4. Nội dung nghiên cứu
3.3.Tuyển chủng lactic có khả năng khử cyanua tốt nhất
3.3.1. Khảo sát sự khử cyanua của vi khuẩn lactic từ các nguồn thực phẩm lên men lactic trên môi trường bã sắn
Kết quả khảo sát sự khử cyanua tổng số của vi khuẩn lactic từ các nguồn thực phẩm lên men lactic trên môi trƣờng bã sắn tƣơi đƣợc thể hiện ở Hình 3.6. Kết quả cho thấy: Sau 48 h lên men hàm lƣợng cyanua tổng số trong các mẫu bã sắn giảm đáng kể và hàm lƣợng cyanua tổng số trong mẫu bã sắn ủ với nguồn vi sinh giảm mạnh hơn mẫu bã sắn ủ tự nhiên không bổ sung nguồn vi sinh.
Hình 3.6: Hàm lƣợng cyanua trong các mẫu bã sắn tƣơi ủ với thực phẩm lên men lactic
Cụ thể là, hàm lƣợng cyanua tổng số trong nguyên liệu bã sắn tƣơi là 241 mg/kg khối lƣợng chất khô. Bã sắn ủ tự nhiên hàm lƣợng cyanua tổng số giảm xuống 213 mg/kg khối lƣợng chất khô. Bã sắn ủ với nguồn vi sinh hàm lƣợng cyanua tổng số giảm xuống thấp dao động từ 126 đến 168 mg/kg khối lƣợng chất khô. Nhƣ vậy, quá trình lên men chua làm giảm hàm lƣợng cyanua tổng số. Điều đó chứng tỏ rằng, các chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn lên men lactic phát triển thích hợp trên môi trƣờng bã sắn và có khả năng khử cyanua tổng số để tồn tại và phát triển. Đây chính là cơ sở để tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn lactic thích hợp trên môi trƣờng bã sắn nhằm khử hàm lƣợng cyanua tổng số của bã sắn đến mức an toàn cho vật nuôi.
3.3.2. Phân lập chủng lactic từ bã sắn lên men lactic có giảm cyanua tổng số
Phân lập vi khuẩn lactic trên môi trƣờng đặc trƣng MRS nhận đƣợc 27 chủng vi khuẩn lactic từ các mẫu bã sắn ủ với các nguồn lên men lactic, trong đó 10 chủng từ bã sắn ủ với kim chi chiếm 37%, 4 chủng từ bã sắn ủ với tôm chua chiếm 15%, 5 chủng từ bã sắn ủ với nem chua chiếm 19%, 3 chủng từ bã sắn ủ với dƣa chua chiếm 11%, 2 chủng từ bã sắn ủ với sữa chua chiếm 7%, 3 chủng từ bã sắn ủ tự nhiên chiếm 11%. Trong số tất cả các chủng vi khuẩn lactic đã phân lập những chủng vi khuẩn lactic có tốc độ phát triển mạnh sẽ đƣợc lựa chọn. Đặc điểm hình dạng của 8 chủng vi khuẩn lactic đƣợc lựa chọn thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Đặc điểm hình dạng của 8 chủng vi khuẩn lactic đƣợc lựa chọn
Nguồn gốc Chủng Hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào Chủng vi khuẩn lactic
do phòng thí nghiệm cung cấp
Lactobacillus
plantarum Tròn, trắng sữa. Trực khuẩn nhỏ, kết đôi
Lactobacillus acidophilus
Tròn, trắng đục, có
màng nhầy. Trực khuẩn, kết chuỗi Bã sắn ủ tự nhiên LB16 Nhỏ, tròn, trắng đục. Trực khuẩn ngắn, kết
chuỗi dài. Bã sắn ủ với kim chi LB2 To, tròn, bóng, màu
trắng sữa.
