C
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu)
Hình 3.30: Kết quả xác định thời gian lên men bã sắn khô ở nhiệt độ 30 ± 2 o
C
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu)
Hình 3.31: Kết quả xác định thời gian lên men bã sắn kh ở nhiệt độ 36 ± 2 o
C
Ở 36 ± 2 o
C, hàm lƣợng cyanua tổng số và hàm lƣợng cyanua tự do giảm nhanh trong 24 h đầu tiên, 44 ± 3,5 mg/kg (giảm 44%) và 13 ± 2,8 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 39%). (Hình 3.31). Sau 48 h lên men hàm lƣợng cyanua tổng và cyanua tự do gần nhƣ không có sự thay đổi, 23 ± 0,7 mg/kg (giảm 71%), 13 ± 2,1 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 44%). Nhƣ vậy, ở nhiệt độ cao thì kích thích sự phát triển của vi khuẩn càng nhanh nhƣng nếu thời gian lên men kéo dài thì vi khuẩn lactic sẽ bị ức chế, tạo điều kiện thuận lợi cho các vi khuẩn bất lợi phát triển. Ví nhƣ:
Clostridia dƣới dạng bào tử và chỉ phát triển dƣới điều kiện yếm khí. Clostridia phân giải acid lactic tạo thành acid butyric làm tăng giá trị pH. Clostridia còn có khả năng phân giải protein thành acid lactic và acid butyric, amin và amoniac. Vi khuẩn
Enterobacteria thƣờng có số lƣợng rất ít. Chúng là những vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện và có khả năng phân giải đƣờng dễ tan để tạo ra axit acetic, ethanol và hydro.Chúng có khả năng khử cacboxyl và khử amin các axit amin, sản xuất ra một số lƣợng lớn amoniac. Những vi khuẩn không mong muốn là nguyên nhân làm kém chất lƣợng thức ăn lên men.
Nhƣ vậy, qua kết quả thăm dò thời gian lên men ở các nhiệt độ khác nhau cho thấy ở các nhiệt độ khác nhau thì khả năng khử cyanua của chủng LB2 khác nhau và tăng dần theo độ tăng của nhiệt độ và đến một lúc nào đó thời gian tăng lên thì khả năng khử cuanua không thay đổi. Nhƣ vậy, với kết quả này cho phép chúng ta lựa chọn thời gian và nhiệt độ thích hợp khi thời tiết thay đổi khác nhau. Đối với mùa đông ta có thể lựa chọn thời gian lên men ít nhất 96 h (4 ngày), mùa hè có thể lựa chọn thời gian lên men ít nhất là 48h (hai ngày). Lên men ở nhiệt độ 30 ± 2 oC đƣợc chọn để tiếp tục tiến hành thí nghiệm tối ƣu hóa.
3.10. Kết quả tối ƣu hóa quá trình ủ chua bã sắn khô sử dụng chế phẩm lactic LB2
Chế phẩm lactic LB2 (mật độ vi khuẩn lactic ≥ 2,6 x 108 CFU/g) đƣợc sử dụng trong quá trình tối ƣu hóa. Sự ảnh hƣởng của các yếu tố thời gian lên men (X1, giờ), hàm lƣợng rỉ đƣờng (X2, % w/w), mật độ vi khuẩn lactic LB2 (X3, CFU/g) lên quá trình lên men đƣợc xác định bằng cách sử dụng phần mền Box–Behneken. Các giá trị của hàm mục tiêu (hàm lƣợng cyanua tổng) trong quá trình lên men bã sắn khô cùng với các biến độc lập đƣợc chỉ ra ở Bảng 3.8.