Trực khuẩn ngắn (mập), kết đôi, kết chuỗi
Bã sắn ủ với tôm chua LB5 Nhỏ, tròn, trắng sữa Trực khuẩn dài, kết chuỗi Bã sắn ủ với nem chua LB18 Tròn, trằng đục. Trực khuẩn, kết chuỗi Bã sắn ủ với dƣa chua LB23 Tròn, trắng sữa, trong Trực khuẩn đôi, kết chuỗi dài Bã sắn ủ với sữa chua LB27 Tròn, trằng sữa. Cầu khuẩn đôi, kết chuỗi
3.3.3. Đánh giá khả năng khử cyanua và tốc độ sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic được chọn trên môi trường bã sắn lactic được chọn trên môi trường bã sắn
Khả năng khử cyanua tổng số và chuyển hóa cyanua tự do của các chủng vi khuẩn lactic trên môi trƣờng bã sắn tƣơi sau 72 h ở 30 ± 2 o
C trong quá trình lên men đƣợc trình bày ở Hình 3.7
Hình 3.7: Khả năng khử cyanua tổng của các chủng vi khuẩn lactic
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu)
Kết quả này cho thấy, hàm lƣợng cyanua tổng và cyanua tự do giảm trong quá trình lên men so với nguyên liệu ban đầu lên đến 69%. Quá trình khử cyanua tổng trong quá trình lên men chính là sự cắt đứt mạch của hợp chất cyanua ở dạng liên kết (cyanua tổng số cyanua tự do) chủ yếu là linamarin, chiếm 80 đến 96% và cuối quá trình lên men không phải là sự hiện diện của hợp chất này mà sản phẩm là acetone cyanohydrin và acid cyanhydric, sau đó chúng sẽ đƣợc vi khuẩn chuyển hóa tạo thành CO2 và NH3. Hiệu suất của hai quá trình này tƣơng đƣơng nhau. Nhƣ vậy, tất cả các chủng vi khuẩn lactic đƣợc phân lập đều có khả năng sinh ra enzyme linamarase để phá vỡ liên kết của cyanogenic glucoside và chuyển hóa acid cyanhydric trong quá trình lên men.
Chủng Lactobacillus plantarum, LB2, LB5, LB18, LB23, LB27 có khả năng khử cyanua tƣơng đối tốt. Tuy nhiên, chủng LB2 có khả năng khử cyanua vƣợt trội nhất. Hàm lƣợng cyanua tổng và cyanua tự do trong bã sắn giảm còn 73,52 mg/kg và 32 mg/kg khối lƣợng chất khô. Cả hai chỉ tiêu này đều nằm trong giới hạn cho phép đối với thức ăn chăn nuôi, nhỏ hơn 100 mg/kg khối lƣợng chất khô.
Mặt khác, trên môi trƣờng bã sắn các chủng vi khuẩn lactic còn sinh trƣởng và phát triển mạnh (105
– 109 CFU/g). Mật độ tế bào vi khuẩn lactic của 8 chủng vi khuẩn lactic trên môi trƣờng dịch thể MRS và bã sắn tƣơi ở 30 ± 2 o
C tại các thời gian lên men khác nhau thể hiện ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Mật độ tế bào vi khuẩn lactic trên môi trƣờng bã sắn (CFU/g)
Chủng Dịch thể MRS
Lên men trên môi trƣờng bã sắn
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h Lactobacillus plantarum 4,5x10 9 2,0x107 1,2x109 1,4x109 1,8x109 1,8x109 1,5x109 Lactobacillus acidophilus 1,4x10 7 1,0x106 1,2x106 2,0x107 1,4x107 1,2x107 1,0x107 LB2 2,2x109 3,5x107 1,6x109 2,0x109 2,5x109 2,0x109 1,3x109 LB5 5,7x108 2,1x107 3,1x108 2,0x108 5,9x108 7,4x108 7,1x108 LB16 6,0x105 3,0x104 3,8x105 1,7x105 6,5x105 6,1x105 5,2x105 LB18 1,5x107 1,0x106 2,2x107 1,5x108 2,8x108 2,1x108 2,5x108 LB23 2,0x109 4,6x107 1,2x109 1,8x109 2,0x109 1,1x109 1,2x108 LB27 1,0x109 1,0x107 4,6x108 5,9x108 8,9x108 7,3x108 7,2x108
Các chủng vi khuẩn lactic đƣợc phân lập từ bã sắn ủ với thực phẩm lên men lactic có mật độ tế bào lớn hơn chủng lactic phân lập từ bã sắn ủ tự nhiên. Chủng vi khuẩn lactic có mật độ tế bào càng lớn thì khả năng sinh trƣởng và phát triển càng mạnh. Từ 24 h ÷ 72 h chủng lactic phát triển tăng nhanh về sinh khối và đạt cực đại, sau 72 h thì tốc độ phát triển bắt đầu suy yếu. Chủng LB2 là chủng không chỉ có khả năng khử cyanua tổng tốt nhất mà còn là chủng có tốc độ phát triển mạnh và ổn định nhất trên môi trƣờng bã sắn. Vì thế, chủng LB2 là chủng đƣợc lựa chọn.
3.3.4. Sự chuyển hóa cyanua trong tế bào vi khuẩn lactic
LB2 đƣợc lựa chọn để thực hiện thí nghiệm đánh giá sự chuyển hóa cyanua trong tế bào vi khuẩn lactic. Trƣớc khi phá vỡ tế bào vi khuẩn lactic, hàm lƣợng HCN trong MRS lỏng là 113,5 µg. Tiến hành phá vỡ tế bào sau khi nuôi tăng sinh chủng LB2 ở 30 ± 2 o
C trong 24 h thì hàm lƣợng HCN trong tế bào là 0 µg. Điều đó chứng tỏ rằng, cyanua trong môi trƣờng tăng sinh đã đƣợc vi khuẩn lactic chuyển hóa thành CO2, NH3 và glucose trong suốt quá trình lên men và bên trong tế bào vi khuẩn lactic không còn cyanua. Vì vậy, việc sử dụng vi khuẩn lactic trong quá trình giải độc sản phẩm sắn là an toàn và hợp lí.
3.3.5. Kết quả định danh sinh học phân tử
Chủng vi khuẩn LB2 bắt màu gram dƣơng trên tiêu bản nhuộm gram, catalase âm tính, trực khuẩn, không sinh bào tử.
Hình 3.8: Chủng lactic LB2 Hình 3.9: Tiêu bản nhuộm Gram chủng LB2
Kết quả giải trình tự gen 16S của loài LB2 có kết quả nhƣ sau:
AGAGTTTGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCCGGCGGTGTGCCTAAT ACATGCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGA TTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAA CCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCAT AACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGGTGGCTTCTCGCTATCAC TTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACC AAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGAC TGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCAC AATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTC
GGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTC ATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTA CGTGC
Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH nhƣ sau:
Kết quả tra cứu giải trình tự gen chỉ ra rằng chủng vi khuẩn này có mức độ tƣơng đồng với Lactobacillus plantarum đạt 100%.
Xác định chủng LB2 là Lactobacillus plantarum.
3.4. Sản xuất chế phẩm lactic LB2
Chủng vi khuẩn lactic LB2 sau khi đƣợc định danh phân tử xác định là
Lactobacillus plantarum sẽ đƣợc ứng dụng để sản xuất chế phẩm lactic LB2.
3.4.1. Các thông số thích hợp trong quy trình sản xuất chế phẩm lactic LB2
3.4.1.1. Tỉ lệ đậu nành và bã sắn
Chủng vi khuẩn lactic LB2 (Lactobacillus plantarum) đƣợc nhân giống cấp 1 trên môi trƣờng MRS lỏng trong 48 h ở 30 ± 2 o
C có mật độ tế bào là 5,8 x 108 CFU/g (8,76 Log(CFU/g)).
Đậu nành ngâm (50 g), bóc vỏ, xay và cân lại thu đƣợc 125 g, sau đó tiến hành thí nghiệm 2.3.3.1. Kết quả xác định tỉ lệ đậu nành – bã sắn đƣợc chỉ ra ở Hình 3.10.
Hình 3.10: Kết quả xác định tỉ lệ đậu nành/bã sắn
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu)
Dựa vào đồ thị ta thấy, sau 48 h nhân giống ở 30 ± 2 oC tại tỉ lệ đậu nành/bã sắn là 3/4 có mật độ vi khuẩn lactic LB2 tăng nhẹ nhất là 5,72 log(CFU/g), tăng lớn nhất là 9,51 log(CFU/g) khi tỉ lệ đậu nành/bã sắn là 3/7. Tiếp tục tăng tỉ lệ này lên cao ( 3/8, 3/9) thì mật độ vi khuẩn lactic có xu hƣớng giảm dần. Nhƣ vậy, việc bổ sung đậu nành ngâm xay thích hợp cho quá trình nhân giống vi khuẩn lactic LB2 tăng sinh khối bởi bã sắn nghèo dinh dƣỡng, hàm lƣợng protein, lipid, khoáng thấp. Trong khi đó đậu nành là chất giàu dinh dƣỡng, đậu nành đứng đầu các loại thực phẩm về hàm lƣợng protein đồng thời chứa đầy đủ các acid amin không thay thế. Hàm lƣợng protein trung bình 38 ÷ 42%, protein đậu nành dễ tiêu hóa hơn so với các loại khác. Ngoài ra, đậu nành có hàm lƣợng lipid cao 18 ÷ 20% chứa tỷ lệ cao các acid béo chƣa no có hệ số đồng hóa cao và giàu vitamin và khoáng chất (5%). Do đó, việc bổ sung đậu nành vào quá trình nhân giống chủng lactic là cần thiết. Tuy nhiên, tỉ lệ đậu nành/bã sắn phải cân đối, nếu đậu nành bổ sung nhiều hay lƣợng bã sắn nhiều sẽ làm hạn chế khả năng sinh trƣởng của chủng lactic.