Bảng 3.8: Hàm mục tiêu (cyanua tổng số) trong quá trình tối ƣu hóa với sự kết hợp của các biến độc lập đối với bã sắn khô lên men
STT Thời gian lên men (Giờ) Hàm lƣợng rỉ đƣờng % (w/w) Mật độ vi khuẩn lactic (CFU/g) Hàm lƣợng cyanua tổng số (mg/kg) 1 72.00 3 5,05 x 106 23,29 2 48 5 5,05 x 106 23,24 3 72 5 107 20,88 4 48 5 5,05 x 106 22,31 5 72 7 5,05 x 106 30,29 6 48 7 107 27,11 7 48 5 5,05 x 106 23,21 8 48 3 107 31,94 9 24 7 5,05 x 106 41,32 10 24 5 107 43,70 11 24 5 105 44,55 12 48 7 105 40,16 13 24 3 5,05 x 106 44,25 14 72 5 105 35,26 15 48 3 105 34,97
Mô hình đƣợc phân tích thống kê để giữ lại các hệ số có ý nghĩa (p < 0,05). Phƣơng trình hồi quy thể hiện mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng cyanua tổng số với ba biến:
Y2 = 22,92 – 8,39 X1 + 0,68 X2 – 4,41 X3 + 2,48 X1X2 – 4,13 X1X3
Bảng 3.9 : Bảng ANOVA thể hiện hàm lƣợng cyanua tổng số chịu ảnh hƣởng bởi các yếu tố thời gian lên men, hàm lƣợng rỉ đƣờng và mật độ vi khuẩn lactic trong
suốt quá trình lên men bã sắn khô
Theo ANOVA của hàm lƣợng cyanua tổng số đƣợc trình bày ở Bảng 3.9. Mô hình thu đƣợc có ý nghĩa với F-test ( p < 0,0001). Giá trị lack of fit” cho mô hình hồi quy bậc hai là không có ý nghĩa (p = 0,2783 > 0,05), chỉ ra rằng việc dự đoán hiệu quả của quá trình lên men khử cyanua tổng số là thích hợp dƣới bất kỳ sự tƣơng tác của Nguồn Tổng bình phƣơng Bậc tự do Trung bình bình phƣơng F P-value (prob> F) Model 1180,45 9 131,16 229,41 < 0,0001 significant Intercept 1 X1 562,80 1 562,80 984,36 < 0,0001 X2 3,69 1 3,69 6,45 0,0496 X3 155,85 1 155,85 272,59 < 0,0001 X1X2 24,65 1 24,65 43,12 0,0012 X1X3 68,31 1 68,31 119,48 0,0001 X2X3 30,36 1 30,36 53,10 0,0008 X12 166,24 1 166,24 290,76 < 0,0001 X22 98,21 1 98,21 171,78 < 0,0001 X32 120,70 1 120,70 133,00 < 0,0001 Residual 2,86 5 0,57
Lack of fit 2,30 3 0,77 2,75 0,2783 Not
significant R2 0,9976 Adj-R2 0,9932 Pred-R2 0,9678 Adeq- Precision 43,028
nhân tố nào. Hệ số tƣơng quan bội R2
= 0,9976 cho thấy giữa giá trị thực nghiệm và giá trị tiên đoán có mối tƣơng quan tốt, đồng thời cũng ngụ ý rằng mô hình toán học rất đáng tin cậy cho sự khử cyanua tổng số trong quá trình lên men lactic sử dụng chế phẩm lactic LB2. Giá trị Pred-R2 = 0,9678 gần với giá trị Adj-R2 = 0,9932 cho biết mô hình dự đoán là hợp lý để xây dựng quy trình ủ chua bã sắn khô làm giảm hàm lƣợng cyanua tổng số đến mức thấp nhất. Tất cả các biến độc lập đều có ảnh hƣởng đáng kể đến hàm lƣợng cyanua tổng (p < 0,05).
Mô hình đáp ứng bề mặt sử dụng các đƣờng tròn đồng mức để thể hiện mức độ ảnh hƣởng của sự tƣơng tác giữa các yếu tố làm giảm hàm lƣợng cyanua tổng số. Mỗi hình thể hiện sự ảnh hƣởng của hai biến lên quá trình lên men khi cố định biến còn lại. Các đƣờng tròn đồng mức thể hiện sự tƣơng tác giữa hai biến là đáng kể hay không đáng kể. Hình 3.32, thể hiện sự tƣơng tác giữa thời gian lên men và hàm lƣợng rỉ đƣờng là đáng kể. Các đƣờng tròn đồng tâm tạo thành hình elip thể hiện mức độ quan trọng của sự tƣơng tác giữa các biến tƣơng ứng. Nhìn vào đƣờng tròng đồng tâm ta thấy, với 5,05 x 106 CFU/g thì hàm lƣợng cyanua tổng số giảm nhanh từ thời gian lên men 40 h đến 68 h và hàm lƣợng rỉ đƣờng từ 3% ÷ 7%. Kéo dài thời gian và hàm lƣợng rỉ đƣờng tăng cao thì khả năng khử cyaua tổng có xu hƣớng giảm. Sự tƣơng tác giữa