Kết luận: trong thí nghiệm này tỉ lệ đậu nành/bã sắn là 3/7 được lựa chọn.
3.4.1.2. Hàm lƣợng ẩm của bã sắn
Kết quả xác định hàm lƣợng ẩm của môi trƣờng lên men (đậu nành/bã sắn) đƣợc trình bày ở Hình 3.11.
Hình 3.11: Kết quả xác định hàm lƣợng ẩm của bã sắn
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu)
Kết quả chỉ ra rằng, hàm lƣợng ẩm tăng lên khi lƣợng nƣớc bổ sung tăng, đồng thời mật độ vi khuẩn lactic cũng tăng. Tuy nhiên nếu bổ sung lƣợng nƣớc quá nhiều thì hàm lƣợng ẩm tăng nhƣng đồng thời mật độ vi khuẩn lactic không tăng mà giảm xuống. Cụ thể là, tỉ lệ (đậu nành/bã sắn) : nƣớc là 2:0,5, độ ẩm 64% và mật độ vi khuẩn tăng lên 4,99 log(CFU/g). Khi tăng tỉ lệ này lên 2:1,5 thì hàm lƣợng ẩm đạt 74%, mật độ vi khuẩn cao nhất là 9,51 log(CFU/g). Tiếp tục tăng tỉ lệ này lên 2:2, 2:2,5 thì độ ẩm và mật độ vi khuẩn lần lƣợt là 78%, 82% và 9,35 log(CFU/g), 8,72 log(CFU/g). Ở những độ ẩm cao 78%, 82%, đây là độ ẩm thông thƣờng khi lên men lactic nhƣng mật độ vi khuẩn lại thấp. Điều này chứng tỏ rằng, hàm lƣợng ẩm cao thì không nhất thiết mật độ vi khuẩn cao.
Kết luận: độ ẩm được lựa chọn là 74% cho thí nghiệm tiếp theo. Ngoài ra, kết quả này còn chỉ cho chúng ta thấy rằng, vi khuẩn lactic Lactobacillus plantarum được phân lập từ kim chi không chỉ phát triển tốt trên môi trường ẩm ướt mà nó còn phát triển rất tốt trên môi trường khô hơn. Đây cũng là một ưu điểm đáng chú ý của chủng giống này.
3.4.1.3. Thời gian nhân giống
Hình 3.12: Kết quả xác định thời gian nhân giống
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu)
Chủng vi khuẩn lactic LB2 đƣợc nuôi cấy ở điều kiện 30 ± 2 oC, tỉ lệ đậu nành/bã sắn là 3/7, hàm lƣợng ẩm 74% trong các thời gian khác nhau từ 24 h ÷ 96 h. Kết quả đƣợc chỉ ra ở Hình 3.12. Mật độ vi khuẩn lactic có xu hƣớng tăng nhanh khi thời gian nhân giống tăng lên 48 h (9,51 log(CFU/g)) và có xu hƣớng giảm khi thời gian kéo dài lên 72 h và 96 h. Điều này có thể xuất phát từ nguyên nhân khi thời gian kéo dài thì lƣợng acid sinh ra nhiều làm giảm pH môi trƣờng nuôi cấy dẫn đến ức chế sự sinh trƣởng của chính vi khuẩn lactic và khi thời gian kéo dài thì vi khuẩn bắt đầu bƣớc sang giai đoạn suy thoái.
3.4.2. Đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm lactic LB2 theo các thông số đã lựa chọn 3.4.2.1. Quy trình sản xuất chế phẩm lactic LB2 3.4.2.1. Quy trình sản xuất chế phẩm lactic LB2
Quy trình sản xuất chế phẩm lactic LB2 đƣợc tóm tắt ở sơ đồ Hình 3.13
Hình 3.13: Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm lactic LB2
3.4.2.2. Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu: Bã sắn khô đƣợc nghiền nhỏ, độ ẩm < 14 %. [12] Đậu nành có độ ẩm 10 ÷ 14%. [12] Hàm lƣợng vi khuẩn lactic 10% (v/w) Kiểm tra mật độ vi khuẩn lactic LB2 Hàm lƣợng ẩm 74% Lactobacillus plantarum Nhân giống cấp1 (MRS, 48 h, 30 ± 2 oC) Đậu nành/bã sắn (3/7) ح = 48 h To= 30 ± 2 oC pH tự nhiên Trộn với chất mang (bột đậu nành) Nhân giống cấp 2 Bao gói Hút chân không (80%) Bảo quản Chế phẩm lactic LB2 Sấy lạnh
Nhân giống cấp 1:
Mục đích: tăng sinh khối tế bào cho quá trình nhân giống cấp 2 và xác định mật độ vi khuẩn lactic.
Tiến hành: chủng Lactobacillus plantarum đƣợc nuôi cấy trong 100 ml môi trƣờng MRS trong 24 h ở 30 ± 2 o
C. Sau đó, định lƣợng mật độ vi khuẩn lactic và tiến hành nhân giống cấp 2 trên môi trƣờng bã sắn.
Nhân giống cấp 2:
Mục đích: tạo ra chế phẩm lactic LB2 tốt có mật độ tế bào lớn nhất, có tính ổn định, phát triển tốt trên môi trƣờng bã sắn và chủng này có khả năng lên men tốt bã sắn nhằm khử đƣợc hàm lƣợng cyanua tổng đến mức thấp nhất.
Tiến hành: 50 g đậu nành sau khi đƣợc ngâm, bóc vỏ và xay sẽ đem đi phối trộn với bã sắn ở tỉ lệ là 3/7. Sau đó bổ sung nƣớc vào hỗn hợp này với tỉ lệ (đậu nành/bã sắn) : nƣớc là 2,5:1 và 10% (v/w) hàm lƣợng vi khuẩn Lactobacillus plantarum đã đƣợc nhân giống cấp 1. Tiến hành nhân giống trong 48 h ở 30 ± 2 o
C, pH tự nhiên.
Sấy lạnh:
Mục đích: tạo tính ổn định cho chế phẩm và bảo quản dễ dàng.
Tiến hành: sau khi nhân giống cấp 2, bán thành phẩm sẽ đƣợc tiến hành sấy lạnh ở nhiệt độ 30 oC trong thời gian 6 h.
Trộn với chất mang:
Mục đích: thuận lợi cho quá trình bảo quản, vận chuyển và sử dụng.
Tiến hành: chất mang đƣợc sử dụng ở đây là bột đậu nành đã sấy khô dƣới < 14%, sau đó đem xay bằng máy xay sinh tố, để nguội và tiếp tục sấy trong 3 giờ. Sau khi bán thành phẩm đƣợc sấy lạnh, sẽ đƣợc phối trộn với bột đậu nành theo tỉ lệ 1:2 thu đƣợc chế phẩm lactic LB2.
Bao gói, hút chân không:
Mục đích: kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm.
Tiến hành: chế phẩm lactic LB2 sẽ đƣợc bao gói trong bao PA, 100g/gói và hút chân không 80%.
Bảo quản:
Mục đích: bảo quản chế phẩm lactic LB2.
3.4.3. Chế độ bảo quản chế phẩm lactic LB2
Chế phẩm lactic LB2 sau khi đƣợc sản xuất theo quy trình ở 3.4.2 có mật độ vi khuẩn lactic là 3,5 x 108 CFU/g đƣợc tiến hành bảo quản lạnh ở 4 oC theo thời gian (Δ ح = 1 tuần). Kết quả bảo quản đƣợc trình bày ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4: Mật độ vi khuẩn lactic trong chế phẩm theo thời gian bảo quản
Thời gian bảo quản Mật độ vi khuẩn lactic LB2 (CFU/g) 1 tuần 3,5 x 108 2 tuần 3,3 x 108 3 tuần 3,0 x 108 4 tuần 2,8 x 108 5 tuần 2,8 x 108 6 tuần 2,7 x 108 7 tuần 2,6 x 108 8 tuần 2,6 x 108
Nhƣ vậy, qua 4 ÷ 8 tuần bảo quản chế phẩm lactic LB2 thì mật độ vi khuẩn lactic trong chế phẩm thay đổi không đáng kể so với mật độ ban đầu, điều đó chứng tỏ rằng chế phẩm lactic LB2 có tính ổn định cao. Do đó, chế phẩm lactic LB2 sau khi sản xuất đƣợc bảo quản lạnh để sử dụng trong thời hạn hai tháng.